CN102277312A

CN102277312A - 一株低温降解多环芳烃菌株及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用

Info

Publication number: CN102277312A
Application number: CN 201110003125
Authority: CN
Inventors: 马会强; 张洪林; 张兰英; 李爽; 李长波; 赵国峥
Original assignee: Liaoning Shihua University
Current assignee: Liaoning Shihua University
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株低温降解多环芳烃的新鞘氨醇杆菌及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。该菌株为新鞘氨醇杆菌（Novosphingobiumsp.），于2009年10月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.3326。本发明菌株是从吉林油田某污染场地中分离，并经低温强化自然富集筛选得到，该菌株可以以多环芳烃为唯一碳源、能源生长，其生长细胞、静基细胞及固定化细胞均可以在低温条件下降解多环芳烃污染物，特别适用于石油烃污染场地地下水的生物修复。

Description

一株低温降解多环芳烃菌株及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用

技术领域

本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株低温降解多环芳烃的新鞘氨醇杆菌及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。

背景技术

多环芳烃分子中含有两个以上的苯环结构，属不饱和烃，主要包括：双环芳烃（萘）、三环芳烃（蒽、菲）以及三环以上芳烃（如苯并芘、苯并蒽），其中以两环、三环芳烃最为常见，其广泛存在于原油和石油制品（汽油、煤油、柴油等）中。

随着石油及制品的生产与广泛使用，各种途径造成的多环芳烃污染也日趋严重，其中石油烃直接渗入及雨水、灌溉水对土壤淋溶或是地表水体渗透均导致了许多国家和地区的地下水受到多环芳烃的严重污染。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，使得多环芳烃污染地下水的控制与修复已迫在眉睫。

目前典型的地下水污染修复方法主要有异位修复方法和原位修复方法。异位修复（抽出处理技术）被广泛用于易挥发且易溶解污染质（VOCs，SVOCs，Fuels）的恢复和治理中，但由于多环芳烃的溶解度相对较低且难以挥发，使其在多环芳烃污染地下水修复中的应用受到了限制。和异位修复相比，原位修复不但修复费用相对节省，而且还能最大程度减少污染物的暴露和对土地环境的扰动，其中原位生物修复被认为是一种很有发展前景的地下水修复技术。

原位生物修复，是指在基本不破坏土壤和地下水自然环境的条件下，对受污染环境对象不作搬运或输送，而在原场所进行生物修复。能够影响生物修复效率的因素有许多，其中功能微生物的污染物降解能力与效率最为重要。因此，对于多环芳烃污染而言，国内外进行了大量多环芳烃降解生物的筛选工作。到目前为止，已分离出具有多环芳烃降解能力的菌种主要有以下各属的菌株：假单胞菌属(Pseudomonas)、粪产碱杆菌属(Alcaligenes faecalis)、拟诺卡氏菌属(Nocardioides)、气单胞菌属(Aeromonas)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、弧菌属(Vibrio)、解环菌属(Cycloclasticus)、海杆菌属(Marinobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、硫酸盐还原菌(SRB)等细菌，以及酵母菌和白腐真菌等真菌；其中对细菌中假单胞菌和拟诺卡氏菌的多环芳烃降解研究最为广泛与深入，而真菌的降解研究则相对较少。

从上述多环芳烃降解菌种的筛选、降解能力及机理的研究中可知：降解菌种的工作温度大多为30-38℃左右，多环芳烃浓度（以萘、菲为例）多为几百mg/L-几十g/L，目标多环芳烃多为一种或两种，测试条件下多环芳烃降解效率较高。然而实际多环芳烃污染场地的地下水环境温度较低（10-15℃）、多环芳烃种类较多且较低（10μg/L-20mg/L），这使得已筛选的多环芳烃降解菌很难用于实际的地下水生物修复工程中，其中以温度影响最为突出。因此，本发明是针对地下水环境低温、多环芳烃浓度低等工程特点，经过独特的分离、富集策略而筛选的低温多环芳烃降解菌，用于石油烃污染场地地下水的生物修复。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足之处而提供一种低温降解多环芳烃菌株、该菌株的筛选方法以及该菌株用于治理石油烃污染地下水的生物修复技术，该菌株是具有在低温条件下降解多种多环芳烃的新鞘氨醇杆菌，在治理石油烃污染地下水中可以应用。

为达到上述目的，本发明是这样实现的：本发明提供的新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.），于2009年10月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.3326。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）是从吉林油田某污染场地中分离，并经低温强化自然富集筛选得到。菌株可在温度10～37℃，pH值6.5～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0.3～0.5μm×1.0～1.5μm，无鞭毛；菌株LB培养24h菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。

本发明菌株的生理生化特性为氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、尿素水解、产吲哚等试验项目为阳性，产H ₂ S、明胶液化、反硝化、油脂水解、MR 、VP、柠檬酸利用、3-酮基乳糖利用、亚硝酸盐还原、产氨、淀粉水解等试验项目为阴性，石蕊牛奶凝乳酶凝固，葡萄糖氧化产酸发酵。

本发明所述菌株可在温度10～37℃，pH值6.5～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0.3～0.5μm×1.0～1.5μm，无鞭毛；菌株LB培养24h菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。菌株具有在10～20℃低温下快速降解多环芳烃的能力。

作为一种优选方案，本发明所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。

上述低温降解多环芳烃菌株的筛选方法，可按如下步骤依次实施：（1）在室外温度小于-20℃时，从油田污染场地采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，以及地下水样品，制备成菌悬液，共同作为菌源进行低温自然富集培养；所述富集培养基含有：无机盐培养基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述无机盐培养基含有: K ₂ HPO ₄ 、NaH ₂ PO ₄ 、(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 、MgCl ₂ ·6H ₂ O、EDTA、ZnSO ₄ ·7H ₂ O、CaCl ₂ ·2H ₂ O、FeSO ₄ ·7H ₂ O、NaMoO ₄ ·2H ₂ O、CuSO ₄ ·5H ₂ O 、CoCl ₂ ·6H ₂ O及 MnCl ₂ ·2H ₂ O；（2）取适量菌悬液重新接种至步骤（1）所述的富集培养基中，继续低温适应、富集；（3）连续传代培养，逐次减少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油为唯一碳源和能源生长；（4）继续低温适应、富集，同时监测富集培养基中柴油组分的降解情况，发现0#柴油中多环芳烃被降解后，将菌悬液涂布在含0#柴油的固体无机盐培养基上；将分离得到菌种分别接种至含0#柴油的无机盐培养基中，依据各菌株所在培养基中的多环芳烃组分减少和浓度降低情况，进行分离即得目的产物低温降解多环芳烃菌株新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）。

上述低温降解多环芳烃菌株可用于石油烃污染场地地下水的低温生物修复。

具体地，本发明可采用低温降解多环芳烃菌株的生长细胞进行低温降解多环芳烃。

另外，本发明还可采用低温降解多环芳烃菌株的静基细胞进行低温降解多环芳烃。

其次，本发明还可采用低温降解多环芳烃菌株的固定化细胞进行低温降解多环芳烃。

本发明新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）可在温度10-37℃， pH值6.5～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0.3～0.5μm×1.0～1.5μm，无鞭毛。

新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）在LB（蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5， pH 7.4～7.6，单位：g/L）培养24小时菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。

新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）的生理生化特征，见表1。

表1 新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）生理生化特征

试验项目	结果	试验项目	结果	试验项目	结果
						氧化酶	+	MR	-	产氨	-
接触酶	+	VP	-	3-酮基乳糖	-
						产H ₂ S	-	柠檬酸利用	-	淀粉水解	-
明胶液化	-	亚硝酸盐还原	-	产吲哚	+
						反硝化	-	硝酸盐还原	+	石蕊牛奶	凝乳酶凝固
油脂水解	-	尿素水解	+	葡萄糖氧化发酵	氧化产酸

新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）的16S rDNA基因序列特征：通过提取并扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1028bp的16S rDNA全序列。采用细菌16S rDNA通用引物：上游：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游：5'-AAGGA GGTGATCCAGCCGCA-3'对其16S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10min，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保藏。通过Blast程序进行同源性比较，选择同源性大于97%的基因序列进行系统发育分析，表明菌株与Novosphingobium sp.YC6720(EU707558)同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）。

本发明的新鞘氨醇杆菌既可以在营养培养基，如：普通牛肉膏蛋白胨、普通LB、营养琼脂中生长，有可在以多环芳烃为唯一碳源、能源的无机盐基础培养基中生长。

本发明的新鞘氨醇杆菌具有在10-20℃低温下快速降解多环芳烃的能力，降解底物范围广。

本发明的新鞘氨醇杆菌，可以用其新鲜培养的生长细胞或是制备成的静基细胞及其固定化细胞在低温条件下对石油烃污染地下水进行处理。

本发明所到达的有益效果是：本发明提供的新鞘氨醇杆菌对多环芳烃有着低温、快速降解能力，且降解底物范围广，尤其对石油制品中低浓度多环芳烃具有较好的降解效果，在短时间内，降解率高达90%以上。该菌可以作为功能微生物菌剂置于地下反应墙中，用以生物修复石油烃污染地下水。另外，由于该菌种具有低温降解多环芳烃能力，使其在低温地区多环芳烃污染场地修复中有着广阔的应用潜力。

分类命名：新鞘氨醇杆菌。

拉丁文名：Novosphingobium sp.。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

保藏日期：2009年10月12日。

保藏编号：CGMCC No.3326。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

图1为本发明新鞘氨醇杆菌序列图谱。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不受此实施例的限制。

实施例1。

本发明提供的新鞘氨醇杆菌的分离筛选方法。

在北方冬季，室外温度长期恒定小于-20℃时，从吉林油田某污染场地采集距地表下5-20cm处表层土壤样品，以及地下水样品，共同作为菌源进行低温自然富集培养。即将所取土壤及地下水样品制成菌悬液，取上清液添加至富集培养基中【无机盐培养基（K ₂ HPO ₄ 1550，NaH ₂ PO ₄ 850，(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2000，MgCl ₂ ·6H ₂ O 100，EDTA 10，ZnSO ₄ ·7H ₂ O 2.0，CaCl ₂ ·2H ₂ O 1.0，FeSO ₄ ·7H ₂ O 5.0，NaMoO ₄ ·2H ₂ O 0.2，CuSO ₄ ·5H ₂ O 0.2，CoCl ₂ ·6H ₂ O 0.4，MnCl ₂ ·2H ₂ O 1.0，pH 7.0，单位：mg/L），0#柴油10 mL/L，葡萄糖 5 g/L，酵母膏 1 g/L】，10℃低温富集培养，其中培养基在121℃，高压灭菌20分钟后使用（下同）。然后取适量菌悬液重新接种至富集培养基中，继续10℃低温适应、富集。而后连续传代培养6次，逐次减少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油为唯一碳源和能源生长。继续10℃低温适应、富集，此阶段利用气相色谱质谱监测培养基中柴油组分的降解情况，发现柴油中多环芳烃被降解后，将菌悬液涂布在含1% 0#柴油的固体无机盐培养基（琼脂1.5%）上，反复进行平板涂布，将分离得到菌种分别接种至含300mg/L 0#柴油的无机盐培养基中，10℃低温2天，依据各菌株所在培养基中的多环芳烃组分减少和浓度降低情况，分离一株具有低温高效降解多种多环芳烃的新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）；该菌于2009年10月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.3326。

新鞘氨醇杆菌的16S rDNA基因的PCR扩增、测序及分离鉴定。

将新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）接种于已灭菌的LB培养基（蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5， pH 7.4-7.6，单位：g/L）中，于30℃，150rpm摇床培养24小时，离心收集细胞，重新悬浮，加溶菌酶破壁，由SDS-氯仿-异戊醇-异丙醇方法提取DNA，采用细菌16S rDNA的通用引物，上游：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游：5'-AAGGA GGTGATCCAGCCGCA-3'，对其16S rDNA进行PCR扩增，扩增产物由上海生工生物工程技术有限公司进行测序。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10min，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保藏。16S rDNA序列长度为1028bp，详见序列表。通过Blast程序进行同源性比较，选择同源性大于97%的基因序列，用ClustalX（1.83）和Phylip3.6软件构建系统发育树。系统发育表明菌株与Novosphingobium sp.YC6720(EU707558)的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.），GenBank登录号为NO.FJ169870。

实施例2。

新鞘氨醇杆菌的生长细胞低温降解多环芳烃。

将新鞘氨醇杆菌接种至含300mg/L柴油的污染地下水中，同时做不接种空白对照，将上述样品置于10℃，150rpm摇床培养3天，萃取处理后进行气相色谱质谱全扫描分析，经与谱库对比，新鞘氨醇杆菌可完全降解柴油中的多环芳烃有：萘、1-甲基萘、2-甲基萘、2-乙基萘、2，6-二甲基萘、2，7-二甲基萘、1，8-二甲基萘、1，4-二甲基萘、1，6-二甲基萘、1，4，5-三甲基萘、1，6，7-三甲基萘、2，3，6-三甲基萘、2-甲基联苯、4-甲基联苯、菲、1-甲基菲、2-甲基菲、4-甲基菲，部分降解的多环芳烃有：1-丙基萘、1，4，6-三甲基萘、2-甲基芴、4，4-二甲基联苯、2，5-二甲基菲。

实施例3 。

新鞘氨醇杆菌的静基细胞低温降解多环芳烃。

将新鞘氨醇杆菌接种于柴油无机盐培养基（培养基同上，柴油浓度为300mg/L）中，10℃，150rpm摇床培养至对数生长期，菌数约为10 ⁹ -10 ¹¹ 个/mL，将菌株悬液于8000rpm，4℃下高速离心15min，用磷酸盐缓冲液冲洗菌体后，再将菌株悬液重复三次离心、清洗，最后收集菌体制备成菌株静基细胞悬液（菌数约为10 ¹⁰ 个/mL）。分别进行如下实验。

（1）将新鞘氨醇杆菌静基细胞悬液以5%（V/V）接种于萘污染地下水中（萘浓度为20mg/L），10℃低温下，24小时萘的降解率为95.4%。

（2）将新鞘氨醇杆菌静基细胞悬液以5%（V/V）接种于菲污染地下水中（菲浓度为1mg/L），10℃低温下，24小时菲的降解率为98.6%。

（3）将新鞘氨醇杆菌静基细胞悬液以5%（V/V）接种于0.2mol/L的邻苯二酚溶液中，置于10℃恒温箱内，30秒内，无色的邻苯二酚溶液迅速变黄，且溶液在375nm处有最大吸光度值，说明新鞘氨醇杆菌细胞体内含有邻苯二酚2，3-双加氧酶，将邻苯二酚转化成了2-羟粘糠酸半醛，这表明菌株降解多环芳烃时能够利用邻苯二酚2，3-双加氧酶间位断裂开环。

实施例4。

新鞘氨醇杆菌的固定化细胞低温降解多环芳烃。

将500mL新鞘氨醇杆菌的静基细胞悬液置于1L容器中，并接入100g草炭土，将容器置于10-15℃培养2天，用滤网将泥炭过滤后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，再过滤，摊开放置1天，即制备成固定化细胞。将固定化细胞与含水层介质按照1：4（V/V）配比填装渗流柱（长50cm，内径5cm），将渗流柱置于10-15℃温控室进行模拟柴油污染地下水的生物修复试验。数据监测显示：运行期渗流柱对地下水中代表性多环芳烃的去除率为：萘97.85%、1-甲基萘98.35%、2-甲基萘98.14%、菲96.25%；试验结束后，采集10g渗流柱填充介质，超声波萃取后进行气相色谱质谱全扫描分析，结果表明：填充介质上未含有上述多环芳烃物质；以上结果充分表明新鞘氨醇杆菌的固定化细胞具有低温降解多环芳烃能力，适用以固定化菌剂形式用于地下水修复反应器，进行石油烃污染地下水的生物修复。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

1028

DNA

新鞘氨醇杆菌 CGMCC No.3326

accccctgat ggtcgcctgc ctcccttgcg ggttagctca acgccttcga gtgaatccaa 60

ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcctgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120

gatccgcgat tactagcgat tccgccttca tgctctcgag ttgcagagaa caatccgaac 180

tgagacggct tttggagatt agctcacact cgcgtgcttg ctgcccactg tcaccgccat 240

tgtagcacgt gtgtagccca gcgtgtaagg gccatgagga cttgacgtca tccccacctt 300

cctccggctt atcaccggca gtttccttag agtgcccaac taaatgctgg caactaagga 360

cgagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc 420

catgcagcac ctgtgcacgg tccagccgaa ctgaaggaaa tggtctccca aatccgcgac 480

cggcatgtca aacgctggta aggttctgcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac 540

cgcttgtgca ggcccccgtc aattcctttg agttttaatc ttgcgaccgt actccccagg 600

cggataactt aatgcgttag ctgcgccacc caagtaccaa gtacccggac agctagttat 660

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca 720

cctcagcgtc aatacttgtc cagtcagtcg ccttcgccac tggtgttctt ccgaatatct 780

acgaatttcac ctctacact cggaattcca ctgacctctc caagattcta gtcacctagt 840

ttcaaaggca gttccggggt tgagccccgg gctttcacct ctgacttgag taaccgccta 900

cgcgcgcttt acgcccagta attccgaaca cgctagctcc ctccgtatta ccgcggctgc 960

tggcacggag ttagccggag cttattctcc aggtactgtc attatcatcc ctggtaaaga 1020

agctttac 1028

Claims

1.一株低温降解多环芳烃菌株，其特征在于，该菌株保藏名称为：新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年10月12日，保藏号：CGMCC No.3326。

2.根据权利要求1所述的低温降解多环芳烃菌株，其特征在于：所述菌株可在温度10～37℃，pH值6.5～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0.3～0.5μm×1.0～1.5μm，无鞭毛；菌株LB培养24h菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。

3.根据权利要求2所述的低温降解多环芳烃菌株，其特征在于：所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。

4.根据权利要求1～3之任一所述的低温降解多环芳烃菌株的筛选方法，其特征在于，按如下步骤依次实施：

（1）在室外温度小于-20℃时，从油田污染场地采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，以及地下水样品，制备成菌悬液，共同作为菌源进行低温自然富集培养；

所述富集培养基含有：无机盐培养基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述无机盐培养基含有: K₂HPO₄、NaH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂·6H₂O、EDTA、ZnSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O 、CoCl₂·6H₂O及 MnCl₂·2H₂O；

（2）取适量菌悬液重新接种至步骤（1）所述的富集培养基中，继续低温适应、富集；

（3）连续传代培养，逐次减少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油为唯一碳源和能源生长；

（4）继续低温适应、富集，同时监测富集培养基中柴油组分的降解情况，发现0#柴油中多环芳烃被降解后，将菌悬液涂布在含0#柴油的固体无机盐培养基上；将分离得到菌种分别接种至含0#柴油的无机盐培养基中，依据各菌株所在培养基中的多环芳烃组分减少和浓度降低情况，进行分离即得目的产物低温降解多环芳烃菌株新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium sp.）。

5.一种如权利要求1～3之任一所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。

6.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于：采用菌株的生长细胞低温降解多环芳烃。

7.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于：采用菌株的静基细胞低温降解多环芳烃。

8.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于：采用菌株的固定化细胞低温降解多环芳烃。