CN105483035A - 能快速降解17β-雌二醇的复合菌及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能快速降解17β-雌二醇的复合菌，应用该复合菌剂快速降解畜禽养殖废弃物中的类固醇雌激素-17β-雌二醇，以减少环境污染并实现畜禽粪便的资源化利用。本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌，是由保藏号为CGMCC？No.10814的乙酸钙不动杆菌LM1和保藏号为CGMCC？No.10815的假单胞菌LY1组成。通过大量试验证实，所述的乙酸钙不动杆菌LM1和假单胞菌LY1以1∶1的细胞数量比混合，对处理畜禽养殖废弃物和土壤中的17β-雌二醇，降解效率最佳。

Description

能快速降解17β-雌二醇的复合菌及制备方法

技术领域

本发明涉及一种能快速降解17β-雌二醇的复合菌，应用该复合菌剂快速降解畜禽养殖废弃物中的类固醇雌激素－17β-雌二醇，以减少环境污染并实现畜禽粪便的资源化利用。

背景技术

现代化养殖大量使用的促生长类药物，加之动物自身分泌的激素，使得畜禽粪便中类固醇雌激素含量非常高，如平均每头奶牛通过粪便排除的17β－雌二醇当量达到了165微克/天，通过尿液形式排除的则高达498微克/天，使得畜禽养殖源的类固醇雌激素排放量远远超过了污水处理厂排水，成为环境中类固醇雌激素的主要污染源。类固醇雌激素的中毒机制主要包括模拟、干扰或对抗机体内生荷尔蒙原有的正常合成、运输和释放，使其无法维持自身的平衡和调节，引起动物界的雌性化现象。类固醇雌激素在水环境中以很低的浓度即可产生严重危害，17β－雌二醇在河水中的含量仅为1ng/L时就会造成雄鱼的雌性化。欧盟规定的12种内分泌干扰物中就包括类固醇雌激速和雌酮，并且17β－雌二醇被明确认为是致癌物质。由于疏水性强和生物可利用行低，特定条件下类固醇雌激素在环境中的滞留期会延长，污染范围会扩大，环境风险也因此而增加。因此有必要针对畜禽养殖源排放的类固醇雌激素污染物进行有效的源头治理，在畜禽粪便资源化利用前降解去除类固醇雌激素污染物。

畜禽养殖源的类固醇雌激素的治理方法主要包括化学法和生物法。化学法主要是利用光催化，其缺点是处理成本高，主要适用于养殖废水中雌激素的去除，对固态的养殖废弃物中类固醇雌激素的去除能力非常有限；臭氧可氧化类固醇雌激素而使其降解，但成本非常高，不适宜于小型养殖场，并且如果氧化程度不彻底可产生仍然有雌激素活性的中间代谢产物，因此不宜大规模推广。生物法主要是利用微生物的新陈代谢作用来降解环境中的类固醇雌激素，由于生物法具有成本低，无二次污染，适用面广等特点，在畜禽养殖排放源类固醇雌激素的生物治理方面具有明显的优势，越来越引起人们的重视。

国内外主要是从甾体雌激素生产企业的废水和活性污泥中分离获得高效的类固醇激素降解菌，从污水处理的角度进行的研究。而畜禽养殖是水环境及污水中类固醇激素的主要来源，因此对畜禽养殖过程进行类固醇激素污染的源头控制，可有效去除水体中的类固醇激素，对传统的污水处理系统不需要提出更高的要求，否则末端治理时需要对传统的污水处理技术和单元进行改善和升级才能达到对类固醇激素的有效去除。目前国内外主要是从单一菌株的角度出发，研究其降解机理以及对污水中类固醇激素的去除，并没有完整地开展畜禽养殖过程中类固醇激素的降解研究和应用。

发明内容

本发明的目的是解决自然环境下17β-雌二醇降解速率低和单一降解菌环境适应能力低的问题，提供一种能快速降解17β-雌二醇的复合菌。具体而言，本发明是从环境中分离出高适应能力和强降解效果的土著复合菌株，即利用复合菌株之间的协同共生作用和数量结构的自我调节作用来扩大其应用范围，增强其降解类固醇雌激素的能力。该复合菌可快速降解处理畜禽养殖废弃物和土壤中的17β-雌二醇，有效降低畜禽养殖中由17β-雌二醇污染带来的生态和人体健康风险。

本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌，是由保藏号为CGMCCNo.10814的乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLM1和保藏号为CGMCCNo.10815的假单胞菌Pseudomonassp.LY1组成。

通过大量试验证实，所述的乙酸钙不动杆菌LM1和假单胞菌LY1以1:1的细胞数量比混合，对处理畜禽养殖废弃物和土壤中的17β-雌二醇，降解效率最佳。

本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌由以下方式获得：

1、菌种驯化培养与筛选

分别从养猪场、养鸡场、养牛场采集堆放的畜禽粪便和废物处理设施中采集样品，按照质量比1:1的比例混合，取混合样品50g加入到500ml无菌水中，150rpm下振荡提取菌体细胞，将提取液按5％的比例接入到以20mg/L17β－雌二醇(17β－雌二醇)为唯一碳源的无机盐培养基中驯化培养5天，取培养物再接种至含有17β－雌二醇的新鲜无机盐培养基中驯化培养，待培养液变浑浊后再接种驯化培养，将最后一次的培养物梯度稀释后涂布于固体的牛肉膏蛋白胨培养基上培养，挑取单个菌落，划线纯化后分别将单一和复合菌以及睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996的菌悬液加入到17β－雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中培养，根据17β－雌二醇的降解率最终筛选出可高效协同降解17β－雌二醇的两株菌，分别命名为LY1和LM1。

2、菌种的鉴定与保藏

用形态观察、革兰氏染色和16SrRNA基因序列分析方法，对能够快速协同降解17β－雌二醇的2种菌株进行鉴定，并于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其中乙酸钙不动杆菌AcinetobactercalcoaceticusLM1的保藏号CGMCCNo.10814，假单胞菌Pseudomonassp.LY1的保藏号为CGMCCNo.10815。

所述菌株LM1，通过菌落特征色、革兰氏染和生理生化检测试验，表明具有以下特征及生物特性：在LB琼脂上经30℃培养24小时，呈乳白色不透明的圆形菌落,直径1.5mm左右,中央隆起,表面及边缘均光滑,粘而附于培养基上。革兰氏染色镜检为阴性菌,细胞成杆状，可形成不同长度的链状，静止期成球形，常成对。无芽孢。生化特性结果显示,分离菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-纤维二糖、其它糖醇类不能利用；不利用苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸以及精氨酸；能在柠檬酸盐(钠)、丙二酸盐中生长。氧化酶阴性，触酶阳性，不产硫化氢，可利用琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性，葡萄糖产酸。

所述菌株LY1菌株，通过菌落特征色、革兰氏染和生理生化检测试验，表明具有以下特征及生物特性：在LB琼脂上经30℃培养24小时，菌落中间微凸出，透明，表面湿润光滑。革兰氏阴性，短杆状，0.5～1.0μm×1.5～5.0μm,不产芽孢，好氧。生化特性结果显示，利用D-葡萄糖，不能利用D-纤维二糖，可利用柠檬酸盐(钠)丙二酸盐和柠檬酸盐，乳酸盐产碱，琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性。

16SrRNA基因序列分析和同源性比较表明菌株LM1与乙酸钙不动杆菌的同源性最高，菌株LY1与假单胞属的菌株同源性最高。综合上述结果，菌株LM1和LY1分别被鉴定为乙酸钙不动杆菌和假单胞菌。

3、复合菌的制备

首先将菌株LY1和LM1的菌体细胞分别划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上在25℃下培养24h，然后向长满菌体细胞的平板中加入无菌水，用玻璃棒使菌体细胞脱离培养基进入无菌水中，将含菌体细胞的悬浊液漩涡振荡均匀后，再利用无菌水将菌悬液的OD₆₀₀调节为0.10-0.20(细胞数量为10⁶-10⁷CFU/ml)，将两株菌的菌悬液以1:1的细胞数量比混合，即得复合菌。

复合菌剂降解17β-雌二醇的环境因子响应特征测试：

(1)碳氮比对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入到12个盛有100mL无氮无机盐培养基(去掉原无机盐培养基中的硫酸铵)的250mL三角瓶中，向4个三角瓶中分别加入不同量的硫酸铵，使得四个三角瓶中的C:N比分别为1:40,1:20,1:10,1:1，分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，利用剩下的三角瓶将每种碳氮比处理分别再重复2次，最后在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。结果表明低碳氮比更有利于复合菌对17β－雌二醇的降解。

(2)盐度对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入21个盛有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中，向7个三角瓶中分别加入0g、0.5g、1g、2g、3g、4g和5g的氯化钠，再利用剩余的14个三角瓶将每种处理重复2次，振荡溶解后分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。结果表明复合菌对盐度具有相当高的抗性和耐性，并且适当增加盐度还可稍微提高复合菌对17β－雌二醇的降解能力。

(3)碳源共存对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入12个盛有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中，使得每个三角瓶中17β－雌二醇的初始浓度都为5mg/L,向三个瓶子中分别加入g、g、g的乙酸钠，葡萄糖，柠檬酸钠，使得这三种碳源的碳量和17β－雌二醇的碳量相同，每种碳源重复三次，剩下的三角瓶作为对照，然后分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。表明当有其它碳源共存时，复合菌对17β－雌二醇的降解率明显增加，其中葡萄糖的促进作用最强。

复合菌对养殖废弃物和土壤中17β－雌二醇的降解作用试验：

分别采集规模化养猪场和养鸡场堆放2天后的畜禽粪便及其下层土壤样品各1kg，自然风干后，研磨，过20目筛，分别取50g样品放入玻璃容器中，向其中加入稀释10倍的复合菌悬液10ml，同时做只加无菌水的对照，每种处理和对照均重复3次，25℃放置培养4d后取适量先用无水硫酸钠干燥，然后利用乙酸乙酯提取，液相色谱法测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。结果表明加入复合菌后鸡粪、猪粪和土壤样品中17β－雌二醇的降解率明显增加。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明所述菌株LY1和LM1制成的复合菌剂，在畜禽养殖废弃物及其污染环境中具有较高的协同共生能力，能够以17β－雌二醇为唯一碳源进行生长代谢活动，因此可用于新型17β－雌二醇降解菌剂的商品化生产，可高效降解畜禽养殖各环节中排放的类固醇雌激素污染物。

附图说明

图1、菌株LM1、LY1和ATCC11996及LM1和LY1复合菌对17β－雌二醇的单一和联合降解效果比较示意图；

图2、菌株LM1和LY1的菌落特征、革兰氏染色和系统发育树示意图；

图3、碳氮比对复合菌降解17β－雌二醇的影响规律示意图；

图4、盐度对复合菌降解17β－雌二醇的影响规律示意图；

图5、碳源共存对复合菌降解17β－雌二醇的影响规律示意图；

图6、复合菌对畜禽养殖固体废弃物和土壤中17β－雌二醇的去除能力示意图。

具体实施方式

通过以下实施例的阐述以便对本发明更进一步理解。

实施例1

本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌的制备。

1、菌株LM1和LY1的驯化培养与分离

分别从养猪场、养鸡场、养牛场采集堆放的畜禽粪便和废物处理设施中采集样品，按等质量比混合后取50g混合样加入1000mL的三角瓶中，再加入500mL无菌水150rpm下振荡20分钟，静置5分钟后取上层悬浊液，以5％的比例接入50mL的无机盐培养基中，然后再加入终浓度为20mg/L的17β－雌二醇，再做2次重复，在120rpm和25℃条件下下振荡培养5天后各取10ml混合，再取混合培养物5mL加入到50mL加入了20mg/L的17β－雌二醇的无机盐培养基中，在相同条件下培养，明显变浑浊后取1ml培养物加入到50mL加入了20mg/L的17β－雌二醇的无机盐培养基中，在相同条件下培养，明显变浑浊后取出1ml，梯度稀释后涂于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在25℃下培养24h后挑取单个菌落，通过菌落特征、革兰氏染色和细胞形状表明获得了2株可共生的菌株，分别命名为LY1和LM1，然后将单一菌株和复合菌株以及睾丸酮丛毛单胞菌单一菌株分别制备成菌悬液，以2％的比例接入含有20mg/L的17β－雌二醇的无机盐培养基中培养4天后测定17β－雌二醇的浓度，计算出降解率，根据降解率筛选出最优的复合菌。从图1中可以看出，与报道的具有高效雌激素降解能力的睾丸酮丛毛单胞菌相比，本发明提供的两株菌LM1和LY2的混合物对17β－雌二醇降解能力明显增加，并且菌株LM1和LY1的复合菌对17β－雌二醇的降解能力明显大于单一菌株的降解能力，因此复合菌在环境中17β－雌二醇的降解去除应用方面具有潜在的价值。

2、菌株的鉴定与保藏

从菌落特征、细胞形态、革兰氏染色征和16SrRNA基因序列分析等多个角度对菌株LY1和LM1进行了鉴定，结果如图2所示。结果表明，在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长24小时后，菌株LM1呈乳白色不透明的圆形菌落,直径1.5mm左右，中央隆起，表面及边缘均光滑，粘而附于培养基上。革兰氏染色镜检为阴性菌,细胞成杆状，可形成不同长度的链状，静止期成球形，常成对，无芽孢。菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-纤维二糖、不利用苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸以及精氨酸，能在柠檬酸盐(钠)、丙二酸盐中生长。氧化酶阴性，触酶阳性，不产硫化氢，可利用琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性，葡萄糖产酸。菌株LY1菌株在LB琼脂上经30℃培养24小时，菌落中间微凸出，透明，表面湿润光滑，革兰氏染色阴性，细胞短杆状，0.5～1.0μm×1.5～5.0μm，不产芽孢。生化特性结果显示，利用D-葡萄糖，不能利用D-纤维二糖，可利用柠檬酸盐(钠)丙二酸盐和柠檬酸盐，乳酸盐产碱，琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性。16SrRNA基因序列分析和同源性比较表明菌株LM1与乙酸钙不动杆菌的同源性最高，菌株LY1与假单胞属的菌株同源性最高。综合上述结果，菌株LM1和LY1分别被鉴定为乙酸钙不动杆菌和假单胞菌。

菌株LM1和LY1于2015年5月18日保藏于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号分别为CGMCCNo10814和10815。

3、复合菌的制备

无机盐培养基组成(L)：1.0gK₂HPO₄，0.6gNaH₂PO₄，0.2gMgSO₄·7H₂O，0.2gKCl，(NH₄)₂SO₄2g和1ml微量元素溶液，无菌水1000mL，pH＝7.2。

微量元素溶液组成(L)：H₃BO₃0.05g，CaSO₄0.2g，CoSO₄0.1g，CuSO₄0.2g，FeSO₄3g，MnCl₂0.02g，NaMoO₄·2H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.03g。

17β－雌二醇储备液的配制：称取100mg17β－雌二醇溶解于100mL的无水乙醇中，保存于4℃冰箱中。

牛肉膏蛋白胨固体培养基(L)组成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，水1000mL，pH7.0-7.5。

首先将菌株LY1和LM1的菌体细胞分别划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上在25℃下培养24h，然后向长满菌体细胞的平板中加入无菌水，用玻璃棒使菌体细胞脱离培养基进入无菌水中，将含菌体细胞的悬浊液漩涡振荡均匀后，再利用无菌水将菌悬液的OD₆₀₀调节为0.10-0.20(细胞数量为10⁶-10⁷CFU/ml)，将两株菌的菌悬液以1:1的细胞数量比混合，即得复合菌。

实施例2

对本发明能快速降解17β-雌二醇的复合菌的特性检测及应用实验。

1、复合菌降解17β－雌二醇的环境因子响应规律

(1)碳氮比对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入到12个盛有100mL无氮无机盐培养基(去掉原无机盐培养基中的硫酸铵)的250mL三角瓶中，向4个三角瓶中分别加入不同量的硫酸铵，使得四个三角瓶中的C:N比分别为1:40,1:20,1:10,1:1，分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，利用剩下的三角瓶将每种碳氮比处理分别再重复2次，最后在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。从图3中可以看出，碳氮比为1:40,1:20,1:10,1:1时复合菌对17β－雌二醇的平均降解率分别为93.03％、95.46％、60.10％、29.45％，说明低碳氮比更有利于复合菌对17β－雌二醇的降解，随着碳氮比的增加复合菌对17β－雌二醇的降解率逐渐下降，由于在低碳氮比下一些菌株的代谢活性会降低，因此复合菌在实际应用对低碳氮比的环境样品和畜禽养殖废弃物中17β－雌二醇的去除具有非常明显的优势。

(2)盐度对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入21个盛有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中，向7个三角瓶中分别加入0g、0.5g、1g、2g、3g、4g和5g的氯化钠，再利用剩余的14个三角瓶将每种处理重复2次，振荡溶解后分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率，结果如图4所示。从图中可以看出，复合菌对盐度具有相当高的抗性和耐性，并且适当增加盐度还可稍微提高复合菌对17β－雌二醇的降解能力，当氯化钠的添加量增加到5％时复合菌对17β－雌二醇的降解率几乎下降了一半，因此虽然复合菌对盐度具有较高的耐性，但在实际应用过程中应该注意处理样品中的盐分含量是否会对复合菌的降解能力造成影响。

(3)碳源共存对复合菌降解17β－雌二醇的影响

分别取0.5mL17β－雌二醇储备液加入12个盛有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中，使得每个三角瓶中17β－雌二醇的初始浓度都为5mg/L,向三个瓶子中分别加入g、g、g的乙酸钠，葡萄糖，柠檬酸钠，使得这三种碳源的碳量和17β－雌二醇的碳量相同，每种碳源重复三次，剩下的三角瓶作为对照，然后分别取2ml复合菌悬液加入到三角瓶中，在28℃和150r/min条件下培养4d，测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率。结果如图5所示。从图中可以看出，当有其它碳源共存时，复合菌对17β－雌二醇的降解率明显增加，其中葡萄糖的促进作用最强，说明复合菌在实际应用过程中不会因为易利用碳源的存在而不代谢降解17β－雌二醇，相反当有促进复合菌生长的其它碳源时，复合菌对17β－雌二醇的降解能力反而得到提高。

2.复合菌对养殖废弃物和土壤中17β－雌二醇的降解作用

分别采集规模化养猪场和养鸡场堆放2天后的畜禽粪便及其下层土壤样品各1kg，自然风干后，研磨，过20目筛，分别取50g样品放入玻璃容器中，向其中加入稀释10倍的复合菌悬液10ml，同时做只加无菌水的对照，每种处理和对照均重复3次，25℃放置培养4d后取适量先用无水硫酸钠干燥，然后利用乙酸乙酯提取，液相色谱法测定17β－雌二醇的浓度，计算出17β－雌二醇的降解率，结果表示为平均值。结果如图6所示，从图中可以看出，与不加复合菌的对照相比，加入复合菌后鸡粪、猪粪和土壤样品中17β－雌二醇的降解率明显增加，分别是未加菌的2.70倍、2.27倍和2.07倍。

上述结果说明，本发明复合菌剂可明显加速环境样品中的17β－雌二醇降解率，在降低养殖业造成的类固醇激素污染的生态环境风险方面具有重要的应用价值。

Claims (3)

1.一种能快速降解17β-雌二醇的复合菌，其特征在于，由保藏号为CGMCCNo.10814的乙酸钙不动杆菌LM1和保藏号为CGMCCNo.10815的假单胞菌LY1组成。

2.根据权利要求1所述的能快速降解17β-雌二醇的复合菌，其特征在于，所述的乙酸钙不动杆菌LM1和假单胞菌LY1的细胞数量比为1:1。

3.权利要求1所述复合菌的制备方法，包括以下步骤：

a.菌种驯化培养与筛选

分别从养猪场、养鸡场、养牛场采集堆放的畜禽粪便和废物处理设施中采集样品，按照质量比1:1的比例混合，取混合样品50g加入到500ml无菌水中，150rpm下振荡提取菌体细胞，将提取液按5％的比例接入到以20mg/L17β-雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中驯化培养5天，取培养物再接种至含有17β-雌二醇的新鲜无机盐培养基中驯化培养，待培养液变浑浊后再接种驯化培养，将最后一次的培养物梯度稀释后涂布于固体的牛肉膏蛋白胨培养基上培养，挑取单个菌落，划线纯化后分别将单一和复合菌以及睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996的菌悬液加入到17β-雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中培养，根据17β-雌二醇的降解率最终筛选出可高效协同降解17β-雌二醇的两株菌，分别命名为LY1和LM1；

b.复合菌的制备

首先将菌株LY1和LM1的菌体细胞分别划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上在25℃下培养24h，然后向长满菌体细胞的平板中加入无菌水，用玻璃棒使菌体细胞脱离培养基进入无菌水中，将含菌体细胞的悬浊液漩涡振荡均匀后，再利用无菌水将菌悬液的OD600调节为0.10-0.20，将两株菌的菌悬液以1:1的细胞数量比混合，即得复合菌。