CN104585090A - 一种海参养殖围堰底质的改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参养殖围堰底质的改造方法，包括步骤：S1、制备1-2cm的牡蛎壳碎片，并做灭菌处理；S2、包埋底质改造菌剂：将牡蛎壳碎片和菌悬液加到褐藻酸钠溶液中混匀后，牡蛎壳碎片转移到CaCl2溶液中，经过交联作用，用水冲洗掉牡蛎壳上残留的氯化钙溶液；S3、将步骤S2牡蛎壳碎片分散沉降至海参养殖围堰底部。本发明能有效改善海参养殖围堰底质环境，具有环保节能、成本低、易于操作的特点。
Description
技术领域
本发明涉及海参养殖环境的改造，更具体的说，涉及海参养殖围堰底质的改造。
背景技术
随着我国海参养殖规模的扩大，养殖密度的提高，海参养殖围堰经过几个周期的养殖后，由于大量剩余饵料沉降到养殖围堰底部，海参排泄物以及养殖围堰中的藻类，动植物死亡后沉降到底部，所以养殖围堰底部积累的有机物随着时间的增加越来越多。沉降到养殖围堰底部的有机物分解需要消耗大量的氧气，从而导致海参养殖围堰中水体缺氧，且这些有机物不完全分解过程中产生一些有害的中间物，如氨氮、亚硝酸氮、硫化氢等，从而造成海参养殖围堰底质生态失衡，自我修复能力减弱，大量有害的厌氧微生物繁殖形成优势菌群，严重影响海参的生存和生长，养殖围堰底部淤泥的增加和水体严重缺氧导致海参产量下降。如果采用把海参养殖围堰底部的淤泥挖掘出来的方法处理，耗时又费工，不适合企业生产应用。解决这个问题的主要方法是投入可以改善海参养殖围堰底质的改造剂。
目前养殖水体底质改造剂主要包括微生态制剂，吸附剂，增氧剂，但都存在许多不足之处。常用的微生态制剂如芽孢杆菌，光合细菌等，直接泼洒后因其质量轻，比重小，只能作用于中上层水体，很难作用于下层水体和底质；加上细菌本身的生长、繁殖时间的限制，很难在有效时间内起到改善养殖围堰底部生态环境的作用。如公布号为CN 102145971 A名称为“底质改良剂”的专利利用侧孢芽孢杆菌和双歧杆菌制成底质改良剂，缺点是直接泼洒后很难作用于下层水体和底质。目前也有很多的吸附剂如沸石粉，聚丙烯酰胺等，用来吸附养殖围堰底部的有机物，只能起到暂时隔离的作用，不能彻底分解和消化养殖围堰底部的有机物，并且这些吸附剂成本较高，对养殖水体也有一定的污染。如公布号为CN 102642996 A名称为“一种高效水体底质改良剂”的专利改良剂中加入离子螯合剂来吸附有机物。另一种是以增氧剂为主的改造剂，只是暂时缓解养殖围堰底部缺氧状态，对养殖围堰底部有机物分解作用不明显。所以这三种类型的底质改造剂应用到海参养殖围堰底质改造存在一定的困难。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种高效的底质改造方法，能有效改善海参养殖围堰底质环境，具有环保节能、成本低、易于操作的特点。
为了达到上述目的，本发明提供一种海参养殖围堰底质的改造方法，包括如下步骤：
Step 1、制备1-2cm的牡蛎壳碎片，并做灭菌处理；
Step 2、包埋底质改造菌剂：将牡蛎壳碎片和底质改造菌剂菌悬液加到褐藻酸钠溶液中混匀后，牡蛎壳碎片转移到CaCl2溶液中，经过交联作用，用水冲洗掉牡蛎壳上残留的氯化钙溶液；
Step 3、将步骤Step 2牡蛎壳碎片分散沉降至海参养殖围堰底部。
Step 2所用底质改造菌剂为亚硝酸菌、芽孢杆菌或光合细菌；实验结果显示包埋欧洲亚硝酸单胞菌效果最好。最优方式，所用菌剂选用欧洲亚硝酸单胞菌WY21，保藏编号CGMCC No.9766。
优选方式下，Step 2的过程为：将牡蛎壳碎片和3～10％(g/mL)菌悬液加到1～3％(g/mL)褐藻酸钠溶液中充分混合，三者的体积比为1～4：1：7～15；CaCl2溶液浓度1～5％(g/mL)。一种最优方式，Step 2的过程为：将牡蛎壳碎片和5％菌悬液加到1.5％褐藻酸钠溶液中充分混匀，三者的体积比为2:1:10；CaCl2溶液浓度3％；交联30min。此外，Step 2中选用菌悬液，利于包埋过程。
本发明选用菌悬液，因为直接加菌体到褐藻酸钠溶液中，容易造成混合不均匀。
优选方式下，Step 3的过程为：水温大于等于10℃的天气条件下，将每立方米淤泥1～5kg的牡蛎壳碎片均匀泼洒到水中，5-7天后养殖圈正常加水和放水。优选方式下，在投放牡蛎壳碎片时，保持海参养殖围堰中水高50～100cm，从而确保牡蛎壳淹没于水面之下。
根据上述方法，本发明还提供了一种用于海参养殖围堰底质改造的菌剂，菌剂为欧洲亚硝酸单胞菌WY21，保藏编号CGMCC No.9766。并因此，本发明提供了一种上述欧洲亚硝酸单胞菌WY21在水产养殖底质改造的应用及用途。具有改造效率高，成本低的特点。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、该底质改造剂，因牡蛎壳具有一定的重量，可以直接到达并作用于养殖围堰底部，对围堰底部生态环境具有很好的改善作用。
2、牡蛎壳具有一定的孔径，硝化细菌附着在牡蛎壳上，可以利用养殖围堰底部的有机物，硝化细菌大量繁殖，不仅可以改善围堰底部生态环境，而且还可以作为海参优质饵料的添加剂，大幅度提高海参产量。相比于牡蛎壳的其他介质，例如蚬子壳，没有大小不同的孔径，表面光滑不利于菌体的附着。
3、牡蛎壳来源广泛，成本低，处理过程耗能低，促进了废弃物牡蛎壳资源化利用，具有很强的实际应用价值。
4、褐藻酸钠作为包埋的材料具有很好的通透性利于硝化细菌的溶出，并且在养殖海水中具有很高的稳定性。
保藏说明
本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为WY21，分类命名为欧洲亚硝酸单胞菌(Nitrosomonas europaea)，于2014年10月15日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.9766。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
实施例一 包埋亚硝酸单胞菌
1、亚硝酸单胞菌菌悬液的制备
1.1亚硝酸单胞菌菌种活化
选取欧洲亚硝酸单胞菌WY21，保藏编号CGMCC No.9766。挑取少许保存在斜面上的亚硝酸单胞菌菌种，接入容量100mL的三角瓶中，种子培养基装液量为20mL。种子培养基配方为硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸镁0.03g七水合硫酸亚铁0.03g，氯化钙0.03g葡糖糖5g，水1000mL，pH 7.5。活化条件为温度30℃，转速140r/min，培养时间16h。
1.2亚硝酸单胞菌菌种发酵
以接种量4％将活化好的种子培养液接入容量1L三角瓶中，发酵培养基的装液量为300mL，发酵培养基配方为硫酸铵1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾2g，七水合硫酸镁0.3g氯化钙0.03g葡糖糖10g水1000mL，pH 7.5。发酵条件为温度30℃，转速140r/min，培养时间36～38h。
1.3制备菌悬液
发酵结束后离心处理，将发酵液在4000r/min的条件下离心15min，离心结束除去上清液。将离心管中的菌体沉淀用生理盐水洗涤3次，然后将这些菌体沉淀加入适量生理盐水制成菌悬液备用。菌悬液最适浓度为5％。
2、牡蛎壳粉碎
取一定量洗干净晒干后的牡蛎壳，经磨碎机处理，得到长度为1-2cm牡蛎壳碎片，121℃，20min条件下灭菌处理后备用。
3、制备褐藻酸钠溶液
取一定量的褐藻酸钠，溶于一定量的水中，加热溶解，加热过程中充分搅拌，最适加热温度为70-90℃，使褐藻酸钠完全溶解，等褐藻酸钠溶液温度降到25℃时备用。此步中褐藻酸钠溶液最适浓度为1.5％。
4、混入菌剂及牡蛎壳碎片
将上述得到的灭过菌的牡蛎壳碎片与1.5％褐藻酸钠溶液按体积比为1：5混合搅拌一段时间，然后加入制备好的5％亚硝酸单胞菌菌悬液，加入的量与褐藻酸钠溶液体积比为1:10，充分混匀后备用。牡蛎壳碎片本身有一定的孔径，作为亚硝酸单胞菌的附着材料，亚硝酸单胞菌可以大量的繁殖，可以增加亚硝酸单胞菌的数量。同时牡蛎壳碎片具有一定的重量，利于附带着亚硝单胞菌沉降到海参养殖围堰底部。褐藻酸钠作为底质改造剂壁材具有很好的通透性利于亚硝酸单胞菌的溶出，并且在养殖海水中具有很好的稳定性。
5、交联
取一定量的氯化钙溶于一定量的水中，搅拌后充分溶解制成3％CaCl2溶液。把步骤四中处理好的牡蛎壳碎片转移到3％的CaCl2溶液中充分搅拌，经过30min的交联作用把亚硝酸单胞菌包埋在牡蛎壳碎片上制成海参养殖围堰的底质改造剂，然后用无菌水冲洗数次，以清洗掉残留的氯化钙溶液。每一粒包埋后的牡蛎壳碎片中包埋的最适亚硝酸单胞菌数量为106-107cfu，包埋菌量过少，底质改造效果缓慢，包埋菌量过多，改造效果增强不太明显，容易造成浪费菌体。
实施例二 包埋芽孢杆菌
1、芽孢杆菌菌悬液的制备
1.1芽孢杆菌菌种活化
挑取少许保存在斜面上的芽孢杆菌菌种，接入容量100mL的三角瓶中，种子培养基装液量为20mL。种子培养基配方为酵母膏1g，蛋白胨0.5g，磷酸铁0.01g，水100mL，pH 7.2。活化条件为温度30℃，转速160r/min，培养时间16h。
1.2菌种发酵
以接种量4％将活化好的种子培养液接入容量1L三角瓶中，发酵培养基的装液量为300mL，发酵培养基配方为葡萄糖1g，酵母膏1.5g，K2HPO40.5g，水100ml，pH 7.2。发酵条件为温度30℃，转速160r/min，培养时间36～38h。
1.3制备菌悬液
发酵结束后离心处理，将发酵液在4000r/min的条件下离心15min，离心结束除去上清液。将离心管中的菌体沉淀用生理盐水洗涤3次，然后将这些菌体沉淀加入适量生理盐水制成菌悬液备用。菌悬液最适浓度为5％。
2、牡蛎壳粉碎
取一定量洗干净晒干后的牡蛎壳，经磨碎机处理，得到长度为1-2cm牡蛎壳碎片，121℃，20min条件下灭菌处理后备用。
3、制备褐藻酸钠溶液
取一定量的褐藻酸钠，溶于一定量的水中，加热溶解，加热过程中充分搅拌，最适加热温度为70-90℃，使褐藻酸钠完全溶解，等褐藻酸钠溶液温度降到25℃时备用。此步中褐藻酸钠溶液最适浓度为1.5％。
4、混入菌剂及牡蛎壳碎片
将上述得到的灭过菌的牡蛎壳碎片与1.5％褐藻酸钠溶液按体积比为1：5混合搅拌一段时间，然后加入制备好的5％芽孢杆菌菌悬液，加入的量与褐藻酸钠溶液体积比为1:10，充分混匀后备用。牡蛎壳碎片本身有一定的孔径，作为芽孢杆菌的附着材料，芽孢杆菌可以大量的繁殖，可以增加芽孢杆菌的数量。同时牡蛎壳碎片具有一定的重量，利于附带着芽孢杆菌沉降到海参养殖围堰底部。褐藻酸钠作为底质改造剂壁材具有很好的通透性利于芽孢杆菌的溶出，并且在养殖海水中具有很好的稳定性。
5、交联
取一定量的氯化钙溶于一定量的水中，搅拌后充分溶解制成3％CaCl2溶液。把步骤四中处理好的牡蛎壳碎片转移到3％的CaCl2溶液中充分搅拌，经过30min的交联作用把芽孢杆菌包埋在牡蛎壳碎片上制成海参养殖围堰的底质改造剂，然后用无菌水冲洗数次，以清洗掉残留的氯化钙溶液。每一粒包埋后的牡蛎壳碎片中包埋的最适芽孢杆菌数量为106-107cfu，包埋菌量过少，底质改造效果缓慢，包埋菌量过多，改造效果增强不太明显，容易造成浪费菌体。
实施例三 包埋光合细菌
1、光合细菌菌悬液的制备
1.1光合细菌菌种活化
挑取少许保存在斜面上的光合细菌菌种，接入容量100mL的三角瓶中，种子培养基装液量为20mL。种子培养基配方为酵母膏2g，磷酸二氢钾0.5g，氯化铵1g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，乙酸钠2g，水1000mL，pH 7.0。活化条件为温度30℃，转速160r/min，培养时间24h。
1.2菌种发酵
以接种量4％将活化好的种子培养液接入容量1L三角瓶中，发酵培养基的装液量为300mL，发酵培养基配方为乙酸钠1.5g、蛋白胨0.5g、碳酸氢钠0.6g、酵母膏2g、氯化钠0.3g、硫酸镁0.1g、磷酸二氢钾0.5g水1000mL，pH 7.0。发酵条件为温度30℃，转速160r/min，培养时间36～38h。
1.3制备菌悬液
发酵结束后离心处理，将发酵液在4000r/min的条件下离心15min，离心结束除去上清液。将离心管中的菌体沉淀用生理盐水洗涤3次，然后将这些菌体沉淀加入适量生理盐水制成菌悬液备用。菌悬液最适浓度为5％。
2、牡蛎壳粉碎
取一定量洗干净晒干后的牡蛎壳，经磨碎机处理，得到长度为1-2cm牡蛎壳碎片，121℃，20min条件下灭菌处理后备用。
3、制备褐藻酸钠溶液
取一定量的褐藻酸钠，溶于一定量的水中，加热溶解，加热过程中充分搅拌，最适加热温度为70-90℃，使褐藻酸钠完全溶解，等褐藻酸钠溶液温度降到25℃时备用。此步中褐藻酸钠溶液最适浓度为1.5％。
4、混入菌剂及牡蛎壳碎片
将上述得到的灭过菌的牡蛎壳碎片与1.5％褐藻酸钠溶液按体积比为1：5混合搅拌一段时间，然后加入制备好的5％光合细菌菌悬液，加入的量与褐藻酸钠溶液体积比为1:10，充分混匀后备用。牡蛎壳碎片本身有一定的孔径，作为光合细菌的附着材料，光合细菌可以大量的繁殖，可以增加光合细菌的数量。同时牡蛎壳碎片具有一定的重量，利于附带着光合细菌沉降到海参养殖围堰底部。褐藻酸钠作为底质改造剂壁材具有很好的通透性利于光合细菌的溶出，并且在养殖海水中具有很好的稳定性。
5、交联
取一定量的氯化钙溶于一定量的水中，搅拌后充分溶解制成3％CaCl2溶液。把步骤四中处理好的牡蛎壳碎片转移到3％的CaCl2溶液中充分搅拌，经过30min的交联作用把光合细菌包埋在牡蛎壳碎片上制成海参养殖围堰的底质改造剂，
然后用无菌水冲洗数次，以清洗掉残留的氯化钙溶液。每一粒包埋后的牡蛎壳碎片中包埋的最适光合细菌数量为106-107cfu，包埋菌量过少，底质改造效果缓慢，包埋菌量过多，改造效果增强不太明显，容易造成浪费菌体。
净化实验效果对比：
分别按照实例一，实例二，实例三制备的底质改造剂，同时设置对照组对经过几个周期海参养殖后围堰底质进行净化实验。实验选取一个养殖海参五年的养殖围堰，挖取底部10cm高淤泥5m3，放入玻璃缸中加海水高于淤泥面50～100cm制备成模拟围堰底部水环境，把制备的海参养殖围堰底质改造剂洒在玻璃缸中，根据淤泥的量确定改造剂的用量，一般用量为1-5Kg/m3，定期测定底泥中氧化还原电位(Eh值)的变化情况,氧化还原电位能客观反应养殖围堰水体的好坏，是水体变化的先行指标，能有预警的功能。如果氧化还原电位降低，说明水质在恶化。围堰底泥氧化还原电位高就不会产生氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等一系列有毒有害物质，反之氧化还原电位低，就容易产生这些物质。加入三种不同底质改造剂后底泥Eh值变化情况如下表所示。
加入不同底质改造剂后底泥氧化还原电位(Eh值)变化情况
从图表中可以看出实施例一中包埋欧洲亚硝酸单胞菌的底质改造剂净化效果最好，光合细菌次之，芽孢杆菌作用最弱。
其中，上述试验数据是多组不同菌剂多次试验的平均状态。芽孢杆菌和光合细菌是自行采集及购买获得后多次试验，获得的平均值。试验中，相同菌剂的效果相差不大。本发明使用的欧洲亚硝酸单胞菌平均需要20小时增殖一倍，较其他硝化菌60小时增殖一倍的繁殖速度更快，所以净化水质的效果也尤为明显。
综上所述，本发明的海参养殖围堰底质改造剂，对海参养殖围堰底部积累的大量有机物和有害物质有明显的降解作用，可以高效改善养殖围堰底部生态环境，其中以包埋欧洲亚硝酸单胞菌的底质改造剂效果最好。本发明方法简单，操作性强，成本低廉，效果明显，对海参无毒副作用，促进了废弃物牡蛎壳资源化利用。顺应了当今社会健康养殖，健康消费的理念。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备1-2cm的牡蛎壳碎片，并做灭菌处理；
S2、包埋底质改造菌剂：将牡蛎壳碎片和底质改造菌剂的菌悬液加到褐藻酸钠溶液中混匀后，牡蛎壳碎片转移到CaCl2溶液中，经过交联作用，用水冲洗掉牡蛎壳上残留的氯化钙溶液；
S3、将步骤S2牡蛎壳碎片分散沉降至海参养殖围堰底部。
2.根据权利要求1所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，步骤S2所述底质改造菌剂为亚硝酸菌、芽孢杆菌或光合细菌。
3.根据权利要求2所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，步骤S2所用菌剂为欧洲亚硝酸单胞菌WY21，保藏编号CGMCC No.9766。
4.根据权利要求3所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，步骤S2牡蛎壳碎片中包埋后的亚硝酸单胞菌数量为106-107cfu。
5.根据权利要求1～4任一所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，
步骤S2：将牡蛎壳碎片和3～10％(g/mL)菌悬液加到1～3％(g/mL)褐藻酸钠溶液中充分混合，三者的体积比为1～4：1：7～15；CaCl2溶液浓度1～5％(g/mL)。
6.根据权利要求5所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，步骤S2：将牡蛎壳碎片和5％菌悬液加到1.5％褐藻酸钠溶液中充分混匀，三者的体积比为2:1:10；CaCl2溶液浓度3％；交联30min。
7.根据权利要求1～4任一所述海参养殖围堰底质的改造方法，其特征在于，步骤S3：水温大于等于10℃的天气条件下，将每立方米淤泥1～5kg的牡蛎壳碎片均匀泼洒到水中，5-7天后养殖圈正常加水和放水。
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