CN107523513B - 一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可快速降解17β‑雌二醇的复合菌及其制备方法和应用，所述复合菌由保藏编号为CGMCC No.12392的红球菌DSH和保藏编号为CGMCC No.15223的睾丸酮丛毛单胞菌QYY组成，所述红球菌DSH和所述睾丸酮丛毛单胞菌QYY的16S rDNA序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。分别将菌株DSH和菌株QYY接种到无机盐培养基中培养制得DSH菌液和QYY菌液，将DSH和QYY两种菌液的体积配比1.5∶1，得到高效降解17β‑雌二醇的复合菌。本发明提供的复合菌对17β‑雌二醇具有高效的降解性能，适应外界环境能力强。将复合菌培养在以17β‑雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中连续培养72h，能将浓度低于为50mg/L的17β‑雌二醇快速高效降解，降解率达到98％以上。

Description

一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用。
背景技术
环境激素作为一种常见的内分泌干扰物，与机体正常情况下分泌的雌性激素在结构和功能上类似。一旦进入机体，不仅可以扰乱机体正常的内分泌激素的合成与代谢，影响生长发育和性别分化，还能引起神经、内分泌、免疫等多系统发育异常和生殖障碍，甚至致畸和致癌等。
环境激素能够利用洋流和大气环流作用从低纬度地域转移至高纬度地域，甚至能够到达极地生态系统。另外，由于环境激素能通过食物链在高等生物体内富集和放大，对人类健康和动物生态安全产生巨大威胁。17β-雌二醇(17β-estradiol)，在众多的内分泌干扰物中被公认为是对环境的潜在影响和危害最大的几种雌激素之一。首先，污染范围广，在土壤以及河流中都检测到17β-雌二醇，且浓度达到ng/L级。其次，对人类健康和生态安全危害很大。因此，受到了国内外研究者的广泛关注。
目前，去除环境中17β-雌二醇的方法总体上可以分为物理方法、化学方法以及生物方法。物理方法主要是采用活性炭等吸附剂对17β-雌二醇进行吸附去除；化学方法是采用高级氧化法进行氧化处理，主要有电化学氧化法及催化氧化法等，其缺点是处理成本高，主要适用于养殖废水中激素的去除；生物方法主要是筛选、分离和驯化17β-雌二醇降解菌进行降解去除。生物方法具有运行成本低、不产生二次污染和污染物去除彻底等优点，也是目前污水处理厂雌激素去除和环境中受雌激素污染的水体和土壤的主要处理途径。关于采用生物法去除环境中雌激素的课题，国内研究起步相对较晚，而且，相关研究也主要集中在雌激素的毒理学研究、检测方法探索以及雌激素污染的风险评价上，对环境雌激素的微生物降解特性及降解机理的研究较少，急需开展广泛深入的研究。随着环境雌激素污染的日益加剧，探寻一种高效、经济和绿色的环境雌激素去除方法，对控制和治理环境雌激素污染具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用。该复合菌可稳定快速的降解17β-雌二醇，可有效用于17β-雌二醇的生物降解与环境修复。
一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌，由保藏编号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和保藏编号为CGMCC No.1.15223睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)QYY组成，所述红球菌(Rhodococcus sp.)DSH于2016年4月25日和所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY于2017年03月15日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
作为本发明进一步的方案：所述红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY 16S rDNA序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示。
本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌由以下方式获得：
1、菌种的筛选和培养
采集药厂污水处理厂的活性污泥作为微生物源，以17β-雌二醇为唯一碳源，将菌株培养在17β-雌二醇的浓度为5mg/L的无机盐培养基中，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中培养72h；从每个无机盐培养基取200μL菌液再加入新鲜无机盐培养基中(17β-雌二醇浓度为10mg/L)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d；从每个无机盐培养基取200μL菌液再加入新鲜无机盐培养基中(17β-雌二醇浓度为10mg/L)，在30℃，120rpm 的恒温振荡培养箱中连续培养7d。然后，再从每个无机盐培养基取200μL菌液再次加入新鲜无机盐培养基中(17β-雌二醇浓度为20mg/L)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d；按此方法将菌液接种到含有17β-雌二醇浓度分别为40mg/L、60mg/L、80mg/L、 100mg/L(重复三次)的新鲜无机盐培养基中培养；取1mL菌液用无菌水梯度稀释到 10-2～10-8，将经过不同梯度稀释的菌液涂布到LB琼脂培养基上，经过反复划线，最终得到纯化的红球菌DSH和睾丸酮丛毛单胞菌QYY。
上述降解17β-雌二醇的菌株的获取方法，其中，所述无机盐培养基的成分如下：NaHPO4 4.260g/L；KH2PO42.650g/L；MgSO4·7H2O 0.200g/L；(NH4)2SO41.500g/L；CaCl20.020g/L。用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl调pH为7。加入1mL的微量元素。
其中，微量元素的成分如下：NiCl2·6H2O 0.024g/L；CoCl2·6H2O 0.190g/L；H3BO30.006g/L；ZnCl20.070g/L；CuCl2·2H2O 0.002g/L；MnSO4·H2O 0.061g/L；Na2MoO4·2H2O0.024g/L。
其中，LB琼脂培养基的成分如下：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl 10g/L。待LB琼脂培养基完全溶解后，调pH为7.4。
2、菌种的鉴定
将两株细菌分别在LB琼脂培养基上划线，在恒温培养箱中培养24h，观察菌落大小和形态特征；将两株细菌进行革兰氏染色以及电子显微镜观察；将两株细菌进行革兰氏染色以及电子显微镜观察；将两株细菌进行16S rDNA鉴定。
菌株DSH经16S rDNA鉴定，并结合形态学特征和生理生化指标，被鉴定为红球菌(Rhodococcus sp.)，命名为红球菌(Rhodococcus sp.)DSH，保藏编号为CGMCC No.12392。
菌株QYY经16S rDNA鉴定，并结合形态学特征和生理生化指标，被鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，命名为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni) QYY，保藏编号为CGMCC No.1.15223。
3、复合菌的制备
将红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)QYY 从-80℃甘油管中挑取菌体在LB琼脂培养基上进行划线活化，将活化后的单菌落接种于LB 琼脂培养基中，经过分别扩大培养直至菌体浓度达到至少109cfu/ml以上；将所述的DSH 菌液和QYY菌液按体积配比1.5∶1混合均匀组成。
本发明另一目的是提供所述的复合菌在降解环境激素中的应用。
作为本发明进一步的方案：环境激素为17β-雌二醇。
本发明与现有技术相比有如下有益效果：
本发明提供的复合菌具有良好的协同效应，对17β-雌二醇具有高效的降解性能，适应外界环境能力强。将复合菌培养在以17β-雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中连续培养 72h，能将浓度低于为50mg/L的17β-雌二醇快速高效降解，降解率达到98％以上，可将其应用于处理环境中17β-雌二醇的污染。
附图说明
图1为本发明的红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)QYY在LB琼脂培养基上形态图，其中(a)为红球菌(Rhodococcus sp.)DSH，(b)为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY。
图2为本发明的红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)QYY的系统发育树，其中(a)为红球菌(Rhodococcus sp.)DSH，(b)为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY。
图3为本发明中红球菌(Rhodococcus sp.)DSH和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)QYY以及复合菌对17β-雌二醇的降解率结果图。
图4为本发明中温度对复合菌降解17β-雌二醇的影响结果图。
图5为本发明中pH对复合菌降解17β-雌二醇的影响结果图。
图6为本发明中有机物对复合菌降解17β-雌二醇的影响结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1降解17β-雌二醇细菌的获取与保藏
采集药厂和污水处理厂的泥样作为微生物源，冷藏运回实验室。并对样品进行唯一碳源培养。取15mg 17β-雌二醇溶于30mL甲醇中，制成浓度为500mg/L的17β-雌二醇母液。取1mL 17β-雌二醇母液加入到盛有100mL无机盐培养基的三角瓶中，使无机盐培养基中17β-雌二醇的终浓度为5mg/L(无机盐培养基组成g/L)：Na2HPO44.260；KH2PO42.650； MgSO4·7H2O 0.200；(NH4)2SO41.500；CaCl20.020。用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl 调pH为7.0，加入1mL的微量元素。微量元素组成(g/L)：NiCl2·6H2O 0.024；CoCl2·6H2O 0.190；H3BO30.006；ZnCl20.070；CuCl2·2H2O 0.002；MnSO4·H2O 0.061；Na2MoO4·2H2O 0.024。将三角瓶放入恒温水浴锅中，60℃水浴30min，使甲醇完全挥发。将三角瓶瓶口用纱布、牛皮纸密封后放入高压灭菌锅中，温度121℃，高压灭菌20min。将泥样按体积比 10％加入到盛有已灭菌的无机盐培养基的三角瓶中(无机盐培养基体积为90mL)。在30℃， 120rpm的恒温振荡培养箱中培养72h，每个无机盐培养基取200μL菌液加入新鲜无机盐培养基(17β-雌二醇浓度为10mg/L)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。然后，从每个无机盐培养基取200μL菌液加入新鲜无机盐培养基(17β-雌二醇浓度为 20mg/L)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。按此法将菌液接种到含有 17β-雌二醇浓度分别为40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L(重复三次)的新鲜无机盐培养基中培养。将经过不同梯度稀释的菌液涂布到LB琼脂培养基上，每个梯度做3个平行组。将LB琼脂培养基放入恒温培养箱，培养3d，观察菌落长势。挑取颜色、形态等不同的菌落在LB琼脂培养基上进行多次划线，直至分离出单个菌落。分别得到菌株DSH、菌株HHL和菌株QYY。经过扩大培养后，一部分于-80℃甘油混合液保藏，一部分于4℃试管斜面保存。
本发明的红球菌(Rhodococcus sp.)DSH已于2016年4月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC NO.12392。
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY已于2017年03月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCCNo.1.15223。
实施例2降解17β-雌二醇菌的鉴定
用细菌的通用引物通过PCR扩增技术扩增DNA。测序结果利用NCBI中的BLAST工具与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比对检索。比对结果表明，红球菌DSH的16S rDNA基因序列与红球菌属(Rhodococcus)中的多株红球菌和马红球菌的 16S rDNA的基因序列有较高的同源性，结合红球菌DSH的形态特征和生理生化指标，初步鉴定菌株DSH为红球菌，命名为红球菌(Rhodococcus sp.)DSH。菌株QYY的16S rDNA 基因序列与睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的遗传距离较近，结合菌株QYY 的形态学特征和生理生化指标，被鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，命名为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)QYY。
实施例3复合菌对17β-雌二醇的降解能力
将配制好的复合菌液用磷酸盐缓冲溶液稀释到OD600值为1.0，制成菌悬液备用。取出 200μL的复合菌液接种到以17β-雌二醇为唯一碳源，浓度为50mg/L的无机盐培养基中，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d，每天取一次样。将无机盐培养基经过预处理后，用高效液相色谱仪(High-performance liquid chromatography，HPLC)检测复合菌对17β-雌二醇的降解能力。检测器UV(DualλAbsorbance Detector，Water2487)，色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱(150×4.6mm，3.5mm)。流动相体积比为乙腈∶水＝1∶1，检测器波长为275nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。并用酶标仪检测细菌的生长状况，菌的生长状况用OD600表示。结果表明，将复合菌培养在以17β-雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中连续培养72h，能将浓度低于为50mg/L的17β-雌二醇快速高效降解，降解率达到98％以上。
实施例4复合菌降解17β-雌二醇复合菌的环境因子影响特征测试：
a.温度对复合菌降解17β-雌二醇的影响
配制浓度为50mg/L的17β-雌二醇无机盐培养基，用0.1mol/L NaOH和0.1mol/LHCl 将无机盐培养基的pH调为7.0。每瓶无机盐培养基，菌悬液总接种量为5％。将复合菌培养在不同温度：4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，120rpm恒温振荡培养箱中，培养3d，每个温度设3个平行组。以不接菌的含17β-雌二醇无机盐培养基作为空白对照。测定在不同温度下，复合菌对17β-雌二醇的降解率及复合菌的生长情况(图3)。结果表明：随着温度的升高，酶的活性得到提高，加快了酶促反应速率，所以，17β-雌二醇降解率提高。当温度到达30℃时，生物活性和17β-雌二醇降解率都达到了最高。再随着温度的升高，复合菌的生物活性和降解率都在逐渐下降。复合菌降解17β-雌二醇的最适温度为30℃。
b.pH对复合菌降解17β-雌二醇的影响
配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，底物浓度为50mg/L的17β-雌二醇无机盐培养基。无机盐培养基灭菌后还需重新测定pH值，以确保准确。菌悬液总的接种量为5％，每个pH值设置3个平行组，在30℃，120rpm恒温振荡培养箱中，培养3d。测定在不同pH下，复合菌对17β-雌二醇的降解率以及复合菌的生长情况(图4)。结果表明：复合菌在pH值为6.0～8.0时，有关降解17β-雌二醇的酶经过电离后，催化性质适合降解17β-雌二醇。在pH为7.0时，菌株的降解率最高，说明，复合菌降解17β-雌二醇的最适pH值为7.0。
c.有机物对复合菌降解17β-雌二醇的影响
配制无机盐培养基(无碳源)，分别向无机盐培养基中单独添加以下有机物：淀粉、酵母粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、双酚A、壬基酚，各有机物浓度均为50mg/L。菌悬液总接种量为5％。每种有机物设置3个平行组，以不添加复合菌而单独添加有机物的无机盐培养基作对照。用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCl将无机盐培养基的pH调为7.0，在 30℃，120rpm恒温振荡培养箱中，培养3d。测OD600，OD600值越大，表明细菌利用该有机物能力越强(图5)。结果表明：复合菌能够利用这些有机物。其中，复合菌在牛肉膏中生长最好，淀粉次之。复合菌不仅能够利用较为常见的碳源，也能利用双酚A、壬基酚等雌激素，反映出复合菌具有较为广泛的底物利用范围。
4、复合菌对17β-雌二醇的降解能力
将配制好的复合菌液用磷酸盐缓冲溶液稀释到OD600值为1.0，制成菌悬液备用。取出 200μL的复合菌液接种到以17β-雌二醇为唯一碳源，浓度为50mg/L的无机盐培养基中，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d，每天取一次样。将无机盐培养基经过预处理后，用高效液相色谱仪(High-performance liquid chromatography，HPLC)检测复合菌对17β-雌二醇的降解能力。检测器UV(DualλAbsorbance Detector，Water2487)，色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱(150×4.6mm，3.5mm)。流动相体积比为乙腈∶水＝1∶1，检测器波长为275nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。并用酶标仪检测细菌的生长状况，菌的生长状况用OD600表示。结果表明，将复合菌培养在以17β-雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中连续培养72h，能将浓度低于为50mg/L的17β-雌二醇快速高效降解，降解率达到98％以上。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Figure ISA0000142711900000011
Figure ISA0000142711900000021
Figure ISA0000142711900000031
Figure ISA0000142711900000041

Claims (2)

1.一种快速降解17β-雌二醇的复合菌，其特征在于，由保藏编号为CGMCC No.12392的红球菌DSH和保藏编号为CGMCC No.15223的睾丸酮丛毛单胞菌QYY组成，保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心号；所述快速降解17β-雌二醇的复合菌的制备方法包括以下步骤：分别将红球菌DSH和睾丸酮丛毛单胞菌QYY在LB琼脂培养基上进行划线活化，将活化后的单菌落接种于LB琼脂培养基中，经过分别扩大培养直至菌体浓度达到至少109cfu/ml以上；红球菌DSH和睾丸酮丛毛单胞菌QYY的体积配比1.5∶1；所述红球菌DSH和所述睾丸酮丛毛单胞菌QYY的16SrDNA序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的复合菌在降解环境激素17β-雌二醇中的应用。
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