CN110438117B - 多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法 - Google Patents

多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多环芳烃底物吸附内衬，所述底物吸附内衬为中空圆柱形或者中空方柱形，其外径比96孔板小孔内径小0.5～1.0mm，壁厚为0.1～0.3mm，柱高为3～7mm，壁体设有多个圆形或椭圆形通孔；所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直径或长轴为0.5～1.0mm。本发明属于环保生物技术领域，提供的多环芳烃底物吸附内衬结构简单，实现了突变菌株的生长情况的原位批量检测；提供的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，代替原有的三角瓶培养，无需将孔内培养液吸出再检测，在节省成本的同时大大提高了效率，实现了高通量的检测和筛选。

Description

多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法
技术领域
本发明属于环保生物技术领域，尤其涉及一种多环芳烃底物吸附内衬及高通量筛选多环芳烃降解突变菌的方法。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)指分子中含有两个以上苯环的碳氢化合物，包括萘、蒽、菲、芘等上百种化合物。多环芳烃的污染日益严重，由于其具有显著的“三致”(致癌变、致突变、致畸)效应，如何快速、有效治理成为亟待解决的任务。生物降解作为一种环境友好型处理方法得到广泛关注，而降解菌种的筛选是生物降解法施行的必要基础。当前，从污染环境中筛选出的菌种已有大量报道。为提高这些野生菌种的降解效率，通过突变选育降解能力更强的突变菌株用于多环芳烃降解实践是一个主要方法。
传统的多环芳烃降解突变株选育方法一般包括以下几个步骤：首先通过物理化学诱变后，挑选涂布获得的单菌落。然后将每个单菌落接种到含有底物多环芳烃三角瓶中，检验细胞生长。传统的多环芳烃降解方法需要将多环芳烃溶解于有机溶剂中，喷于三角瓶底部，待有机溶剂挥发后再加培养基和接种，通过细胞生长情况可判断出诱变菌株的多环芳烃降解能力。传统的多环芳烃降解方法往往涉及几十甚至几百个三角瓶的操作，费时费力，成本高，易污染，效率低，不利于高通量检测，也无法实现原位检测。
开发多环芳烃降解突变株的高通量筛选方法意义重大。应用96孔板替代三角瓶可实现高通量的快速筛选，而96孔板也让利用酶标仪进行原位高通量检测成为可能。中国专利申请CN 109182183A公开了一种利用96孔板高通量筛选石油降解突变菌的方法，该方法使用液体石油作为底物，悬浮和分散的油滴会干扰细胞生长产生的吸光度变化，但无法通过OD值检测细胞生长情况，因此只能通过繁琐的取样-萃取-转移等步骤来检测底物的消耗来计算石油的降解。由于多环芳烃作为一种不溶于水的底物，若以晶体方式直接添加于96孔板中，会对酶标仪的光路透过性产生影响，干扰测定；若以溶解于其他有机溶剂的方式添加于96孔板中，一方面添加的有机溶剂可能会对细胞产生毒性，另一方面也可能作为潜在的碳源被细胞利用，影响菌种选育效果。
因此，提供一种高通量、易推广的多环芳烃降解突变菌的检测方法，对于多环芳烃降解菌突变菌种资源的开发和污染治理具有重要意义。
发明内容
为克服多环芳烃作为底物的添加方式对细胞生长原位检测的影响，本发明提供了一种用于96孔板的多环芳烃底物吸附内衬，该底物吸附内衬可通过底物升华法在表面均匀的吸附一层多环芳烃，置于96孔板的小孔中，将底物固定于小孔的侧壁附近，不遮挡小孔底部，也不会在培养过程中散落在培养液中，进而避免了对光路透过性的影响，通过96孔板培养可使用酶标仪在600nm波长下原位检测菌体生长的吸光度值，依此判断突变菌株的代谢能力。在提供多环芳烃底物吸附内衬的基础上，本发明还提供了底物吸附内衬的吸附方法，以及筛选多环芳烃降解突变菌的方法。本发明提供的多环芳烃底物吸附内衬及筛选多环芳烃降解突变菌的方法，成本低，操作简便，易于推广，大大提高了多环芳烃降解突变菌的筛选效率。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种多环芳烃底物吸附内衬，所述底物吸附内衬为中空圆柱形或者中空方柱形，其外径比96孔板小孔内径小0.5～1.0mm，壁厚为0.1～0.3mm，柱高为3～7mm，壁体设有多个圆形或椭圆形通孔；所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直径或长轴为0.5～1.0mm。
优选地，所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm，所述底物吸附内衬的外径为10.0±0.2mm，壁厚为0.2～0.3mm，柱高为5.5～6.5mm，所述通孔的直径或长轴为0.75～0.85mm。
优选地，所述96孔板小孔内径为6.8±0.2mm，所述底物吸附内衬的外径为6.0±0.2mm，壁厚为0.1～0.2mm，柱高为3.5～4.5mm，所述通孔的直径或长轴为0.55～0.65mm。
优选地，所述多环芳烃包括萘、菲、荧蒽、蒽和苯并(a)芘；所述底物吸附内衬的材质为塑料或碳纤维。
相应地，本发明还提供多环芳烃底物吸附内衬的吸附方法，包括如下步骤：在可调恒温电炉上放置容器，在容器内铺满干燥的加热介质，在加热介质上放置一耐热玻璃浅盘，底部放置适量多环芳烃晶体，底物上方放置隔帘，将塑料内衬置于隔帘上平整铺好，用盖板将浅盘封闭；根据多环芳烃的种类，设定不同的电炉加热温度及保温时间，得到在表面均匀吸附多环芳烃晶体的内衬。
根据多环芳烃的种类不同，设定加热温度及保留时间如下：萘(75℃，保温0.2～2分钟)、菲(95℃，保温30～50分钟)、荧蒽(95℃，保温8～15分钟)、蒽(135℃，保温3～10分钟)、苯并(a)芘(135℃，保温20～35分钟)。加热温度的设定原则是：低于多环芳烃熔点3～8℃，以低于多环芳烃熔点5℃为较佳。
优选地，所述加热介质为过100目筛的河沙；所述隔帘为特氟龙材质，所述盖板为特氟龙材质。采用特氟龙材质的隔帘与盖板，可有效避免对多环芳烃的吸附而造成材料的损失。
此外，本发明还提供一种筛选多环芳烃降解突变菌的方法，包括如下步骤：
S1)将多环芳烃降解菌悬液滴于温度保持在20～30℃的无菌金属铁片上，置于诱变室内，以氦气作为载体，功率为100～120w，氦气流量为9～11L/min，处理时间15～150s；
S2)诱变完成后，用无菌水洗脱菌膜，采用稀释涂平板法将洗脱液稀释后涂营养琼脂平板，在28～32℃下培养18～24h，平板长出单菌落后，取已灭菌96孔板，取所述的多环芳烃底物吸附内衬吸附多环芳烃后，置于96孔板小孔内，然后在小孔内注入无机盐培养基，用接种针挑取单菌落接种到96孔板小孔的无机盐培养基中，28～32℃下静止培养24～72h；
S3)将培养结束后的96孔板置于酶标仪下检测培养液的吸光度值；其中，吸光度值低于对照的，是负突变；吸光度值高于对照的，是正突变。吸光度值越高，说明细胞增殖越多，该突变菌的降解能力越强。
采用上述方法，将吸附了多环芳烃的内衬置于96孔板的小孔中，巧妙的将本应沉淀在孔底部的底物固定在了孔壁一侧，这样就不会阻挡光路的穿梭，进而为96孔板各小孔内细胞浓度的批量检测奠定了基础，极大的简化了操作，节省了人力物力以及成本，提高了效率，具有良好的市场应用前景。
本发明的创新点不在于诱变和突变菌的分离，诱变方法采用常压室温等离子体诱变仪(ARTP)系统，本发明也可以其他常规诱变方法和突变菌的分离方法。
优选地，所述多环芳烃降解菌采用Moraxella osloensis CFP312，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60595。将Moraxella osloensis CFP312接种于液体营养培养基中，30℃、150rpm震荡培养48h，8000rpm下冷冻离心2min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后制成菌悬液，调节菌悬液的OD600到0.08～0.12后备用。优选地，所述营养培养基包括如下组分：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L。所述营养琼脂平板培养基是在营养培养基成分基础上加琼脂20g/L得到。
优选地，所述酶标仪的检测波长为600nm。
优选地，所述无机盐培养基包括如下组分：Na2HPO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L、(NH4)2SO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeCl3·3H2O 0.005g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L。Na2HPO4、KH2PO4、(NH4)6Mo7O24·4H2O、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、FeCl3·3H2O、CaCl2·2H2O主要为Moraxella osloensis CFP312提供除碳源以外的其他无机营养。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供了一种可用于96孔板高通量检测的多环芳烃底物吸附内衬，结构简单，可以将底物固定于96孔板小孔的侧壁附近，不遮挡小孔底部，也不会在培养过程中散落在培养液中，进而避免了对光路透过性的影响，实现了突变菌株的生长情况的原位批量检测，大大节省了人力物力。
(2)本发明提供的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，通过应用多环芳烃底物吸附内衬，采用96孔板代替原有的三角瓶培养，令培养操作大大简化，采用酶标仪直接检测96孔板内的培养液，而无需将孔内培养液吸出再检测，在节省成本的同时大大提高了效率，实现了高通量的检测和筛选。
附图说明
图1本发明提供的中空圆柱形底物吸附内衬示意图；其中，a1指壁厚，b1指外径，c1指柱高，d1指通孔的直径或长轴。
图2本发明提供的中空方柱形底物吸附内衬示意图；其中，a2指壁厚，b2指外径，c2指柱高，d2指通孔的直径或长轴。
图3本发明提供的底物吸附内衬吸附多环芳烃的升华法示意图；其中，1指底物吸附内衬，2指盖板，3指隔帘，4指浅盘，5指多环芳烃，6指河沙，7指铁质容器，8指可调控温电炉。
图4本发明提供的筛选方法的底物利用及光路检测示意图；其中，10指小孔，11指吸附了多环芳烃的底物吸附内衬，12指菌体，13指光发射端，14指培养基液面，15指光接收端。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1底物吸附内衬的结构设计
S1：底物吸附内衬形状设计原则：内衬吸附多环芳烃后，以中心孔径不影响光路原位检测为基本原则。
S2：本发明内衬孔径设计为：外径小于96孔板小孔内径0.5～1mm、壁厚0.1～0.3mm。以小孔直径＝6.85mm的96孔板为例，加入吸附多环芳烃后的底物吸附内衬后，中心孔径直径减少了2.6mm至5.25mm。而酶标仪的光路在96孔板小孔的正中心，误差不超过0.5mm。因此，加入吸附内衬后，对光路检测没有影响。
S3：本发明内衬的壁厚设计原则：最薄不能低于0.1mm，若低于此值，内衬强度不够，容易变形；最厚不超过0.3mm，超过0.3mm会导致插入内衬后的96孔板小孔孔径进一步缩小。同时，过厚则内衬占有大量小孔内部空间，导致加液量减少。通过实验测定，根据96孔板规格的不同，壁厚在0.1～0.3mm之间比较合适。
S4：内衬高度设计原则：最低不能少于2mm，少于2mm则内衬过小，吸附的多环芳烃量过少；最高不能超过10mm，以防太高顶住小孔的插孔盖，导致孔盖无法盖下。
S5：通孔形状设计原则：备选方案有正方形、菱形和圆形。经实验对比发现，正方形和菱形在夹角处出现了超结晶现象。当采用升华法让内衬吸附多环芳烃时，加热产生的多环芳烃蒸汽在正方形或菱形的夹角处优先结晶，导致四角产生结构脆弱的长针状晶体。这种长针状晶体形状的多环芳烃在细胞培养过程中容易脱落，进而影响光路测量；而圆形通孔，由于没有尖锐夹角，因而多环芳烃吸附平整，不会产生针状晶体，有利于实验操作。
S6：通孔直径设计原则：最少不低于0.5mm，少于0.5mm则吸附的多环芳烃容易堵塞通孔，导致培养液无法穿过通孔流动；最大不超过1mm，超过则内衬强度变差，容易变形。
S7：材料选择：内衬材质备选有塑料、不锈钢、玻璃、碳纤维等。经实验发现，不锈钢内衬容易刮花96孔板，玻璃内衬加工困难，碳纤维内衬造价高。综合考虑，塑料内衬容易加工，不会损伤96孔板，容易清洗再利用，而且成本低，优先选用选塑料作为内衬材料，当然，也可以选用碳纤维材料。
实施例2底物吸附内衬的具体规格
本发明提供的吸附内衬材质如图1和图2所示，其大小和形状依赖于所用96孔板的规格。具体的，当96孔板的规格为“小孔口直径＝10.7mm、孔高＝16.9mm”时，内衬的参数为：外径10±0.2mm、壁厚0.25±0.05mm、高度6±0.5mm、网格直径为0.8±0.05mm；当96孔板的规格为“小孔口直径＝6.85mm、高＝10.67mm”时，内衬的参数为：外径6±0.2mm、壁厚0.15±0.05mm、高度4±0.5mm、网格直径为0.6±0.05mm。
实施例3内衬对底物的吸附
如图3所示，本发明提供的底物吸附内衬吸附多环芳烃的方法包括如下步骤：在可调恒温电炉8上放置铁质容器7，在铁质容器7内铺满干燥的100目筛河沙6，在河沙6上放置一耐热玻璃浅盘4，底部放置适量多环芳烃5，底物上方放置隔帘3，将塑料材质的底物吸附内衬1置于隔帘3上平整铺好，用盖板2将浅盘4封闭；根据多环芳烃的种类，设定电炉加热温度及保温时间，得到在表面均匀吸附多环芳烃晶体的内衬。隔帘3的网状结构有利于多环芳烃晶体升华的蒸汽透过，进而吸附在铺在上面的底物吸附内衬1上；特氟龙材质几乎不吸附多环芳烃，可有效避免对多环芳烃的吸附而造成材料的损失；在浅盘4顶部用一个直径略大于浅盘4上沿直径的特氟龙材质盖板2置于浅盘4之上并封闭，防止多环芳烃升华蒸汽的溢出。
具体的，以菲为例，熔点是99-101℃，因此加热温度选95℃为宜，根据环境温度的不同，依实验测定，升华吸附时间在30～50分钟内，可在内衬表面吸附均匀的一层菲晶体。时间过短，则吸附的晶体太少，时间过长，则吸附的晶体在内衬表面形成刺状突出结构，不利于实验操作。
实施例4吸附内衬对光路检测的影响
酶标仪对96孔板小孔中细菌浓度的检测，是通过600nm发射光和吸收光之间的光吸收之差，来判断细胞浓度的大小，示意图如图4所示。以下实验可用来判断内存加入到小孔中后，是否会对光路造成阻挡，造成读数的不准确。
实验分别采用超纯水、已知浓度细胞培养液和小孔中生长的细胞培养液来测试内衬对光路检测的影响。
(1)超纯水光吸收检测：首先选择96孔板的15个小孔，其中5个小孔是空白对照，取5个加入未吸附多环芳烃的内衬，取5个加入吸附了多环芳烃的内衬，然后，在每个小孔中注入等量的超纯水。然后，在酶标仪中以没加内衬的小孔为空白对照，对15个小孔进行批量光路扫描。结果如下：5个空白小孔的值为0.000，0.001，0.000，0.002，0.000，5个加入未吸附多环芳烃的内衬的小孔的值为0.001，0.000，0.002，0.000，0.001，5个加入吸附了多环芳烃的内衬的小孔的值为0.000，0.002，0.001，0.001，0.002。15组数据的变化主要集中在小数点最后一位，在酶标仪硬件误差范围内。因此，底物吸附内衬的加入，对酶标仪测量超纯水没有影响；
(2)对已知浓度细胞培养液的光吸收检测：选择96孔板的15个小孔，其中5个小孔是空白对照，取5个加入未吸附多环芳烃的内衬，取5个加入吸附了多环芳烃的内衬。取OD600为0.45的CFP312细胞培养液，等量加入到这15个小孔中。随后，对15个小孔进行批量光路扫描。结果如下：5个空白小孔的值为0.450，0.456，0.468，0.452，0.443，5个加入未吸附多环芳烃的内衬的小孔的值为0.452，0.459，0.467，0.441，0.462，5个加入吸附了多环芳烃的内衬的小孔的值为0.463，0.458，0.458，0.462，0.461。15组数据的误差≤0.5％，在误差允许范围内。因此，底物吸附内衬的加入，对酶标仪测量已知浓度细胞培养液没有影响。
(3)小孔中生长的细胞培养液光吸收的影响：选择96孔板的15个小孔，全部加入吸附的多环芳烃的内衬，在每个小孔加入等量的已接种OD600为0.1的CFP312后，在30℃下培养36h，随后，用酶标仪在OD600nm下批量检测15个小孔的吸光度，结果如下：0.365，0.378，0.396，0.341，0.359，0.362，0.348，0.364，0.373，0.386，0.366，0.353，0.367，0.321，0.368。15组数据的误差≤0.5％，在误差允许范围内。随后，再准备另外15个小孔，取出前5个小孔的培养液加入到没有内衬的小孔中，中间5个小孔的培养液加入到有未吸附底物的内衬的小孔中，后面5个小孔的培养液加入到有吸附了底物的内衬的小孔中。然后，用酶标仪在OD600nm下批量检测这15个小孔的吸光度。结果如下：0.368，0.368，0.388，0.341，0.355，0.345，0.332，0.354，0.367，0.388，0.375，0.364，0.377，0.340，0.372。与取出前相比，数据误差≤0.5％，在误差允许范围内。
以上结果说明，底物吸附内衬本身和吸附了底物之后的内衬，对酶标仪光路检测的影响都很小，其测量误差在可接受范围内，不会影响到实际测量。
实施例5 Moraxella osloensis CFP312降解突变菌株的批量筛选
将Moraxella osloensis CFP312接种于液体营养培养基中，30℃、150rpm震荡培养48h，8000rpm下冷冻离心2min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后制成菌悬液。调节菌悬液的OD600到0.1后备用。
将OD600为0.1的Moraxella osloensis CFP312菌悬液滴于温度保持在20℃的无菌金属铁片上。以氦气作为载体，功率为110w，氦气流量为10L/min。将金属贴片置于诱变室内，处理时间45s。诱变完成后，用无菌水洗脱菌膜，洗脱液用于单菌落分离。
高活性突变菌的分离步骤如下：采用稀释涂平板法将洗脱液稀释后涂营养琼脂平板。再30℃下培养18h，平板长出单菌落。采用已灭菌96孔板，在每个孔内塞入一个已经吸附了菲的底物吸附内衬，然后在小孔内注入1/3小孔体积的无机盐培养基。用接种针挑取单菌落接种到孔内无机盐培养基中，30℃下静止培养48h。
检测方法如下：将培养好的96孔板置于酶标仪下，在600nm波长下批量读取培养液的吸光度值。其中，吸光度值低于对照的，是负突变；吸光度值高于对照的，是正突变。其中，吸光度值高于对照30％以上的，是本发明所需的正突变，可用于后续多环芳烃的污染治理。
本发明提供的底物吸附内衬结构简单，提供的筛选方法操作简便，高通量，成本低廉，检测方法简单直观，适用范围广，易于推广。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多环芳烃底物吸附内衬，其特征在于：所述底物吸附内衬为中空圆柱形或者中空方柱形，其外径比96孔板小孔内径小0.5～1.0mm，壁厚为0.1～0.3mm，柱高为3～7mm，壁体设有多个圆形或椭圆形通孔；所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直径或长轴为0.5～1.0mm；
所述多环芳烃包括萘、菲、荧蒽、蒽和苯并(a)芘；所述底物吸附内衬的材质为塑料或碳纤维。
2.根据权利要求1所述的多环芳烃底物吸附内衬，其特征在于：所述96孔板小孔内径为10.7±0.2mm，所述底物吸附内衬的外径为10.0±0.2mm，壁厚为0.2～0.3mm，柱高为5.5～6.5mm，所述通孔的直径或长轴为0.75～0.85mm。
3.根据权利要求1所述的多环芳烃底物吸附内衬，其特征在于：所述96孔板小孔内径为6.8±0.2mm，所述底物吸附内衬的外径为6.0±0.2mm，壁厚为0.1～0.2mm，柱高为3.5～4.5mm，所述通孔的直径或长轴为0.55～0.65mm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多环芳烃底物吸附内衬的吸附方法，其特征在于：包括如下步骤：在可调恒温电炉上放置容器，在容器内铺满干燥的加热介质，在加热介质上放置一耐热玻璃浅盘，底部放置适量多环芳烃晶体，底物上方放置隔帘，将塑料内衬置于隔帘上平整铺好，用盖板将浅盘封闭；根据多环芳烃的种类，设定电炉加热温度及保温时间，得到在表面均匀吸附多环芳烃晶体的内衬。
5.根据权利要求4所述的多环芳烃底物吸附内衬的吸附方法，其特征在于：所述加热介质为过100目筛的河沙；所述隔帘为特氟龙材质，呈网状结构；所述盖板为特氟龙材质。
6.一种筛选多环芳烃降解突变菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1)将多环芳烃降解菌悬液滴于温度保持在20～30℃的无菌金属铁片上，置于诱变室内，以氦气作为载体，功率为100～120w，氦气流量为9～11L/min，处理时间15～150s；
S2)诱变完成后，用无菌水洗脱菌膜，采用稀释涂平板法将洗脱液稀释后涂营养琼脂平板，在28～32℃下培养18～24h，平板长出单菌落后，取已灭菌96孔板，取权利要求1至3中任一项所述的多环芳烃底物吸附内衬吸附多环芳烃后，置于96孔板小孔内，然后在小孔内注入无机盐培养基，用接种针挑取单菌落接种到96孔板小孔的无机盐培养基中，28～32℃下静止培养24～72h；
S3)将培养结束后的96孔板置于酶标仪下检测培养液的吸光度值；其中，吸光度值低于对照的，是负突变；吸光度值高于对照的，是正突变。
7.根据权利要求6所述的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，其特征在于：所述多环芳烃降解菌采用Moraxella osloensis CFP312，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60595。
8.根据权利要求6所述的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，其特征在于：所述酶标仪的检测波长为600nm。
9.根据权利要求6所述的筛选多环芳烃降解突变菌的方法，其特征在于：所述无机盐培养基包括如下组分：Na2HPO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L、(NH4)2SO41g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeCl3·3H2O 0.005g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L。
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