CN105964685B - 一种利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法。该利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法，包括相隔一定距离有序埋设于石油污染土壤内的若干条石油降解贴，以及设于石油污染土壤外侧的换气装置；所述石油降解贴包括短纤土工布层和长丝土工布层，在短纤土工布层和长丝土工布层之间通过针刺方式固定有石油降解固态菌剂层。该利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法，解决了传统方式中将固体石油降解菌剂直接投入到受污染土壤中会因土壤隔离作用而使微生物整体的代谢能力下降的问题。在石油污染土壤修复完成后，由于短纤土工布层和长丝土工布层的保护，中间的固体石油降解菌剂层能保持完整，方便回收利用，节约了处理成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法。
背景技术
原油在加工、使用及运输过程中容易造成溢洒或泄漏事故，导致石油进入土壤等环境中造成土壤的环境污染。石油是由多种烃类和少量非烃化合物组成的复杂混合物，在土壤环境中很难被降解。国内外处理石油污染的方法主要有物理、化学、生物三类方法，物理、化学方法存在处理成本高、处理不彻底的问题，而微生物修复方法因其经济有效、无二次污染等优点而被广泛研究。传统的微生物处理石油污染土壤方法中，大都是以从石油污染土壤中筛选的石油降解菌为基础，采用麦麸和草炭为固态培养的营养源和载体，简单的混合制成固态微生物菌剂，然后将固态微生物菌剂直接粗犷的投入到受污染土壤中，利用微生物的生长代谢将污染物去除，其不足是：将固态微生物菌剂直接投入到受污染土壤中会因土壤的隔离作用使微生物整体的代谢能力下降，就不得不再增加微生物菌剂的用量，另外在石油污染土壤修复完成后，微生物菌剂往往存留在土壤中无法回收，使得处理成本进一步提升。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种设计合理、减少石油降解菌剂的用量、石油烃降解率高、石油降解菌可重复回收利用、降低处理成本的利用微生物处理石油污染土壤的装置及方法，解决了现有技术中存在的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用微生物处理石油污染土壤的装置，包括相隔一定距离均匀有序的 埋设于石油污染土壤内的若干条石油降解贴以及促进石油污染土壤内空气流通的换气装置，所述石油降解贴包括短纤土工布层和长丝土工布层，在短纤土工布层和长丝土工布层之间通过针刺方式固定有石油降解固态菌剂层。
所述石油降解贴横向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴之间的竖直距离为14-16cm，最顶层及最底层石油降解贴距离石油污染土壤表面及底面的距离为4-6cm。
所述石油降解贴竖向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴之间的水平距离为48-52cm，最顶层及最底层石油降解贴的端部距离石油污染土壤表面及底面的距离为4-6cm。
所述石油降解固态菌剂层的厚度为2cm，短纤土工布层和长丝土工布层每平方米的重量均为200g/m2。
所述每组换气装置包括两注气泵，注气泵的出气口分别与一注气管道相连，注气管道的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d。
所述换气装置包括一注气泵和一抽气泵，所述注气泵和抽气泵的出气口和抽气口分别与一注气管道和一抽气管道相连，注气管道和抽气管道的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d。
在注气管道的末端开口处包裹有钢丝网，在钢丝网的外侧包裹有一层无纺土工布，所述钢丝网的孔径为100目。
在注气管道和抽气管道的末端开口处包裹有钢丝网，在钢丝网的外侧包裹有一层无纺土工布，所述钢丝网的孔径为100目。
所述石油降解固态菌剂贴的制备方法包括如下步骤：
(1)采集石油降解菌菌源：取作为石油降解菌菌源的石油污染土样2g，接入装有100mL无菌水的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d，得石油降解菌菌源；
(2)富集培养石油降解菌：取步骤(1)中培养得到的10mL石油降解菌菌源接入装有100mL原油培养基的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d，重复操作三次得到以石油为唯一碳源的石油降解菌富集培养液；所述原油培养基的成分为：(NH4)2SO4为5g，KCl为1.1g，NaCl为5g，FeSO4·7H2O为0.028g，KH2PO4为1.5g，K2HPO4为1.5g，MgSO4·7H2O为0.5g，ZnSO4·7H2O为0.29g，CaCl2为0.24g，CuSO4·5H2O为0.25g，蒸馏水为1L，原油为10g，pH为7.2，在121℃灭菌20min；
(3)分离和纯化石油降解菌：用接种环蘸取步骤(2)得到的富集培养液于平板培养基上划线，于30℃下培养7d，重复多次划线，直到分离得各纯化菌株；将纯化菌株于30℃下试管斜面培养7d，得石油降解菌菌悬液；所述平板培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min，试管斜面培养培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(4)复筛石油降解菌：称取含油土样50g，溶于100mL复筛培养基中配成泥浆，盛于三角瓶中，将步骤(3)制得的2mL菌悬液接种于泥浆中，各纯化菌种均做3个平行样，包含加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照，在30℃、160r·min-1条件下于摇床中培养，每2d取1次样，测泥浆中的石油烃含量，直至石油烃含量不再有明显变化时，测定泥浆中石油烃的降解率，得降解率最高的高效石油降解菌，将高效石油降解菌接入试管斜面培养基4℃保存，备用；所述复筛培养基的成分为：(NH4)2SO4为5g；KCl为1.1g；NaCl为5g；FeSO4·7H2O 为0.028g；KH2PO4为1.5g；K2HPO4为1.5g；MgSO4·7H2O为0.5g；ZnSO4·7H2O为0.29g；CaCl2为0.24g；CuSO4·5H2O为0.25g蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；斜面培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(5)菌种活化：取步骤(4)制得的高效石油降解菌一环，在固体培养基上划线后于30℃培养箱中倒置培养1-2d，长出单菌落后挑取单菌落再接入固体培养基上培养24h，得高效石油降解菌活化菌种；所述固体培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(6)种子培养：取步骤(5)制得的活化菌种一环，接入种子培养基，于30℃、160r/min条件下，振荡培养12h，得高效石油降解菌种子培养液；所述种子培养基的成分为：蛋白胨为5g，酵母膏为3g，NaCl为5g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(7)液体扩大培养：取步骤(6)制得的种子培养液接入到扩大培养基中，于30℃、160r/min条件下，振荡培养4-10h，得高效石油降解菌扩大培养液；所述扩大培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(8)高效石油降解菌的正交实验：取步骤(7)制得的高效石油降解菌结合单一纯种菌株降解石油效果实验，分别选取四种石油降解率较高的菌种以其接种量作为自变量，以石油降解率为应变量设计四因素三水平的正交实验，通过正交实验获得最优配比；
(9)固态培养制作石油降解固态菌剂：取步骤(8)中培养到对数期的各菌种最优配比的扩大培养液，按体积比10％接种量接入固态培养基后搅拌均匀， 用八层纱布包扎培养皿口，于恒温培养箱中30℃静置培养1-2d，得石油降解固态菌剂；所述固态培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(10)制作石油降解固态菌剂贴：
将步骤(9)制得的石油降解固态菌剂均匀的铺撒在短纤土工布和长丝土工布之间，使用针刺机反复进行穿刺固定，即得石油降解固态菌剂贴。
使用上述利用微生物处理石油污染土壤的装置处理石油污染土壤的方法，采用如下步骤：
(1)将需要处理的石油污染土壤经风干、散碎、过10目筛，调节土壤的pH值为7.0-7.5，在室温下将上述利用微生物处理石油污染土壤的装置布置在石油污染土壤中；
(2)启动换气装置，间歇的向石油污染土壤进行注气或抽气，间歇时间为8小时，对石油污染土壤进行处理，测土壤中的石油烃含量，直至土壤中石油烃含量不再有明显变化，关闭换气装置即可。
本发明的有益效果是：
(1)将石油降解固态菌剂层固定在短纤土工布层和长丝土工布层之间以后再埋设于石油污染土壤中，解决了传统方式中将石油降解固态菌剂直接投入到受污染土壤中会因土壤隔离作用而使微生物整体的代谢能力下降的问题，不再需要大量增加石油降解菌剂的用量。
(2)在石油污染土壤修复完成后，由于短纤土工布层和长丝土工布层的保护，中间的石油降解固态菌剂层能保持完整，方便回收利用，节约了处理成本。
(3)换气装置使石油污染土壤内的空气流动，不仅促进了石油污染土壤内烃类或非烃类有机物的迁移，加速石油降解菌剂对污染物的降解，而且空气流 流动同时为石油降解菌剂提供代谢所需的氧气，提高石油降解菌剂的活性，达到对石油污染土壤修复的目的。
(4)所选用的短纤土工布层和长丝土工布层强力高，在干湿状态下都能保持充分的强力和伸长；耐腐蚀，在不同的酸碱度的石油污染土壤中能长久耐腐蚀；透水性透气性好，有利于中间的石油降解固态菌剂层与石油污染土壤中的污染物充分接触分解；抗微生物性好，不易受微生物、虫蛀损害。
(5)所制得的石油降解菌剂为几种石油降解菌种的混合，通过优势降解菌种的优势以及各微生物菌群在代谢过程中的协同作用，充分降解石油烃。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例1的结构示意图；
图2为本发明实施例2的结构示意图；
图3为本发明石油降解贴的结构示意图；
图4为图1中A部的放大结构示意图。
图中，1、石油降解贴，2、短纤土工布层，3、长丝土工布层，4、石油降解固态菌剂层，5、注气泵，6、注气管道，7、抽气泵，8、抽气管道，9、钢丝网，10、无纺土工布。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。
实施例1：
如图1和图3-图4中所示，该实施例包括相隔一定距离均匀有序的埋设于石油污染土壤内的若干条石油降解贴以及促进石油污染土壤内空气流通的换气 装置，所述石油降解贴1包括短纤土工布层2和长丝土工布层3，在短纤土工布层2和长丝土工布层3之间通过针刺方式固定有石油降解固态菌剂层4。
所述石油降解贴1横向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴1之间的竖直距离为15cm，最顶层及最底层石油降解贴1距离石油污染土壤表面及底面的距离为5cm。
所述石油降解固态菌剂层的厚度为2cm，短纤土工布层和长丝土工布层每平方米的重量均为200g/m2。
所述每组换气装置包括两注气泵5，注气泵5的出气口分别与一注气管道6相连，注气管道6的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d。
在注气管道的末端开口处包裹有钢丝网，在钢丝网的外侧包裹有一层无纺土工布，所述钢丝网的孔径为100目。钢丝网9和无纺土工布10能防止杂质进入注气管道6，对注气泵5起保护作用。
所述石油降解固态菌剂贴的制备方法包括如下步骤：
(1)采集石油降解菌菌源：取作为石油降解菌菌源的石油污染土样2g，接入装有100mL无菌水的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d，得石油降解菌菌源；
(2)富集培养石油降解菌：取步骤(1)中培养得到的10mL石油降解菌菌源接入装有100mL原油培养基的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d，重复操作三次得到以石油为唯一碳源的石油降解菌富集培养液；所述原油培养基的成分为：(NH4)2SO4为5g，KCl为1.1g，NaCl为5g，FeSO4·7H2O为0.028g，KH2PO4为1.5g，K2HPO4为1.5g，MgSO4·7H2O为0.5g，ZnSO4·7H2O为0.29g，CaCl2为0.24g，CuSO4·5H2O为0.25g，蒸馏水为1L，原油为10g，pH 为7.2，在121℃灭菌20min；
(3)分离和纯化石油降解菌：用接种环蘸取步骤(2)得到的富集培养液于平板培养基上划线，于30℃下培养7d，重复多次划线，直到分离得各纯化菌株；将纯化菌株于30℃下试管斜面培养7d，得石油降解菌菌悬液；所述平板培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min，试管斜面培养培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(4)复筛石油降解菌：称取含油土样50g，溶于100mL复筛培养基中配成泥浆，盛于三角瓶中，将步骤(3)制得的2mL菌悬液接种于泥浆中，各纯化菌种均做3个平行样，包含加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照，在30℃、160r·min-1条件下于摇床中培养，每2d取1次样，测泥浆中的石油烃含量，直至石油烃含量不再有明显变化时，测定泥浆中石油烃的降解率，得降解率最高的高效石油降解菌，将高效石油降解菌接入试管斜面培养基4℃保存，备用；所述复筛培养基的成分为：(NH4)2SO4为5g；KCl为1.1g；NaCl为5g；FeSO4·7H2O为0.028g；KH2PO4为1.5g；K2HPO4为1.5g；MgSO4·7H2O为0.5g；ZnSO4·7H2O为0.29g；CaCl2为0.24g；CuSO4·5H2O为0.25g蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；斜面培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(5)菌种活化：取步骤(4)制得的高效石油降解菌一环，在固体培养基上划线后于30℃培养箱中倒置培养1-2d，长出单菌落后挑取单菌落再接入固体培养基上培养24h，得高效石油降解菌活化菌种；所述固体培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(6)种子培养：取步骤(5)制得的活化菌种一环，接入种子培养基，于30℃、160r/min条件下，振荡培养12h，得高效石油降解菌种子培养液；所述种子培养基的成分为：蛋白胨为5g，酵母膏为3g，NaCl为5g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(7)液体扩大培养：取步骤(6)制得的种子培养液接入到扩大培养基中，于30℃、160r/min条件下，振荡培养4-10h，得高效石油降解菌扩大培养液；所述扩大培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(8)高效石油降解菌的正交实验：取步骤(7)制得的高效石油降解菌结合单一纯种菌株降解石油效果实验，分别选取四种石油降解率较高的菌种以其接种量作为自变量，以石油降解率为应变量设计四因素三水平的正交实验，通过正交实验获得最优配比；
(9)固态培养制作石油降解固态菌剂：取步骤(8)中培养到对数期的各菌种最优配比的扩大培养液，按体积比10％接种量接入固态培养基后搅拌均匀，用八层纱布包扎培养皿口，于恒温培养箱中30℃静置培养1-2d，得石油降解固态菌剂；所述固态培养基的成分为：蛋白胨为10g，酵母膏为5g，NaCl为10g，琼脂为15g，蒸馏水为1L，pH为7.2,在121℃灭菌20min；
(10)制作石油降解固态菌剂贴：
将步骤(9)制得的石油降解固态菌剂均匀的铺撒在短纤土工布和长丝土工布之间，使用针刺机反复进行穿刺固定，即得石油降解固态菌剂贴。
使用上述利用微生物处理石油污染土壤的装置处理石油污染土壤的方法，采用如下步骤：
(1)将需要处理的石油污染土壤经风干、散碎、过10目筛，调节土壤的 pH值为7.0-7.5，在室温下将上述利用微生物处理石油污染土壤的装置布置在石油污染土壤中；
(2)启动换气装置，采用注气泵5间歇的向石油污染土壤进行注气，中间间歇时间为8小时,目的是为满足微生物降解有机物所需的时间，减少过量通气造成微生物降解效率的下降以及降低无效成本。注气泵5注入的空气流沿垂直于石油降解贴1的方向从下往上依次穿过间隔的石油污染土壤和石油降解贴1，并从石油污染土壤表面排出进入到大气中。空气流携带的烃类或非烃类石油污染物在依次通过短纤土工布2、石油降解固态菌剂层4、长丝土工布3时，被中间的石油降解固态菌剂层4降解代谢。测量土壤中的石油烃含量，直至土壤中石油烃含量不再有明显变化，关闭换气装置即可。经监测计算，石油污染土壤中石油烃的降解率大于75％。
实施例2：如图2所示，本实施例与实施例1的不同之处在于：
所述石油降解贴1竖向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴1之间的水平距离为50cm，最顶层及最底层石油降解贴1的端部距离石油污染土壤表面及底面的距离为5cm。
所述换气装置包括一注气泵5和一抽气泵7，所述注气泵5和抽气泵7的出气口和抽气口分别与一注气管道6和一抽气管道8相连，注气管道6和抽气管道8的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d。
在注气管道6和抽气管道8的末端开口处包裹有钢丝网9，在钢丝网9的外侧包裹有一层无纺土工布10，所述钢丝网9的孔径为100目。钢丝网9和无纺土工布10能防止杂质进入注气管道6或抽气管道8，对注气泵5和抽气泵7起保护作用。
使用时，将石油降解贴1按要求埋设于石油污染土壤内，采用注气泵3和抽气泵8间歇的向石油污染土壤进行注气和抽气，中间间歇时间为8小时,目的是为满足微生物降解有机物所需的时间，减少过量通气造成微生物降解效率的下降以及降低无效成本。注气泵3注入的空气流沿垂直于石油降解贴2的方向依次水平穿过间隔的石油污染土壤和石油降解贴2，并被抽气泵8抽出。空气流携带的烃类或非烃类石油污染物在通过短纤土工布5或长丝土工布6时，被中间的石油降解固态菌剂层7降解代谢。测量土壤中的石油烃含量，直至土壤中石油烃含量不再有明显变化，关闭换气装置即可。经监测计算，石油污染土壤中石油烃的降解率大于75％。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.一种利用微生物处理石油污染土壤的装置，其特征是：包括相隔一定距离均匀有序的埋设于石油污染土壤内的若干条石油降解贴以及促进石油污染土壤内空气流通的换气装置，所述石油降解贴包括短纤土工布层和长丝土工布层，在短纤土工布层和长丝土工布层之间通过针刺方式固定有石油降解固态菌剂层；
所述石油降解贴横向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴之间的竖直距离为15cm,最顶层及最底层石油降解贴距离石油污染土壤表面及底面的距离为5cm；每组换气装置包括两注气泵,注气泵的出气口分别与一注气管道相连,注气管道的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d；
或，
所述石油降解贴竖向埋设于石油污染土壤内，相邻两石油降解贴之间的水平距离为50cm,最顶层及最底层石油降解贴的端部距离石油污染土壤表面及底面的距离为5cm；所述换气装置包括一注气泵和一抽气泵,所述注气泵和抽气泵的出气口和抽气口分别与一注气管道和一抽气管道相连，注气管道和抽气管道的末端分别伸入石油污染土壤的内部且末端开口相对设置，每立方米石油污染土壤的通气量为800-830m3/d；
利用所述微生物处理石油污染土壤的装置处理石油污染土壤的方法包括如下步骤：
(1)将需要处理的石油污染土壤经风干、散碎、过10目筛，调节土壤的pH值为7.0-7.5,在室温下将上述利用微生物处理石油污染土壤的装置布置在石油污染土壤中；
(2)启动换气装置，间歇的向石油污染土壤进行注气，间歇时间为8小时，或间歇的向石油污染土壤进行注气和抽气，间歇时间为8小时,对石油污染土壤进行处理，测土壤中的石油烃含量，直至土壤中石油烃含量不再有明显变化，关闭换气装置即可。
2.根据权利要求1所述的利用微生物处理石油污染土壤的装置，其特征是:所述石油降解固态菌剂层的厚度为2cm,短纤土工布层和长丝土工布层每平方米的重量均为200g/m2。
3.根据权利要求1-2任一所述的利用微生物处理石油污染土壤的装置，其特征是:所述石油降解固态菌剂贴的制备方法包括如下步骤：
采集石油降解菌菌源:取作为石油降解菌菌源的石油污染土样2g,接入装有100mL 无菌水的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d,得石油降解菌菌源；
富集培养石油降解菌：取步骤(1)中培养得到的10mL石油降解菌菌源接入装有100mL原油培养基的三角瓶中，于30℃、160r·min-1条件下在摇床中培养7d,重复操作三次得到以石油为唯一碳源的石油降解菌富集培养液；所述原油培养基的成分为：(NH4)2S04为 5g,KCl为1.1g,NaCl为5g,FeS04•7H20为0.028g,KH2P04为91.5g,K2HP04为1.5g,MgS04•7H20为0.5g,ZnS04•7H20为0.29g,CaCl2为0.24g,CuS04•5H20为0.25g,蒸馏水为1L,原油为10g,pH为7.2,在121℃灭菌20min；
分离和纯化石油降解菌：用接种环蘸取步骤(2)得到的富集培养液于平板培养基上划线，于30°C下培养7d,重复多次划线，直到分离得各纯化菌株;将纯化菌株于30℃下试管斜面培养7d,得石油降解菌菌悬液；所述平板培养基的成分为：蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,琼脂为15g,蒸馏水为1L,pH为7.2,在121℃灭菌20min,试管斜面培养基的成分为：蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,蒸馏水为1L,pH为7.2,在121℃灭菌20min；
复筛石油降解菌：称取含油土样50g,溶于100mL复筛培养基中配成泥浆，盛于三角瓶中，将步骤(3)制得的2mL菌悬液接种于泥浆中，各纯化菌种均做3个平行样，包含加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照，在30℃、160r・min-1条件下于摇床中培养，每2d取1次样，测泥浆中的石油烃含量，直至石油烃含量不再有明显变化时,测定泥浆中石油烃的降解率，得降解率最高的高效石油降解菌，将高效石油降解菌接入试管斜面培养基4℃保存,备用；所述复筛培养基的成分为：（NH4）2SO4为5g；KCl为1.1g；NaCl为5g；FeS04•7H20为0.028g； K2HPO4为1.5g；K2HPO4为1.5g；MgS04•7H20为0.5g；ZnS04•7H20为0.29g；CaCl2为0.24g；CuS04•5H20为0.25g蒸馏水为1L，ph为7.2,在121℃灭菌20min；斜面培养基的成分为：蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,蒸馏水为1L, pH为7.2,在121℃灭菌20min；
菌种活化:取步骤(4)制得的高效石油降解菌一环，在固体培养基上划线后于30℃培养箱中倒置培养1-2d长出单菌落后挑取单菌落再接入固体培养基上培养24h,得高效石油降解菌活化菌种；所述固体培养基的成分为:蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,琼脂为15g,蒸馏水为1L,pH为7.2,在121℃灭菌20min；
种子培养:取步骤(5)制得的活化菌种一环，接入种子培养基，于30℃、160r·min-1条件下，振荡培养12h,得高效石油降解菌种子培养液;所述种子培养基的成分为：蛋白胨为5g,酵母膏为3g,NaCl为5g,蒸馏水为1L, pH为7.2,在121℃灭菌20min；
液体扩大培养:取步骤(6)制得的种子培养液接入到扩大培养基中，于30℃、160r·min-1条件下，振荡培养4-10h,得高效石油降解菌扩大培养液;所述扩大培养基的成分为:蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,蒸馏水为1L,pH为7.2,在121℃灭菌20min；
高效石油降解菌的正交实验:取步骤(7)制得的高效石油降解菌结合单一纯种菌株降解石油效果实验，分别选取四种石油降解率较高的菌种以其接种量作为自变量，以石油降解率为应变量设计四因素三水平的正交实验，通过正交实验获得最优配比；
固态培养制作石油降解固态菌剂:取步骤(8)中培养到对数期的各菌种最优配比的扩大培养液，按体积比10%接种量接入固态培养基后搅拌均匀，用八层纱布包扎培养皿口，于恒温培养箱中30℃静置培养得石油降解固态菌剂；所述固态培养基的成分为:蛋白胨为10g,酵母膏为5g,NaCl为10g,琼脂为15g,蒸馏水为1L,pH为7.2,在121℃灭菌20min；
制作石油降解固态菌剂贴：
将步骤(9)制得的石油降解固态菌剂均匀的铺撒在短纤土工布和长丝土工布之间，使用针刺机反复进行穿刺固定，即得石油降解固态菌剂贴。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 251200 Yucheng province hi tech Development Zone, Dezhou, Yingbin Road, No. 168, No. Applicant after: HAOYANG ENVIRONMENTAL CO.,LTD. Address before: 251200 Yucheng province hi tech Development Zone, Dezhou, Yingbin Road, No. 168, No. Applicant before: SHANDONG HAOYANG NEW ENGINEERING MATERIALS CO.,LTD. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A device and method for using microorganisms to treat oil contaminated soil Granted publication date: 20220419 Pledgee: Yucheng Shandong rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: HAOYANG ENVIRONMENTAL CO.,LTD. Registration number: Y2024980002017 |