CN114480189A - 一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用，所述复合菌剂为海杆菌（Marinobacter sp.）HWP‑1、海杆菌（Marinobacter sp.）HWP‑2、芽孢杆菌（Bacillus sp.）HWP‑3和芽孢杆菌（Bacillus sp.）HWP‑4复配，所述海杆菌（Marinobacter sp.）HWP‑1、所述海杆菌（Marinobacter sp.）HWP‑2、所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）HWP‑3和所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）HWP‑4均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号分别为CCTCC NO:M 20211335，CCTCC NO:M 20211336，CCTCC NO:M 20211337和CCTCC NO:M 20211338。将本发明复合菌剂用于石油烃类污染盐碱土壤的修复，可显著降低总石油烃及其主要组分烷烃和芳烃的含量，且在电场强化作用下可提高石油烃类污染物的去除效率。

Description

一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机污染土壤修复技术领域，具体涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
在石油的开采、加工及运输过程中，难免会有石油烃类的溢出和排放。被溢出和排放的石油烃经过废气沉降、地表径流等方式进入土壤。积累到土壤中的高浓度烃，不仅会破坏土壤自身的结构，改变其理化性质，还可在农产品中积累，影响作物的产量和品质，并通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康和生命安全。由于石油化工行业往往产生大量高盐度废水，因而石油污染土壤常伴有盐碱化的发生。因此，如何修复石油污染盐碱土壤，保障人类健康，成为当前国内外研究的热点。
在众多的石油污染修复方法中，微生物修复技术以其操作简单，处理费用低，环境影响小等优点受到世界各国的重视。目前，国内外已从石油污染土壤中分离筛选出了大量的石油降解菌株，但是石油组成成分复杂，靠单一的微生物菌株很难实现石油烃类污染物的完全降解，这也是目前相关研究一直停滞不前的原因。此外，这些石油降解菌株对烷烃类成分的生物降解效率往往高于芳烃类成分，使得芳烃尤其是高环多环芳烃相对比例增加，导致后期修复难度越来越大。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用，该复合菌剂用于石油烃类污染盐碱土壤的修复，可显著降低污染物的含量，且在电场强化过程中可提高石油烃类污染物的去除效率。本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种微生物复合菌剂，所述复合菌剂为海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4复配，所述海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、所述海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号分别为CCTCC NO:M20211335，CCTCC NO:M 20211336，CCTCC NO:M 20211337和CCTCC NO:M 20211338。
进一步地，所述微生物复合菌剂中，海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4菌液的体积比为(1.5～3)：(1.5～3)：(0.5～1)：(0.5～1)，四株菌的活细胞浓度均为107～109CFU/mL。
第二方面，本发明提供上述微生物复合菌剂的制备方法，包括：
(1)分别配制牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基和无机盐培养基，并控制这三种培养基的盐度为5％、pH为8.6；
(2)将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4分别接种于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，于30±1℃条件下培养48～72h进行活化；
(3)将活化后的菌体，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30±1℃、140r/min条件下振荡培养48～72h得到种子液；
(4)将种子液按照5％～10％的接种量接入无机盐培养基中，于30±1℃、140r/min条件下振荡培养48～72h制得各菌株的菌液，然后将各菌株菌液混合均匀。
进一步地，所述牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基按照终浓度的组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 43.5g/L，MgCl2·6H2O 6.5g/L，琼脂20g/L。
进一步地，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基按照终浓度的组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 43.5g/L，MgCl2·6H2O 6.5g/L。
进一步地，所述无机盐培养液按照终浓度的组成为：(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、葡萄糖0.05g/L、NaCl 43.5g/L、MgCl2·6H2O 6.5g/L和微量元素FeSO4·7H2O 0.012g/L、MnSO4·7H2O 0.003g/L、ZnSO4·7H2O 0.003g/L、CoSO4·7H2O 0.001g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L，石油50g/L。
第三方面，本发明提供上述微生物复合菌剂在修复石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤中的应用。
进一步地，所述应用的方法包括：将石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤中添加微生物复合菌剂混匀，使土壤中微生物数量达到107～109CFU/g，土壤盐分和pH值分别为1～1.5％和8.0～9.0，并控制土壤含水量为12％～18％。
优选地，对混有微生物复合菌剂的石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤施加0.8～1.5V/cm的直流电场，电极极性每10～30min切换一次，处理时间不少于100天。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的微生物复合菌剂所涉及的四株降解菌对石油中含有的总石油烃和高环多环芳烃均具有较高的降解能力，且对不同盐碱度具有广泛的适应性，可生长的盐度范围达0～15％或0～20％，可生长的pH范围达5～10或5～11，可用于不同盐碱度的石油烃类污染土壤的修复。
(2)本发明的微生物复合菌剂在修复过程中可综合不同菌在降解石油烃不同组分过程中的协同性，解决修复过程中高环多环芳烃相对比例逐渐增加导致后期修复难度逐渐增大的问题，提高石油烃类污染物的降解效率。
总之，将本发明复合菌剂用于石油烃类污染盐碱土壤的修复，可显著降低总石油烃及其主要组分烷烃和芳烃的含量，且在电场强化作用下可提高石油烃类污染物的去除效率。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中复合菌剂和单菌液对石油烃的降解率；
图2为本发明实施例2中复合菌剂和单菌液对多环芳烃的降解率；
图3为本发明实施例3中由HWP-1、HWP-2、HWP-3和HWP-4构成的复合菌剂及其在电场强化作用下修复石油污染盐碱土壤和芘污染盐碱土壤的过程中总石油烃和芘含量变化；
图4为本发明实施例3中复合菌剂及其在电场强化作用下修复石油污染盐碱土壤的过程中石油烃不同组分含量变化；
图5为本发明实施例3中复合菌剂及其在电场强化作用下修复石油污染盐碱土壤的过程中微生物群落结构；
图6为本发明实施例4中由HWP-1和HWP-3构成的复合菌剂及其在电场强化作用下修复石油污染盐碱土壤的过程中总石油烃含量变化；
图7为本发明实施例5中由HWP-2和HWP-4构成的复合菌剂及其在电场强化作用下修复石油污染盐碱土壤的过程中总石油烃含量变化；
图8为本发明实施例6中由HWP-1、HWP-2、HWP-3和HWP-4构成的复合菌剂及其在电场强化作用下修复油田区石油污染土壤和化工园区多环芳烃污染土壤的过程中总石油烃浓度变化和多环芳烃降解率；
注：图1、2、4中不同字母表示不同处理间有显著性差异，相同字母则表示无显著性差异。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
在本发明的具体实施例中，海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4的获取过程具体如下：
一、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1的获取
(1)菌株的富集、纯化
土壤样品为采自延长油田子北采油厂的石油污染土壤。以芘为唯一碳源，采用定时定量转接、逐步提高碳源浓度的方法对多环芳烃降解菌进行富集。具体为：称取5g石油污染土壤，加入到45mL无机盐培养液中，加入芘母液使芘的终浓度为25mg/L，30℃恒温摇床避光富集培养5d；取菌液5mL，加入到45mL新鲜的无机盐培养液中，加入芘母液，使芘的终浓度为50mg/L，30℃恒温摇床避光富集培养5d。采用同样的方法，将芘的浓度依次提高，直至100mg/L，并分别在30℃恒温摇床避光富集培养5d。
将最后一次富集培养的菌液用无机盐培养液进行梯度稀释，取稀释液100μL涂布于无机盐固体培养基上，30℃培养至有肉眼可见的明显菌落，根据菌落外部形态，挑取其中生长旺盛的单菌落进一步于无机盐固体培养基平板中纯化，如此反复多次，直至分离出纯菌。再将该菌落接种于含芘的无机盐培养液中培养以验证其是否能以芘为唯一碳源生长。纯化后的菌种保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面中。
所述培养基盐度均为5％，pH均为8.6，配制方法如下：
无机盐培养液：(NH4)2SO4 1g、K2HPO4 0.8g、KH2PO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H2O 0.1g、葡萄糖0.05g、NaCl 43.5g、MgCl2·6H2O 6.5g和微量元素FeSO4·7H2O0.012g、MnSO4·7H2O 0.003g、ZnSO4·7H2O 0.003g、CoSO4·7H2O 0.001g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g，蒸馏水定容至1L，pH为8.6，121℃灭菌20min。
无机盐固体培养基：上述无机盐培养液中加入2％的琼脂，pH 8.6，121℃灭菌20min，制作培养基平板，待其凝固后取0.5mL已过滤除菌的芘母液(5g/L)涂于表面，待溶剂挥发后形成一层芘的固体膜。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 43.5g，MgCl2·6H2O 6.5g，蒸馏水定容至1L，pH 8.6，121℃灭菌20min。
所述芘母液的配制：以丙酮为溶剂，配制5g/L的芘的丙酮溶液，并用已灭菌(121℃，20min)的0.22μm有机滤膜过滤除菌。
(2)菌种的鉴定
①发明菌株菌落特征为圆点状、透明、边缘不规则；细胞形态为长杆状、无芽孢。
②对发明菌株进行生理生化鉴定，接触酶实验和淀粉水解实验均呈阳性，具有运动性，吲哚实验、NaNO3还原反应、明胶水解实验、NaNO2还原反应，脂酶反应及革兰氏染色均呈阴性。
③将发明菌株交由测序公司进行16S rRNA序列测定，将序列信息输入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行BLAST分析，与海杆菌属(Marinobactersp.)中的多个菌种基因序列相似性达99％以上。通过与基因库中典型模式菌株序列构建系统发育树，结合①中菌落和细胞形态特征以及②中生理生化特征，进一步确定发明菌株为Marinobactersp.属。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为Marinobacter sp.HWP-1，保藏登记号为CCTCC NO:M 20211335。
二、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2的获取
(1)菌株的富集、纯化
菌株的富集、纯化方法同海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1的获取。
(2)菌种的鉴定
①发明菌株菌落特征为点状，透明，边缘整齐；细胞形态为短杆状，无芽孢。
②对发明菌株进行生理生化鉴定，接触酶实验、NaNO3还原反应、明胶水解实验和NaNO2还原反应均呈阳性，具有运动性，吲哚实验、淀粉水解实验、脂酶反应及革兰氏染色均呈阴性。
③将发明菌株交由测序公司进行16S rRNA序列测定，将序列信息输入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行BLAST分析，与海杆菌属(Marinobactersp.)中的多个菌种基因序列相似性达99％以上。通过与基因库中典型模式菌株序列构建系统发育树，结合①中菌落和细胞形态特征以及②中生理生化特征，进一步确定发明菌株为Marinobactersp.属。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为Marinobacter sp.HWP-2，保藏登记号为CCTCC NO:M 20211336。
三、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3的获取
(1)菌株的富集、纯化
菌株的富集、纯化方法同海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1的获取
(2)菌种的鉴定
①发明菌株菌落特征为小点状，淡黄色，边缘光滑，中间突起；细胞形态为杆状、有芽孢。
②对发明菌株进行生理生化鉴定，接触酶实验、淀粉水解实验、NaNO3还原反应、NaNO2还原反应、明胶水解实验、革兰氏染色均呈阳性，具有运动性，吲哚实验和脂酶反应均呈阴性。
③将发明菌株交由测序公司进行16S rRNA序列测定，将序列信息输入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行BLAST分析，与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中的多个菌种基因序列相似性达99％以上。通过与基因库中典型模式菌株序列构建系统发育树，结合①中菌落和细胞形态特征以及②中生理生化特征，进一步确定发明菌株为Bacillus sp.属。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为Bacillus sp.HWP-3，保藏登记号为CCTCC NO:M 20211337。
四、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4的获取
(1)菌株的富集、纯化
菌株的富集、纯化方法同海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1的获取
(2)菌种的鉴定
①发明菌株菌落特征为菌落形态不规则，边缘裂纹状，中间扁平，白色不透明；细胞形态为短杆状、有芽孢。
②对发明菌株进行生理生化鉴定，接触酶实验和NaNO3还原反应呈阳性，不具有运动性，淀粉水解实验、吲哚实验、明胶水解实验、NaNO2还原反应，脂酶反应及革兰氏染色均呈阴性。
③将发明菌株交由测序公司进行16S rRNA序列测定，将序列信息输入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行BLAST分析，与海杆菌属(Bacillus sp.)中的多个菌种基因序列相似性达99％以上。通过与基因库中典型模式菌株序列构建系统发育树，结合①中菌落和细胞形态特征以及②中生理生化特征，进一步确定发明菌株为Bacillus sp.属。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为Bacillus sp.HWP-4，保藏登记号为CCTCC NO:M 20211338。
实施例1
复合菌剂和单菌液对石油烃的降解能力
单菌液和复合菌剂的制备方法：将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4分别接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，30±1℃条件下培养48～72h进行活化。将活化后的菌体，接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h得到种子液。将种子液按照5％～10％的接种量接入盐度为5％、pH为8.6的以石油为唯一碳源的无机盐培养基，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h制得各菌株的菌液。将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4菌液按体积比3：3：1：1进行混合得到复合菌剂。
将上述复合菌剂及各单菌液分别按照体积比3％的接种量分别接入100mL石油含量为5％、pH为8.6的无机盐培养基中，30±1℃，140r/min条件下处理7天。每处理设三个重复，以未投加菌液为对照。处理结束后，萃取培养液中残留石油，计算石油去除率，对比混合菌液与单菌液总石油烃降解能力。
试验结果见图1。经过7天处理后，四种单菌液对石油的降解率为62.9％～73.5％，复合菌剂对石油的降解率为89.5％，比单菌液最高降解率提高了16.0％，未投加菌液的反应体系中，石油降解率仅为9.2％(对照)。结果表明，在摇瓶培养体系中，四种单菌液对石油烃有良好的降解能力，而复合菌剂比单一降解菌液具有更高的石油降解能力。
实施例2
复合菌剂和单菌液对多环芳烃的降解能力
各单菌液和复合菌剂的制备方法同实施例1。
将上述复合菌剂及各单菌液分别按照体积比3％的接种量分别接入100mL含有50mg/L芘和5mg/L苯并[a]芘的无机盐培养基中，30±1℃，140r/min避光振荡培养7天。每处理设三个重复，以未投加菌液为对照。处理结束后，分别测定芘和苯并[a]芘的含量，计算降解率，对比混合菌剂和单菌液对高环多环芳烃的降解能力。
从图2可以看出，经过7天处理后，四种单菌液对芘的降解率为46.9％～51.0％，复合菌剂对芘的降解率为68.1％，比单菌液最高降解率提高了17.0％，未投加菌液的反应体系中，芘降解率仅为9.7％(对照)。四种单菌液对苯并[a]芘的降解率为34.5％～45.4％，复合菌剂对苯并[a]芘的降解率为58.6％，比单菌液最高降解率提高了13.1％，未投加菌液的反应体系中，苯并[a]芘降解率仅为4.5％。结果表明，在摇瓶培养体系中，四种单菌液对芘和苯并[a]芘均有良好的降解能力，而复合菌剂比单一降解菌液具有更高的多环芳烃能力。
实施例3
海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4复合菌剂在石油污染盐碱土壤和高环多环芳烃污染盐碱土壤修复中的应用
复合菌剂的制备同实施例1。
试验土壤：本实施例分别采用自配石油污染土壤和芘污染土壤。所用土壤为砂质壤土，石油采自延长油田，芘(纯度>99％)购自上海麦克林生化科技有限公司。将土壤风干后过2mm筛，分别配制成含油量为45～50g/kg的石油污染土壤和250～300g/kg的芘污染土壤，室温下避光平衡至少两周。
复合菌剂修复：将复合菌液分别加入石油污染土壤和芘污染土壤中，使微生物数量达到107～109CFU/g，土壤盐分1.0％～1.5％、pH值8～9，土壤含水率16％～18％。将配制好的污染土壤装入PVC土壤箱(18cm×10cm×8cm)中。
电场-复合菌剂修复：将复合菌液分别加入石油污染土壤和芘污染土壤中，使微生物数量达到107～109CFU/g，土壤盐分1.0％～1.5％、pH值8～9，土壤含水率16％～18％。将配制好的污染土壤装入PVC土壤箱(18cm×10cm×8cm)中，将土壤压实，将两对石墨电极(15×1cm)插入土壤中，间距15cm，施加1.0～1.5V/cm的直流电场，每10min切换一次电极极性。
对照处理的石油污染土壤和芘污染土壤既不添加复合菌剂也不施加电场，但添加相同量的无机盐培养液，使土壤盐分达到1.0％～1.5％、pH值8～9，土壤含水率16％～18％。
试验过程中定期向土壤中加水，使土壤含水率保持在16％～18％。每10天采样一次，分别监测总石油烃及其不同组分含量变化和芘含量变化，试验共进行100天，同时，采用高通量测序技术监测100天后复合菌剂修复和电场-复合菌剂修复石油污染土壤中微生物群落结构。
石油污染土壤中总石油烃含量变化见图3a。复合菌剂处理后100天后，总石油烃含量明显降低，由初始的45.3g/kg降至25.4g/kg，降解率为44.0％。在电场-复合菌剂修复中，100天后总石油烃含量由初始的45.3g/kg降至16.9g/kg，降解率达62.6％。相较而言，对照中总石油烃降解率仅为10.1％，说明本发明复合菌剂对石油污染盐碱土壤有显著的修复效果，而电场的施加可促进复合菌剂的修复效能。
芘污染土壤中芘含量变化见图3b。复合菌剂处理后100天后，芘含量由初始的290.1mg/kg降至111.0mg/kg，降解率为61.8％。在电场-复合菌剂修复中，100天后芘含量由初始的290.1mg/kg降至70.9mg/kg，降解率达75.6％。对照中芘降解率仅为11.1％，说明本发明复合菌剂对高环多环芳烃污染盐碱土壤有明显的修复效果，而电场的施加可促进复合菌剂的修复效能。
石油污染土壤中石油不同组分含量变化见图4，复合菌剂处理后烷烃和芳烃含量均有明显的降低，降解率分别为54.6％和43.6％，在电场-复合菌剂修复中，烷烃和芳烃降解率分别为71.4％和59.8％，而对照中烷烃和芳烃降解率分别仅为13.2％和7.8％。说明本发明复合菌剂对石油不同组分均有良好的降解能力，而在电场的作用下该降解能力可以得到显著提升。
由图5可知，不管是在复合菌剂修复还是电动-复合菌剂修复过程中，相较于其它菌属，海杆菌属(Marinobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)均为优势菌属。其中，复合菌剂修复中，海杆菌属(Marinobacter)丰度为28.3％，芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度为17.4％；电动-复合菌剂修复中，海杆菌属(Marinobacter)丰度达30.4％，芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度为10.6％。表明由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4组成的复合菌剂在石油烃污染盐碱土壤修复过程中可保持为优势菌属，且在电场环境中也可保持为优势菌属，具有良好的应用前景。
实施例4
海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3复合菌剂在石油污染盐碱土壤修复中的应用
单菌液和复合菌剂的制备方法：将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3分别接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，30±1℃条件下培养48～72h进行活化。将活化后的菌体，接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h得到种子液。将种子液按照5％～10％的接种量接入盐度为5％、pH为8.6的以石油为唯一碳源的无机盐培养基，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h制得各菌株的菌液。将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3菌液按体积比3：1进行混合得到复合菌剂。
试验土壤的配制同实施例3。
复合菌剂修复、电场-复合菌剂修复和对照处理过程同实施例3。
试验过程中定期向土壤中加水，使土壤含水率保持在16％～18％。每10天采样一次，监测总石油烃含量变化，试验共进行100天。
总石油烃含量变化见图6。由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3构成的复合菌剂处理后100天后，总石油烃含量由初始的45.3g/kg降至27.1g/kg，降解率为40.2％。在电场-复合菌剂修复中，100天后总石油烃含量由初始的45.3g/kg降至19.3g/kg，降解率为57.4％。相较于对照中的10.1％而言，由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3构成的复合菌剂对石油污染盐碱土壤有显著的修复效果，电场的施加可促进该复合菌剂的修复效能，但其修复效果低于由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4构成的复合菌剂的修复效果。
实施例5
海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4复合菌剂在石油污染盐碱土壤修复中的应用
单菌液和复合菌剂的制备方法：将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4分别接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，30±1℃条件下培养48～72h进行活化。将活化后的菌体，接种于盐度为5％、pH为8.6的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h得到种子液。将种子液按照5％～10％的接种量接入盐度为5％、pH为8.6的以石油为唯一碳源的无机盐培养基，30±1℃，140r/min振荡培养48～72h制得各菌株的菌液。将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4菌液按体积比3：1进行混合得到复合菌剂。
试验土壤的配制同实施例3。
复合菌剂修复、电场-复合菌剂修复和对照处理过程同实施例3。
试验过程中定期向土壤中加水，使土壤含水率保持在16％～18％。每10天采样一次，监测总石油烃含量变化，试验共进行100天。
总石油烃含量变化见图7。由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4构成的复合菌剂处理后100天后，总石油烃含量由初始的45.3g/kg降至28.0g/kg，降解率为38.1％。在电场-复合菌剂修复中，100天后总石油烃含量由初始的45.3g/kg降至20.5g/kg，降解率为54.7％。相较于对照中的10.1％而言，由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4构成的复合菌剂对石油污染盐碱土壤有显著的修复效果，电场的施加可促进该复合菌剂的修复效能，但其修复效果低于由海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4构成的复合菌剂的修复效果。
实施例6
海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4复合菌剂在油田区石油污染土壤和工业园区多环芳烃污染土壤修复中的应用。
单菌液和复合菌剂的制备方法同实施例1。
试验土壤：采自延长油田的石油污染土壤和宁东工业园区某化工厂附近的多环芳烃污染土壤。其中，油田区土壤中石油烃浓度达3.5％(w/w)，pH为8.5，土壤盐分0.15％；工业园区土壤多环芳烃总含量约2850μg/kg，包含12种多环芳烃，环数为2～6。将土壤自然风干后过2mm筛备用。
复合菌剂修复、电场-复合菌剂修复和对照处理过程同实施例3。
试验过程中定期向土壤中加水，使土壤含水率保持在16％～18％。每10天测定一次油田区土壤中的总石油烃含量，试验共进行100天，100天后测定工业园区土壤中不同环数多环芳烃含量。
石油污染土壤中总石油烃含量变化见图8a。海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillussp.)HWP-4复合菌剂对油田区石油污染土壤表现出了良好的修复效果，100天后，总石油烃浓度由初始的3.5％降至2.1％，降解率为40.4％。在电场-复合菌剂修复中，100天后总石油烃浓度由初始的3.5％降至1.5％，降解率为57.3％。对照中总石油烃降解率仅为9.8％，说明本发明复合菌剂对油田区石油污染盐碱土壤有良好的修复效果，而电场的施加可促进复合菌剂的修复效能。
多环芳烃污染土壤中多环芳烃降解率见图8b。海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillussp.)HWP-4复合菌剂对工业园区不同环数多环芳烃表现出良好的修复效果，100天后，萘的降解率为84.3％，3环的二氢苊、苊和菲降解率为63.2％-94.9％，4环的荧蒽、芘和苯并[a]蒽降解率为60.3％-73.3％，5环的苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽降解率为30.8％-41.6％，6环的茚并[1,2,3-cd]芘和苯并[ghi]苝降解率为19.9％-23.5％。在电场-复合菌剂修复中，萘的降解率达96.9％，3环的二氢苊、苊和菲降解率达81.3％-99.5％，4环的荧蒽、芘和苯并[a]蒽降解率达75.8％-81.4％，5环的苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽降解率达43.7％-56.8％，6环的茚并[1,2,3-cd]芘和苯并[ghi]苝降解率达31.8％-32.2％。
综上，本发明复合菌剂可用于石油烃类污染盐碱土壤，能够显著降低总石油烃及其主要组分烷烃和芳烃的含量，同时，本发明复合菌剂也可用于多环芳烃污染土壤的修复，对2～6环多环芳烃具有不同程度的降解能力，且在电场强化作用下可提高污染物的去除效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种微生物复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂为海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4复配，所述海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、所述海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号分别为CCTCC NO:M20211335，CCTCC NO:M 20211336，CCTCC NO:M 20211337和CCTCC NO:M 20211338。
2.根据权利要求1所述的一种微生物复合菌剂，其特征在于：所述微生物复合菌剂中，海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillussp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4菌液的体积比为(1.5～3)：(1.5～3)：(0.5～1)：(0.5～1)，四株菌的活细胞浓度均为107～109CFU/mL。
3.权利要求1或2所述的一种微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：包括：
(1)分别配制牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基和无机盐培养基，并控制这三种培养基的盐度为5％、pH为8.6；
(2)将海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-1、海杆菌(Marinobacter sp.)HWP-2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-3和芽孢杆菌(Bacillus sp.)HWP-4分别接种于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，于30±1℃条件下培养48～72h进行活化；
(3)将活化后的菌体，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30±1℃、140r/min条件下振荡培养48～72h得到种子液；
(4)将种子液按照5％～10％的接种量接入无机盐培养基中，于30±1℃、140r/min条件下振荡培养48～72h制得各菌株的菌液，然后将各菌株菌液混合均匀。
4.根据权利要求3所述的一种微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基按照终浓度的组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 43.5g/L，MgCl2·6H2O 6.5g/L，琼脂20g/L。
5.根据权利要求3所述的一种微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基按照终浓度的组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 43.5g/L，MgCl2·6H2O 6.5g/L。
6.根据权利要求3所述的一种微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述无机盐培养液按照终浓度的组成为：(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、葡萄糖0.05g/L、NaCl 43.5g/L、MgCl2·6H2O 6.5g/L和微量元素FeSO4·7H2O 0.012g/L、MnSO4·7H2O 0.003g/L、ZnSO4·7H2O 0.003g/L、CoSO4·7H2O0.001g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L，石油50g/L。
7.权利要求权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或者权利要求3～6任意一项所述的制备方法获得的微生物复合菌剂在修复石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的方法包括：将石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤中添加微生物复合菌剂混匀，使土壤中微生物数量达到107～109CFU/g，土壤盐分和pH值分别为1～1.5％和8.0～9.0，并控制土壤含水量为12％～18％。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：对混有微生物复合菌剂的石油污染盐碱土壤或者多环芳烃污染土壤施加0.8～1.5V/cm的直流电场，电极极性每10～30min切换一次，处理时间不少于100天。
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