CN106434413B - 一种植生拉乌尔菌以及利用该菌降解土壤中芘的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途以及方法。该株微生物具有降解多环芳烃芘的能力，可以用于土壤中多环芳烃的降解，该株微生物不属于现己公开用于多环芳烃降解的专利菌种的任何一种。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种利用新的微生物菌株，降解被多环芳烃污染土壤的方法。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类广泛分布于环境中的含有两个苯环以上的有毒有害污染物，主要来源于人类活动和能源利用过程。迄今为止，多环芳烃仍是数量最多的一类致癌物，在1000多种致癌物中，PAHs占1/3以上，美国环保局已把16种多环芳烃列入优先控制的有毒有机污染物的黑名单中。石油、煤、木材等的燃烧过程和石油、石油化工的生产过程及海上石油开发与石油运输中的溢油等均会造成环境中PAHs的污染，这些PAHs通过废水灌溉、大气降尘等多种途径又进一步导致对土壤的污染。其中，芘(Pyrene，PYR)为四环多环芳烃代表物，在土壤中占有较大的比重，具有遗传毒性，属于美国环保局优先控制的多环芳烃之一。
通过废水灌溉、大气降尘等多种途径PAHs进入土壤，近100-150年来，由于化石燃料燃烧和工业的快速发展，土壤PAHs的浓度在不断增加。我国沈抚灌区、天津污灌区、长江三角洲地区、广州市郊耕地土壤均有PAHs积累。土壤中的多环芳烃可以通过接触直接进入人体，或在一定条件下进入大气、水和生物等其他环境介质，危及人类的健康。因此农业环境中PAHs的去除是保障人体健康和农业可持续发展必须解决的问题。
生物修复具有经济性强、二次污染少，去除效率高等显著优点，是迄今为止处理烃类污染水体和土壤效果最好的一种方法，在解决PAHs污染问题上具有广阔的应用前景。基于我国土壤PAHs污染现状和环保要求，低费用、高效率的生物修复技术具有很强的工业可行性，将会产生巨大的社会效益和经济效益。
生物修复技术最关键的是寻找具有修复功能的微生物，即筛选具有降解多环芳烃的菌株，这将有助于去除环境中PAHs污染，保障农产品安全和人体健康，促进我国经济和环境可持续发展进程。多环芳烃的微生物降解难易程度取决于化学结构的复杂性和降解酶的适应程度，不同的微生物对各类多环芳烃有不同的降解能力。一般说来，PAHs降解性随苯环数量增加而降低。目前，虽已筛选到许多对低环数PAHs的降解菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、黄杆菌属(Flavobacteria)、气单胞菌属(Aeromonas)、微球杆菌属(Micrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)等细菌；毛霉菌(mucor sp.)、青霉菌(penicillium sp.)、镰刀菌(fusariumsp.)等真菌；对于四环及四环以上PAHs降解菌有红球菌(Rhodococcus sp.)、微动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)和脱氮产碱菌(Alcaligenes denitrificans)，这些菌株具有一定的降解四环及以上多环芳烃能力，但未见植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)降解多环芳烃芘的报道。
发明内容
本发明目的是，针对目前对四环和四环以上PAHs的降解菌株资源仍需发掘的实际情况，提供一种降解四环多环芳烃芘效能较高的新微生物菌株。其次，是提供一套将该菌株应用于四环多环芳烃芘污染土壤的方法。
一方面，本发明提供一种保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M 2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途。
另一方面，本发明提供一种筛选能够降解多环芳烃芘的微生物的方法，该方法包括如下步骤：称取少量土样加入到100ml的筛选培养基中,逐渐提高芘浓度,培养21天后，取上清液均匀涂布于降解菌筛选固体培养基上(芘浓度为100mg/L)，将挑取长势旺盛的菌落，分离获得4株可降解多环芳烃的菌株；经进一步复筛，最终得目标菌株PL7。
本发明筛选得到的菌株PL7，利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株进行了94种表型测试，经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用1种碳源，对其他70种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株对10种化学物质敏感。
16S rDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物:p16S-8:5'-aga gtttga tcc tgg ctc ag-3'和p16S-1541:5'-aag gag gtg atc cag ccg ca-3'扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1374bp，将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为KU668567)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)的同源性最高(homology,99％/1374bps,based on 16S rDNA)。
经上述Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株PL7为植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)。
一种利用新菌株植生拉乌尔菌降解土壤中多环芳烃芘的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)培养基的配制：蔗糖0.5-8.0g，硫酸铵1.0-5.0g，磷酸二氢钾1.0-8.0g，七水硫酸镁0.1-1.0g，氯化钠0.1-1.0g，酵母粉0.5-5.0g，碳酸钙0.5-5.0g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值4.0-8.0，经灭菌后，备用；
(2)菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola) 新菌株PL7(CCTCC No.M 2016061)活化、培养后，得到菌液，备用；
(3)菌种发酵培养：将步骤(2)菌液按体积5％接种量接入步骤(1)培养基中；在20℃-40℃，初始pH 4.0-8.0，振荡条件下培养24h-72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；
(4)土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)菌体与含多环芳烃芘的土壤样品按重量5-50︰100的比例，混合，利用菌体降解4-10d；
(5)土壤样品中芘含量的分析检测：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行多环芳烃芘的含量进行分析：土壤样品10.00g加入40.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液20.00mL入平底烧瓶，旋转蒸干，用2.00mL环已烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱(2克硅胶，加入15mL正已烷，湿法装柱)，用正已烷/二氯甲烷混合液(v/v＝1:1)洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：色谱柱为PAH专用柱，流动相为乙腈：水＝70：30，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘的保留时间为10.3min，可测定出样品中芘的含量,并计算出菌种对多环芳烃芘的降解率。
优选的，所述的方法，其中所述培养基为：蔗糖5.0g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾8.0g，七水硫酸镁1.0g，氯化钠1.0g，酵母粉2.0g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0。
优选的，所述的方法，其中所述培养条件为：温度30℃，初始pH为7.0，在搅拌、通风、振荡条件下培养48h。
有益效果
一、本发明从微生物群中筛选得到可降解多环芳烃芘的植生拉乌尔菌PL7：CCTCCNo.M 2016061，其在适合条件下，能有效降解多环芳烃芘。该株微生物具有降解多环芳烃芘的能力，可以用于土壤中多环芳烃的降解，该株微生物不属于现己公开用于多环芳烃降解的专利菌种的任何一种。
二、本发明将植生拉乌尔菌株PL7用于土壤中多环芳烃芘的降解实验，结果表明，该菌可有效降解土壤中的多环芳烃芘，10天内芘最高降解率达到68.3％(见实施例3、4、5、6)，因此该菌在降解土壤中多环芳烃芘的领域具有较广泛的应用前景。
生物样品材料保藏说明
植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株PL7已保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2016061，保藏日期为：2016年1月25日。
附图说明
图1为本发明分离的植生拉乌尔菌的16SrDNA基因序列图。
具体实施方案
通过下面实施例旨在对本发明作进一步的详细说明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中采用的：
微生物：为植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)PL7CCTCC No.M 2016061；
多环芳烃芘：美国SUPELCO公司，纯度为92.2％
实施例1：(新菌株PL7的筛选)
本发明从浙江省杭州市某汽车修理站烃类化合物长期污染的区域取土壤样品1份，用于筛选菌种；筛选的具体方法是：称取20g土样加入到250ml的筛选培养基中(芘浓度为50mg/L)，30℃振荡培养，每3天提高芘浓度(浓度为50mg/L)，培养10天后，取上清液稀释处理后，取各梯度稀释液100μL，均匀涂布于降解菌筛选固体培养基上(芘浓度为100mg/L)，30℃培养，2天后，将挑取长势旺盛的菌落，进一步划线分离纯化，共分离获得4株可降解多环芳烃的菌株；经进一步复筛，最终得目标菌株PL7。将该4株菌株先分别按5％接种量投入发酵培养基培养24h后，再向培养基中加入终浓度为100mg/L的多环芳烃芘，并继续培养3天后，分别测定多环芳烃芘的降解率，从中筛选出降解能力最强的菌株PL7，作为进一步研究的出发菌株；
所述筛选培养基为：硫酸铵1.0g，磷酸二氢钾2.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，酵母粉0.5g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0。
所述发酵培养基配方为：蔗糖8.0g，硫酸铵1.0g，磷酸二氢钾2.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，酵母粉0.5g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0。
实施例2：(新菌株PL7的鉴定)
对实施例1筛选得到的菌株PL7进行Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株接种于特定的平板培养基，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至98％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog GENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用1种碳源，对其他70种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株对10种化学物质敏感。Biolog鉴定结果如表1和表2所示。
按精编分子生物学实验指南方法提取菌株PL7染色体DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物16S-8：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和16S-1541:
表1.菌株对Biolog GENⅢ板上71种碳源的利用能力
Notes:+,positive；-,negative；B,borderline
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA扩增菌株的16SrDNA基因，将基因产物同T载体连接后，后委托上海桑尼对该菌16S rDNA扩增及测序(SEQ NO.1)，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列，并进行同源性比对。基于生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，确定菌株PL7为植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)，此株菌已于2016年保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2016061。
表2.菌株对Biolog GENⅢ板上23种化学物质的化学敏感
Notes:+,positive；-,negative；B,borderline
实施例3：(利用菌株PL7降解土壤中多环芳烃芘的方法1)
按以下步骤进行：
(1)培养基的配制：蔗糖5.0g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾8.0g，七水硫酸镁1.0g，氯化钠1.0g，酵母粉2.0g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0，经灭菌后，备用；
(2)菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)新菌株PL7CCTCC No.M 2016061活化、培养后，得到菌液，备用；
(3)菌种接种与发酵培养：将步骤(2)菌液采用斜面接入步骤(1)培养基中，接种量为5％(v/v)，在30℃，180r/min培养条件下，培养48h，离心分离获得菌体；
(4)土壤样品的接种与降解：将步骤(3)得到的菌体以重量10％的比例加入含有10mg/kg芘(多环芳烃芘)的土壤样品中，利用菌体分解10d；另设含有10mg/kg芘的土壤样品不接菌体为对照；
(5)土壤样品中芘含量的分析检测：土壤样品中芘含量的分析检测：土壤样品10.00g加入40.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液20.00mL入平底烧瓶，旋转蒸干，用2.00mL环已烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱(2克硅胶，加入15mL正已烷，湿法装柱)，用正已烷/二氯甲烷混合液(v/v＝1:1)洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：色谱柱为PAH专用柱，流动相为乙腈：水＝70：30，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘的保留时间为10.3min。经测定对照土壤样品中芘含量为9.85mg/kg，接种土壤样品中芘残留量为3.12mg/kg，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤芘含量-接种土壤芘含量)/未接种的土壤芘含量*100的公式计算，经计算，确定菌种对芘降解率为68.3％。
实施例4：(利用菌株PL7降解土壤中多环芳烃芘的方法2)
(1)、培养基的配制：蔗糖1.0g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.1g，氯化钠0.5g，酵母粉5.0g，碳酸钙5.0g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为8.0，经灭菌后，备用；
(2)、菌种的活化培养：同实施例3；
(3)、菌种接种与发酵培养：将步骤(2)菌液采用斜面接入步骤(1)培养基中，接种量为5％(v/v)，在35℃，180r/min培养条件下，培养24h，离心分离获得菌体；
(4)、土壤样品的接种与降解：将步骤(3)得到的菌体以重量20％的比例加入含有10mg/kg芘(多环芳烃芘)的土壤样品中，利用菌体分解5d；另设含有10mg/kg芘的土壤样品不接菌体为对照；
(5)、土壤样品中芘含量的分析检测：测定方法同实施例3；经测定对照土壤样品中芘含量为9.82mg/kg，接菌种土壤样品中芘残留量为4.65mg/kg，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤芘含量-接种土壤芘含量)/未接种的土壤芘含量*100的公式计算，经计算，确定菌种对芘降解率为55.9％。
实施例5：(利用菌株PL7降解土壤中多环芳烃芘的方法3)
(1)、培养基的配制：蔗糖8.0g，硫酸铵1.0g，磷酸二氢钾2.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，酵母粉0.5g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0，经灭菌后，备用；
(2)、菌种的活化培养：同实施例3；
(3)、菌种的发酵培养：将步骤(2)菌液按5％接种量(v/v)接入步骤(1)培养基中，在培养条件25℃，在180r/min下培养72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；
(4)、土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)得到的菌体按重量5％的比例加入含有10mg/kg芘的土壤样品中，利用菌体分解3d；另设含有10mg/kg芘的土壤样品不接菌体为对照；
(5)、测定方法同实施例3；经测定对照土壤样品中芘含量为9.25mg/kg，接种土壤样品中芘残留量为5.15mg/kg，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤芘含量-接种土壤芘含量)/未接种的土壤芘含量*100的公式计算，该菌种对芘的降解率为44.4％。
实施例6：(菌株PL7对多环芳烃芘底物浓度为20mg/L降解效果的测定)
(1)、培养基的配制：培养基配方为：蔗糖5.0g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾8.0g，七水硫酸镁1.0g，氯化钠1.0g，酵母粉2.0g，碳酸钙0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH为7.0，灭菌冷却至室温后，备用；
(2)、菌种的活化培养：取100mL上述培养基，平均分装在2个250ml三角瓶中，灭菌；分别接入斜面菌种CCTCC No.M 2016061，培养菌体，摇床转速180r/min，在35℃摇床培养24h作为种子液，备用；
(3)、菌种发酵培养与多环芳烃芘降解：取步骤(1)培养基，平均分装入250mL摇瓶中，每瓶装入培养液50mL，灭菌；接入步骤(2)种子液，接种量为2.0％(v/v)，进行培养，培养温度为30℃，摇床转速180r/min；培养2d后，向培养基中添加芘终浓度为20mg/L，继续培养4d；另设含有20mg/L芘的发酵液不接菌体为对照；
(4)、发酵液中多环芳烃芘浓度的测定：从步骤(3)摇瓶中分别取20mL发酵液按以下方法进行测定：12000rpm，离心10min去除细胞，吸取上清液10.00mL入分液漏斗中，用二氯甲烷30、20和20ml分三次萃取，萃取液合并于平地烧瓶中，40℃浓缩近干、乙腈定容5ml，再稀释10倍后进行高效液相色谱分析：色谱柱为PAH专用柱，流动相为乙腈：水＝70：30，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘的保留时间为10.3min，测定液体中芘的浓度，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤芘含量-接种土壤芘含量)/未接种的土壤芘含量*100的公式计算，经测定未接种发酵液中芘含量为19.25mg/L，接种发酵液中芘残留量为9.01mg/L，经计算，确定菌种对芘降解率为53.2％。
<110> OrganizationName : 浙江科技学院
<120> Title : 一种植生拉乌尔菌以及利用该菌降解土壤中芘的方法
<213> OrganismName : 植生拉乌尔菌(Raoultella planticola）
<400> PreSequenceString :
ctcgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga 60
taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaagt gggggacctt 120
cgggcctcat gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaatggctc 180
acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca 240
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gaaggcatta aggttaataa ccttagtgat tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta 420
actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc 480
gtaaagcgca cgcaggcggt ctgttaagtc agatgtgaaa tccccgggct caacctggga 540
actgcatttg aaactggcag gcttgagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc 600
ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga 660
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ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg 840
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aacccttatc ctttgttgcc agcgattcgg tcgggaactc aaaggagact gccagtgata 1080
aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca 1140
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atcgtagatc agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgct 1374
Claims (2)
1.一种保存在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNO.M2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株在降解多环芳烃芘的用途。
2.一种利用植生拉乌尔菌降解土壤中多环芳烃芘的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)、培养基的配制：蔗糖0.5-8.0g，硫酸铵1.0-5.0g，磷酸二氢钾1.0-8.0g，七水硫酸镁0.1-1.0g，氯化钠0.1-1.0g，酵母粉0.5-5.0g，碳酸钙0.5-5.0g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH值4.0-8.0，经灭菌后，备用；
(2)、菌种的活化培养：采用步骤(1)培养基，将植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)的菌株活化、培养后，得到菌液，备用；
(3)、菌种发酵培养：将步骤(2)菌液按体积5％接种量接入步骤(1)培养基中；在20 ℃-40 ℃， 初始pH4.0-8.0，振荡条件下培养24h-72h，至菌体对数生长期后，进行离心分离，得到菌体；
(4)、土壤样品接菌种与降解：将步骤(3)菌体与含多环芳烃芘的土壤样品按重量5-50︰100的比例，混合，利用菌体降解4-10d；
(5)、土壤样品中芘含量的分析检测：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行多环芳烃芘的含量进行分析：土壤样品10.00g加入40.00mL二氯甲烷，40℃以下超声提取2h，离心，吸取上清液20.00mL入平底烧瓶，旋转蒸干，用2.00mL环已烷溶解，吸取0.50mL上硅胶柱，其中，硅胶柱为2克硅胶，加入15mL正已烷，湿法装柱，用体积比为1:1的正已烷和二氯甲烷混合液洗脱，弃去第一组分1.00mL，收集第二组分2.00mL，用纯氮吹干，乙腈定容，进行高效液相色谱分析：色谱柱为PAH专用柱，流动相为乙腈：水＝70：30，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量5.0μL，激发波长为250nm、发射波长为385nm下对样品进行检测，芘的保留时间为10.3min，可测定出样品中芘的含量,并计算出菌种对多环芳烃芘的降解率，其中，所述的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)的菌株为在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNo.M2016061的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)菌株。
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