CN104531831A

CN104531831A - 一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法

Info

Publication number: CN104531831A
Application number: CN201510035067.3A
Authority: CN
Inventors: 骆苑蓉; 黄凌风; 杨芳
Original assignee: Xiamen University; Shenzhen Research Institute of Xiamen University
Current assignee: Xiamen University; Shenzhen Research Institute of Xiamen University
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-04-22

Abstract

一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，涉及一种菌株。从自然海区采集生态浮床植物海马齿根际周围的水样，运回实验室；将采集的水样加入含菲无机盐培养基中培养7d后，取培养液转接至菲-无机盐培养基中再培养7d后，移取培养液进行10^－1～10^－8梯度稀释，分别取10^－4，10^－6，10^－8各100μL菌液涂布于2216E固体培养基上，继续培养4～7d，待平板长出菌落；取长出菌落的平板，应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选，得多环芳烃降解菌。利用上述方法，可获得Novosphingobium resinovorum R3，保藏编号为CGMCC No.10019。

Description

一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法

技术领域

本发明涉及一种菌株，特别是涉及一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法。

背景技术

近年来随着经济高速发展，水体污染事件频频发生(例如：2005年11月，松花江苯、硝基苯等重大水污染事件；2011年6月，渤海湾严重石油泄漏事故；2013年1月，城市地下水严重污染事件等)，环境污染问题日益凸显。环境污染不仅造成了巨大的经济损失，而且给环境生态、人类健康和社会经济的持续发展带来了沉重的灾难，污染治理早已成为全球范围内的共同研究重点。

污染水体治理策略中，作为生物修复(bioremediation)的主要方法之一，植物修复(phytoremediation)被广泛应用于受到营养盐、持久性有机污染物(persistent organicpollutants,POPs)、重金属和放射性元素等各类污染物污染的城市生活污水、工业废水、农业生产养殖废水、富营养化水体等的处理，展示了很好的净化效果。植物修复是指利用植物及其根际微生物的代谢活动来吸收、积累或降解转化环境中的污染物(氮，磷，重金属及有机污染物等)以达到净化、修复环境的目的(Dietz,AC.,Schnoor,JL.Advances inphytoremediation[J].Environ Health Persp,2001,109(Suppl 1):163-168；Perelo,LW.(2010).Review:In situ and bioremediation of organic pollutants in aquatic sediments[J].J Hazard Mater,2010,177(1–3):81-89.)

环境污染物中，持久性有机污染物因其具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性的四个特性而备受国际关注。其中多环芳烃(polycyclic aromatichydrocarbons,PAHs)是一类广泛分布并稳定存在于自然环境中的含两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，在POPs中居于重要地位。它主要来源于石油污染、油轮泄漏、汽车尾气、煤及石油等天然燃料的不完全燃烧等。

PAHs生物修复的过程主要涉及三大方面的因素：环境条件、微生物自身的性质和PAHs的属性。其中微生物是生物修复许多难降解持久性有机污染物(如PAHs、含氯农药等)的主体，其较高的繁殖速度、代谢多样性、遗传变异性，使有机污染物均能被一种微生物或一个微生物群体全部或部分降解。(Madsen,EL.Determining in situ biodegradation:Facts andChallenges[J].Envrion Sci Technol,1991,25(10):1663-1672；Jeon,CO.,Madsen,EL.In situ microbial metabolism of aromatic-hydrocarbon environmental pollutants[J].Curr Opin Biotechnol,2013,24(3):474-481.)

因而对于PAHs环境污染的治理，如何获取高效PAHs降解菌是提高生物修复效率的关键技术要素。高效PAHs降解菌不仅可以作为开发PAHs生物修复的菌源，更重要的是还可以作为研究PAHs生物降解机制的模式菌株，为开发具有普遍意义及应用价值的生物修复技术奠定基础。根系微生物多样性丰富，如何有针对性地快速获得高效PAHs降解菌，建立相应的技术手段与方法至关重要。

菲(Phenanthrene)是燃油和汽车尾气排放PAHs的标志物，在环境中检出浓度一般较高，且作为优先控制的多环芳烃类物质，菲的研究对于多环芳烃类物质的环境治理具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法。

本发明的第二目的在于提供一种对多环芳烃具有降解能力的菌株Novosphingobiumresinovorum R3。

一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，包括以下步骤：

1)从自然海区采集生态浮床植物海马齿(Sesuvium portulacastrum)根际周围的水样，运回实验室；

2)将步骤1)采集的水样加入含菲无机盐培养基中培养7d后，取培养液转接至菲-无机盐培养基中再培养7d后，移取培养液进行10^－1～10^－8梯度稀释，分别取10^－4，10^－6，10^－8各100μL菌液涂布于2216E固体培养基上，继续培养4～7d，待平板长出菌落；

3)取步骤2)长出菌落的平板，应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选，得多环芳烃降解菌。

在步骤1)中，所述自然海区为中国福建省厦门市筼筜湖，所述生态浮床植物海马齿最好采用铺设于筼筜湖内湖至少3年的海马齿，其根系周围已形成稳定的微型生态系统；所述生态浮床植物海马齿根际周围的水样最好是生态浮床植物海马齿根际周围2cm半径内的水样；所述运回实验室可用冰盒保存运回实验室。

在步骤2)中，所述水样与含菲无机盐培养基的体积比可为1∶9；水样的量最好为5mL；所述含菲无机盐培养基的组成可为硫酸铵2.38g，七水硫酸亚铁0.278mg，1M磷酸钾缓冲液100μL，陈海水750mL，蒸馏水250mL，菲50mg，pH 7.6；所述培养的条件可在摇床中以150rpm，25℃培养；所述2216E固体培养基的组成为：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.01g，陈海水1000mL，琼脂15g，pH 7.6～7.8；所述继续培养，可在25℃恒温生化培养箱中培养4～7d。

在步骤3)中，所述应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选的具体方法可为：

(1)往500mL的玻璃烧杯里添加5mL 10mg/mL的菲-二氯甲烷溶液，在通风橱里让二氯甲烷自然挥发；

(2)取长出菌落的平板，将平板反扣在烧杯口上，用封口膜密封二者接触的地方，再取一相同半径的平皿，平皿内放上冰块，置于平板上；

(3)94℃水浴5min，将烧杯与平板取出，冷却，揭膜，平板表面形成薄薄一层白色的菲气雾；

(4)将平板放回25℃恒温生化培养箱中继续培养，24h后观察，若菌落周围形成透明圈，即表示该菌能利用菲，可确认为多环芳烃降解菌。

利用上述方法，可获得对多环芳烃具有降解能力的菌株Novosphingobium resinovorumR3，菌株Novosphingobium resinovorum R3已于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.10019。

所述菌株Novosphingobium resinovorum R3可记为食树脂新鞘氨醇杆菌。

本发明首先从应用于富营养化水体修复的生态浮床植物海马齿根际水样中筛选出能利用多环芳烃作为唯一碳源和能源的降解菌，然后运用该菌株对多环芳烃进行降解。

本发明以菲作为环境中典型PAHs的代表，基于环境生物技术开发一种从环境中获得持久性有机污染物PAHs降解菌的筛选新方法，相较于以往的筛选方法，更为简便直观快速地获得PAHs降解菌，为开发微生物资源多样性，有效挖掘环境中优良降解菌株，并成功应用于污染环境生物修复提供高效菌质资源。

本发明提供一种从修复富营养化水体的植物根系中获得多环芳烃降解菌的筛选方法，通过从植物根际采样，经选择培养基多次转接培养，再通过平板升华法筛选得到多环芳烃降解菌。所述方法对于应用生物修复进行环境污染治理具有重要现实指导意义。本发明所获得的多环芳烃降解菌在7d内可去除88.23％起始浓度为100mg/L的菲，显示较强的降解多环芳烃能力，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明的菌株R3平板升华照片(菌落周围为利用菲后所产生的透明圈)。

图2为本发明的菌株R3对菲的降解性能。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法实施例，包括以下步骤：

1)从自然海区采集生态浮床植物海马齿根际周围的水样，运回实验室；所述自然海区为中国福建省厦门市筼筜湖，所述生态浮床植物海马齿最好采用铺设于筼筜湖内湖至少3年的海马齿，其根系周围已形成稳定的微型生态系统；所述生态浮床植物海马齿根际周围的水样最好是生态浮床植物海马齿根际周围2cm半径内的水样；所述运回实验室可用冰盒保存运回实验室。

2)将步骤1)采集的水样加入含菲无机盐培养基中培养7d后，取培养液转接至菲-无机盐培养基中再培养7d后，移取培养液进行10^－1～10^－8梯度稀释，分别取10^－4，10^－6，10^－8各100μL菌液涂布于2216E固体培养基上，继续培养4～7d，待平板长出菌落；所述水样与含菲无机盐培养基的体积比可为1∶9；水样的量最好为5mL；所述含菲无机盐培养基的组成可为硫酸铵2.38g，七水硫酸亚铁0.278mg，1M磷酸钾缓冲液100μL，陈海水750mL，蒸馏水250mL，菲50mg，pH 7.6；所述培养的条件可在摇床中以150rpm，25℃培养；所述2216E固体培养基的组成为：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.01g，陈海水1000mL，琼脂15g，pH 7.6～7.8；所述继续培养，可在25℃恒温生化培养箱中培养4～7d。

3)取步骤2)长出菌落的平板，应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选，得多环芳烃降解菌。所述应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选的具体方法可为：

将筛选出的多环芳烃降解菌接种至含菲起始浓度为100mg/L的无机盐培养基(硫酸铵2.38g，七水硫酸亚铁0.278mg，1M磷酸钾缓冲液100μL，陈海水750mL，蒸馏水250mL，菲50mg，pH 7.6，121℃灭菌20min)中，放入摇床中150rpm,25℃培养，7d后可降解88.23％的菲；所述接种量为OD6000.2。

利用上述方法，可获得对多环芳烃具有降解能力的菌株Novosphingobium resinovorumR3，所述菌株Novosphingobium resinovorum R3可记为食树脂新鞘氨醇杆菌。

本发明的菌株R3平板升华照片(菌落周围为利用菲后所产生的透明圈)参见图1。本发明的菌株R3对菲的降解性能参见图2。

Claims

1.一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从自然海区采集生态浮床植物海马齿根际周围的水样，运回实验室；

2.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤1)中，所述自然海区为中国福建省厦门市筼筜湖；所述生态浮床植物海马齿可采用铺设于筼筜湖内湖至少3年的海马齿。

3.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤1)中，所述生态浮床植物海马齿根际周围的水样是生态浮床植物海马齿根际周围2cm半径内的水样；所述运回实验室是可用冰盒保存运回实验室。

4.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述水样与含菲无机盐培养基的体积比为1∶9；水样的量最好为5mL。

5.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述含菲无机盐培养基的组成为硫酸铵2.38g，七水硫酸亚铁0.278mg，1M磷酸钾缓冲液100μL，陈海水750mL，蒸馏水250mL，菲50mg，pH 7.6。

6.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养的条件是在摇床中以150rpm，25℃培养。

7.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述2216E固体培养基的组成为：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.01g，陈海水1000mL，琼脂15g，pH 7.6～7.8。

8.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述继续培养，是在25℃恒温生化培养箱中培养4～7d。

9.如权利要求1所述一种从水体植物根系筛选多环芳烃降解菌的方法，其特征在于在步骤3)中，所述应用平板升华法进行多环芳烃降解菌筛选的具体方法为：

(4)将平板放回25℃恒温生化培养箱中继续培养，24h后观察，若菌落周围形成透明圈，即表示该菌能利用菲，确认为多环芳烃降解菌。

10.Novosphingobium resinovorum R3，已于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10019。