CN112410245A - 一种低温堆肥微生物复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低温堆肥微生物复合菌剂及其制备方法和应用。该微生物复合菌剂包括由两株耐冷纤维素降解菌组成的耐冷纤维素降解菌剂以及由一株17β‑雌二醇降解菌与一株雌酮降解菌组成的类固醇雌激素降解菌剂；其中，所述的两株耐冷纤维素降解菌为季也蒙念珠菌YC1以及季也蒙念珠菌YC3，所述的17β‑雌二醇降解菌为红球菌D310‑1，所述的雌酮降解菌为小杆菌ML‑6。使用本发明的低温堆肥微生物复合菌剂可在第6天达到堆肥高温期(温度>50℃)，高温期可持续5天以上，第10天可达到最高温度65.2℃，此外，类固醇雌激素的含量被显著降低。本发明的低温堆肥微生物复合菌剂实现了低温下堆肥的快速启动，避免了猪粪中类固醇雌激素类物质对环境的严重污染，完全符合堆肥的无害化标准。

Description

一种低温堆肥微生物复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用，特别涉及一种低温堆肥微生物复合菌剂、其制备方法以及对秸秆和畜禽粪便在低温堆肥中的应用。属于微生物复合菌剂技术领域。
背景技术
中国是农业大国，随着农业集约化程度的逐步提高，秸秆资源量整体呈现增长趋势，2000-2015年，可收集农作物秸秆源量从3.30×109t增至4.47×109t，年均增长率为2.33％。东北地区是我国玉米主产区，每年可收集玉米秸秆约1.7×109t，约占全国玉米秸秆资源的48％。然而，由于东北地区纬度高，气温低，冬季冰封期长达5～6个月，导致秸秆还田效率低，其中超过58％的秸秆被丢弃和焚烧，不仅造成秸秆资源的浪费，更引起严重的空气污染，不利于人类健康。同时，东北地区是重要的生猪养殖基地，近两年，东北地区在建生猪养殖项目投资已超过615亿元。然而，随着生猪养殖的规模化发展，猪粪积累量严重超负荷，导致类固醇雌激素(17β-雌二醇)排放量远远超过污水处理厂排水，生猪养殖基地成为了类固醇雌激素的主要污染源。17β-雌二醇排入环境中会导致动物界的雌性化，扰乱正常的生态系统，是严重的致癌物质之一。此外，17β-雌二醇分解后产生中间产物——雌酮，雌酮被认为是比17β-雌二醇毒性更强的污染物，且很难被降解，如排放至环境中其负面影响更甚于17β-雌二醇。目前集约化养殖场的畜禽废弃物的利用率只有30％左右，其余70％则直接向环境中排放。随意排放畜禽粪会对环境造成严重的危害：一方面是造成空气、水体和土壤的污染，另一方面是传播病菌，严重危害农业及渔业生产，威胁人类及动植物的健康。
目前秸秆的处理方法包括物理法(超微粉碎，蒸汽爆破、氨冷冻爆破和挤压膨化等)、化学法(稀酸法、碱化法、氨化法、氨碱复合法和氧化处理法)、生物法(青贮、微贮和酶解)。畜禽粪便的处理方法包括化学法(光催化法和臭氧氧化法)和生物法(堆肥)。迄今，对农业废弃物的综合处理方法已有多年研究，但仍存在系列的负面问题，如物理法能耗物耗高，化学法易造成二次污染等。生物法处理农业废弃物具有成本低、处理速度快、分解彻底、无二次污染等优势，因此堆肥发酵农业废弃物成为了农业资源化利用的有效策略。目前农业废弃物的堆肥研究中，微生物群落组成多为中温和高温微生物，低温微生物的研究较少，进而限制了寒冷地区农业废弃物的可持续发展。同时，针对低温条件下畜禽粪便中类固醇和雌激素的同时处理研究更为罕见，多数为单项研究，如低温秸秆堆肥菌剂(专利申请CN109593677A、CN109182163A、CN110627644A)和畜禽粪便中类固醇雌激素生物修复技术(专利CN105483035A、CN104894012A、CN106754460B)。目前所知，仅专利申请CN104355690A和CN108863483A公开了秸秆和畜禽粪便的共堆肥技术，但两项技术均为高温堆肥发酵，且未对畜禽粪便中的类固醇雌激素进行相应的生物处理。因此，研发出低温条件下促进秸秆和畜禽粪便安全堆肥发酵的微生物复合菌剂对提升农业废弃物资源化利用效率，推动生态环境的可持续发展、支撑寒冷地区经济发展具有重大意义。
耐冷菌分离自低温栖息地，如冻土、海洋、高山湖泊和极地等，在0℃可生长繁殖，10～15℃维持较好的代谢能力，20～30℃生理代谢活跃。因此，分离出耐冷木质纤维素降解真菌并将其应用于低温环境的堆肥过程中，不仅能够彻底降解秸秆中难分解的多聚大分子物质纤维素，更能够快速启动低温堆肥反应。另外，在类固醇雌激素类物质中，17β-雌二醇是一种性质稳定，不易发生自然降解的雌激素，且生物降解后产生的代谢产物雌酮具有更强的毒性，因此，需针对性地从环境微生物中分离出17β-雌二醇和雌酮的高效降解菌，对畜禽粪便进行去类固醇雌激素处理。畜禽粪便经生物处理后，方可安全地排放至环境中。秸秆和畜禽粪便是我国东北地区(年均气温零下3.8℃)最主要的农业废弃物，将二者结合并统一处理是降低投资成本，提升工作效率的有效策略。然而，一种适用于秸秆和畜禽粪便低温堆肥的，且能够同时达到对畜禽粪便中类固醇雌激素类物质处理的微生物复合菌剂及其制备方法和应用尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，提出一种促进寒地农业废弃物降解的低温微生物复合菌剂，可应用在寒冷环境下的秸秆和畜禽粪便的堆肥过程中，不仅能够彻底分解秸秆中的纤维素，还能够快速转化畜禽粪便中的类固醇雌激素类物质。本发明的菌剂施加后能够在低温环境下快速启动堆肥反应，缩短发酵周期，提高腐熟度，增加有机肥质量，保障有机肥施加后土壤环境的安全性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种促进寒地农业废弃物降解的低温堆肥微生物复合菌剂，包括由两株耐冷纤维素降解菌组成的耐冷纤维素降解菌剂以及由一株17β-雌二醇降解菌以及一株雌酮降解菌组成的类固醇雌激素降解菌剂；
所述的两株耐冷纤维素降解菌为季也蒙念珠菌(Meyerozyma guilliermondii)YC1以及季也蒙念珠菌(Meyerozyma guilliermondii)YC3，分别命名为YC1以及YC3，分类命名均为Meyerozyma guilliermondii，分别保藏在于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为CGMCCNO.20604以及CGMCCNO.20605，保藏时间为2020年9月7日；
所述的17β-雌二醇降解菌为红球菌(Rhodococcus erythropolis)D310-1，命名为D310-1，分类命名为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.11569，保藏时间为2015年11月3日；
所述的雌酮降解菌为小杆菌(Microbacterium)ML-6，命名为ML-6，分类命名为氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.20608，保藏时间为2020年9月7日。
其中，优选的、所述的耐冷纤维素降解菌YC1、YC3均属于季也蒙念珠菌属，YC1为中央凸起、边缘轻薄、圆形、边缘整齐的纯白色菌落；YC3为圆形、边缘不整齐、菌体较厚的乳白色菌落。以玉米秸秆、纤维素、滤纸为碳源，YC1和YC3在10℃下分泌的纤维素酶的最大酶活力分别为8.87U/mL、10.1U/mL；滤纸酶的最大酶活力分别为6.80U/mL、5.60U/mL。
其中，优选的，所述的耐冷纤维素降解菌YC1、YC3的纤维素酶活及滤纸酶活均高于目前所报道的低温及中温纤维素降解菌的相关酶活力，低温菌如Cladosporium WR-C1在10℃下纤维素酶活及滤纸酶活分别为3.27U/mL、0.51U/mL，Aspergillusniger SH3在15-25℃下纤维素酶活及滤纸酶活分别为0.65U/mL、0.031U/mL，Mrakiaarctica sp.在10℃下分泌的纤维素酶活为5.58U/mL；中温菌如Trichodermareesei RUTC30的纤维素酶活为6.5U/mL(Li et al.2018),Trichodermaharzianum HBA03的纤维素酶活为8.2U/mL、滤纸酶活为5.4U/mL(Libardi et al.2017)，PenicilliumoxalicumGZ-2的滤纸酶活为1.4U/mL(Liaoet al.2015)。
其中，优选的、所述的17β-雌二醇降解菌D310-1为圆形凸起、边缘整齐、不透明、表面光滑湿润的乳白色菌落。与所报道的17β-雌二醇降解菌相比，以17β-雌二醇为唯一碳源，D310-1在第3.5天的最高降解率为97.98％，而Stenotrophomonasmaltophilia SJTH1在第7天的降解率仅为90％(Xiong et al.2020)；Bacilluslicheniformis strain LF5在第32天的17β-雌二醇降解率为80％(Fernández et al.2017)。
其中，优选的、所述的雌酮降解菌ML-6为光泽、不透明的浅黄色乳状菌落。与所报道的雌酮降解菌相比，以30mg/L雌酮为唯一碳源，ML-6的降解速率为0.74mg/L/hr，而Pseudomonasputida SJTE1以25mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.38mg/L/hr(Wang etal.2019)；Sphingomonas CYH以1mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.13mg/L/hr(Ke etal.2007)；Rhodococcus sp.BH2-1以2mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.012mg/L/hr(Pratush et al.2019)。
其中，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3按照等浓度进行混合，获得耐冷纤维素降解菌剂；将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1与雌酮降解菌ML-6按照等浓度进行混合，获得类固醇雌激素降解菌剂。
其中，优选的，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水将耐冷纤维素降解菌YC1，YC3的菌悬液浓度调至原浓度的10％，然后按照体积比1：1混合两株耐冷纤维素降解菌，获得耐冷纤维素降解菌剂；同时，将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水稀释至原浓度的10％，按照体积比1：1混合17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6，获得类固醇雌激素降解菌剂。
其中，优选的，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3分别接种于PDB培养基中，10℃，160rpm培养至指数生长期。
其中，优选的，所述的PDB培养基中含有马铃薯提取物200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨6g/L。
其中，优选的，将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6分别接种于LB培养基中，25℃，160rpm培养至指数生长期，
其中，优选的，所述的LB培养基中含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
进一步的，本发明还提出了一种低温农业废弃物堆肥方法，包括使用本发明所述的低温堆肥微生物复合菌剂和低温堆肥反应的步骤，堆肥过程中环境周围温度范围为11-12.5℃。
其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：
(1)秸秆的预处理
秸秆使用粉碎机粉碎，过40目筛，获得的秸秆粉末备用；
(2)堆肥混合物制备
将秸秆粉与畜禽粪便均匀混合，向混合物中喷洒无菌水，保持混合物的含水量为60％；
(3)堆肥
在堆肥初期，向堆肥混合物中加入质量百分比为10％的本发明所述的耐冷纤维素降解菌剂以及质量百分比为2％的腐殖酸；随着堆肥反应的启动，堆肥温度逐渐上升，到达中温期(20℃-30℃)，向堆肥混合物中加入质量百分比为10％的本发明所述的类固醇雌激素降解菌剂；
整个堆肥过程曝气率为0.025L/min，每隔8小时，曝气15分钟，每12小时检测一次堆肥温度，直到堆肥结束。
其中，优选的，所述的秸秆和畜禽粪便的干重混合比例为7:5，碳氮比为29.7。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出的一种低温微生物复合菌剂能够在周围环境为11-12.5℃时启动堆肥，堆肥过程在第6天达到堆肥高温期(温度>50℃)，高温期可持续5天以上，第10天达到最高温度65.2℃，而未加菌剂的堆肥最高温度为55℃。此外，本发明提出的一种低温微生物复合菌剂能够显著降低堆肥产品中的类固醇雌激素的含量。因此，本发明的低温堆肥微生物复合菌剂实现了低温下堆肥的快速启动，避免了粪便中类固醇雌激素类物质对环境的严重污染，完全符合堆肥的无害化标准。
具体实施方式
下面对以上示例给出具体的操作步骤和详细的解释，但不构成对本发明技术方案的限制。
实施例1菌株的分离、鉴定及活化
(1)耐冷纤维素降解菌的分离
从中国哈尔滨市东北农业大学农场实验基地对猪粪样品采样，10g的猪粪样品浸在90mL无菌水中，220rpm搅拌1小时，用无菌水稀释原液至10-3和10-4，取0.1mL稀释液涂于羧甲基纤维素钠固体平板上，于10℃低温培养箱中静止培养。
羧甲基纤维素培养基配方：15g羧甲基纤维素(CMC-Na),0.3g/L尿素，1.4g/L(NH4)2SO4，2.0g/LKH2PO4，0.3g/LCaCl2，0.3g/LMgSO4，0.75g/Lpeptone，5mg/LFeSO47H2O，20mg/LCoCl2，1.6mg/LMnSO4，1.4mg/LZnSO4，20g琼脂。
(2)耐冷纤维素降解菌的分离、纯化和鉴定
使用接种环挑取平板中的微生物菌落至新的羧甲基纤维素钠固体平板上，10℃静止培养。重复以上操作直至分离的单菌落为纯菌。YC1为中央凸起、边缘轻薄、圆形、边缘整齐的纯白色菌落；YC3为圆形、边缘不整齐、菌体较厚的乳白色菌落。
对纯化出的2株耐冷酵母菌的18SrDNA进行PCR扩增，使用ITS1/ITS4通用引物：上游引物5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR扩增产物送至华大基因公司(中国，北京)进行测序，测序结果显示2株耐冷纤维素降解菌均为季也蒙念珠菌，18SrDNA的GenBankID分别为MK355205、MK355207。
将分离得到的2株耐冷纤维素降解菌，分别为季也蒙念珠菌YC1和YC3，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20604以及CGMCC NO.20605。
实施例2功能微生物作用能力鉴定
(1)耐冷纤维素降解菌的纤维素酶以及滤纸酶活性
2株耐冷纤维素降解菌YC1，YC3分别接种于PDB培养基中，10℃，160rpm培养，收集菌液，测定2株耐冷纤维素降解菌的纤维素酶活性。
纤维素酶活检测方法：将培养物在4℃离心机中10,000r/min离心10分钟获得粗酶液，取0.5mL粗酶液移至2.0mL1％的羧甲基纤维素钠溶液中孵育30分钟，用3mLDNS溶液，沸水浴10分钟，终止反应，反应液冷却后，采用分光光度计540nm测定吸光值(对照组使用无菌培养基替代粗酶液)。
滤纸酶活检测方法：将培养物在4℃离心机中10,000r/min离心10分钟获得粗酶液，各试管加入粗酶液1mL于1.5mL柠檬酸缓冲液中(0.05mol/LpH4.5)，将所有反应液50℃水浴，8min，再各加入50mg滤纸条(新华定量滤纸)，50℃水浴30min，立即向试管中各加入1.5mLDNS溶液，摇匀，沸水浴5min，冷却，用蒸馏水定容至20mL。对照组不加滤纸条。以对照组溶液为空白对照在540nm波长下测反应液的吸光值。以不同浓度梯度的葡萄糖做标准曲线，按公式计算出滤纸酶活力(U/mL)，每1min由底物生成1umol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
结果：以玉米秸秆、纤维素、滤纸为碳源，YC1和YC3在10℃下分泌的纤维素酶的最大酶活力分别为8.87U/mL、10.1U/mL；滤纸酶的最大酶活力分别为6.80U/mL、5.60U/mL，均高于目前已报道的低温及中温纤维素降解菌的相关酶活力，低温菌如Cladosporium WR-C1在10℃下纤维素酶活及滤纸酶活分别为3.27U/mL、0.51U/mL，Aspergillusniger SH3在15-25℃下纤维素酶活及滤纸酶活分别为0.65U/mL、0.031U/mL，Mrakiaarctica sp.在10℃下分泌的纤维素酶活为5.58U/mL；中温菌如Trichodermareesei RUTC30的纤维素酶活为6.5U/mL,Trichodermaharzianum HBA03的纤维素酶活为8.2U/mL、滤纸酶活为5.4U/mL，Penicilliumoxalicum GZ-2的滤纸酶活为1.4U/mL。
(2)类固醇雌激素降解菌的降解效果
17β-雌二醇降解菌红球菌D310-1，为圆形凸起、边缘整齐、不透明、表面光滑湿润的乳白色菌落。保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.11569。GenBankID为GU138102。菌株的分离和鉴定见文章：M Xiong,X Cheng,H Zang,J Pan,C Xu,C Li*.Isolation of a novel chlorimuron-ethyl-degrading bacterium Rhodococcussp.D310-1.The 5thInternational Conferenceon Bioinformatics and BiomedicalEngineering。
所述的17β-雌二醇降解菌D310-1与已报道的17β-雌二醇降解菌相比，以17β-雌二醇为唯一碳源，D310-1在第3.5天的最高降解率为97.98％，而Stenotrophomonasmaltophilia SJTH1在第7天的降解率仅为90％；Bacilluslicheniformisstrain LF5在第32天的17β-雌二醇降解率为80％。
雌酮降解菌微杆菌ML-6，为光泽、不透明的浅黄色乳状菌落。保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.20608。所述的雌酮降解菌ML-6与已报道的雌酮降解菌相比，以30mg/L雌酮为唯一碳源，ML-6的降解速率为0.74mg/L/hr，而Pseudomonasputida SJTE1以25mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.38mg/L/hr；Sphingomonas CYH以1mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.13mg/L/hr；Rhodococcus sp.BH2-1以2mg/L雌酮为碳源时，降解速率为0.012mg/L/hr。
实施例3低温堆肥微生物复合菌剂的应用
1、方法：
(1)耐冷纤维素降解菌剂的制备
耐冷纤维素降解菌YC1、YC3分别接种于PDB培养基中，10℃，160rpm培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水稀释菌液至原浓度的10％，将2株耐冷纤维素降解菌YC1、YC3按照体积比1:1的比例混合，制成耐冷纤维素降解菌剂。
PDB培养基：马铃薯提取物200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨6g/L。
(2)类固醇雌激素降解菌剂的制备
类固醇雌激素降解菌D310-1、ML-6分别接种于LB培养基中，25℃，160rpm培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水稀释菌液至原浓度的10％，将2株类固醇雌激素降解菌D310-1、ML-6按照体积比1:1的比例混合，制成类固醇雌激素降解菌剂。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
(3)秸秆的预处理
玉米秸秆使用粉碎机粉碎，过40目筛，获得的玉米秸秆粉末备用。
(4)低温堆肥过程
选择环境温度为11-12.5℃的实验基地进行堆肥实验。
堆肥反应设置在长×宽×高＝500mm×380mm×270mm的保温泡沫箱中。
堆肥混合物制备：将秸秆粉与猪粪以7:5的比例均匀混合，向混合物中喷洒无菌水，保持混合物的含水量为60％。
按照表1进行实验分组：
T组：在堆肥初期，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的步骤(1)制备得到的耐冷纤维素降解菌剂以及质量百分比为2％的腐殖酸，此时堆肥温度与室温(11-12.5℃)一致。
随着堆肥反应的启动，堆肥温度逐渐上升，到达中温期(20℃-30℃)，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的步骤(2)制备得到的类固醇雌激素降解菌剂。
T1组：仅在堆肥初期，向堆肥混合物中加入其质量百分比为2％的腐殖酸，此时堆肥温度与室温(11-12.5℃)一致。
T2组：仅在堆肥中温期(20℃-30℃)，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的步骤(2)制备得到的类固醇雌激素降解菌剂。
T3组：仅在堆肥初期，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的步骤(1)制备得到的耐冷纤维素降解菌剂，此时堆肥温度与室温(11-12.5℃)一致。
CK组：堆肥混合物自然发酵，此时堆肥温度与室温(11-12.5℃)一致。
表1实验分组
Figure BDA0002722334730000091
整个堆肥过程曝气率为0.025L/min，每隔8小时，曝气15分钟，每12小时检测一次堆肥温度。
2、各组堆肥的各项指标检测：
(1)理化参数检测
分别采集各组在0、2、5、8、14、19、25、32(天)的堆肥样品，测定以下理化参数：堆肥温度(Temperature)、pH值、电导率(EC)、发芽指数(GI)、湿度(Moisture)、铵态氮(NH4 +-N)、硝态氮(NO3 –-N)、总钾(TK)、总磷(TP)、总有机碳(TOC)、凯氏氮(TKN)、碳氮比(C:N)，并于1、4、10、16、32天检测堆肥样品中17β-雌二醇(E2)以及雌酮(E1)的残余量。
表2堆肥样品各指标值
Figure BDA0002722334730000101
Figure BDA0002722334730000111
Figure BDA0002722334730000121
Figure BDA0002722334730000131
Figure BDA0002722334730000141
堆肥温度(Temperature)对不同堆肥分组的响应：T、T1、T3组中堆肥温度上升迅速，在第5天达到高温期(>50℃)，高温可持续5天以上。高温(>50℃)可杀死病原菌和杂草种子，符合无害堆肥的标准。而CK组在第9天到达高温期，温度仅为45.7℃。
pH值对不同堆肥分组的响应：堆肥末期，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的pH值分别为8.20、7.99、8.26、7.99、7.27。据报道成熟和结构良好的堆肥的pH值范围为7.96-8.45，因此，除CK外，所有堆肥处理组均满足成熟堆肥的标准。
电导率(EC)对不同堆肥分组的响应：堆肥初期，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的电导率均为6.40mS/cm，堆肥过程中，T和T1的电导率下降明显，堆肥末期，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的电导率分比为2.35、2.32、4.02、2.35、4.01(mS/cm)，结果表明相比T2和CK，堆肥组T、T1、T3的堆肥腐熟度较高。电导率用来评价堆肥中有机物矿化程度和含盐量。
发芽指数(GI)对不同堆肥分组的响应：堆肥初期，堆肥组的GI比率均低于50％，堆肥末期堆肥组T、T1、T2、T3、CK的GI比率分别为101％、99.5％、90.5％、97.8％、88.4％，相关报道表明，堆肥中GI比率大于80％即认为堆肥是完全成熟的。GI用以评价堆肥的成熟度和植物毒性程度。
湿度(Moisture)对不同堆肥分组的响应：在堆肥准备期，每组的堆肥湿度均调节至60％，以保证微生物的最佳活性。随着微生物对堆肥中有机物降解率的增加，堆肥湿度随之降低。堆肥结束时，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的堆肥湿度分别为21.4％、23.9％、26.5％、21.6％、32.5％。堆肥产品的建议水分率为15％至30％，因此，除CK组外，堆肥处理组菌达到堆肥成熟标准。
铵态氮(NH4 +-N)对不同堆肥分组的响应：堆肥中铵态氮的浓度由于污染物的氨化和氨气的释放而先增加后降低，堆肥结束时，堆肥组T、T1、T2、T3、CK中铵态氮的浓度分别为0.010、0.030、0.050、0.050、0.210(g/kg)。据报道，堆肥产品中可接受的铵态氮浓度应<0.500g/kg，因此，除了CK组外，其他处理组的堆肥产品均符合标准。
硝态氮(NO3 –-N)对不同堆肥分组的响应：堆肥组的硝态氮浓度从堆肥启动至堆肥完成一直保持增加状态，在堆肥末期获得最大浓度的硝态氮，堆肥组T、T1、T2、T3、CK中硝态氮浓度分别为22.48、13.96、10.63、12.41、9.88(g/kg)，相比于CK组，堆肥处理组均含有较高的硝态氮含量，说明农业废弃物中的铵态氮在堆肥过程中的转化效果较好，其中堆肥T组效果最佳。
总钾(TK)和总磷(TP)对不同堆肥分组的响应：各堆肥组中总钾和总磷的浓度保持逐渐增加的状态直到堆肥结束，堆肥组T、T1、T2、T3、CK中总钾的浓度分别为0.520、0.360、0.350、0.300、0.320(g/Kg)；总磷的浓度分别为2.41、1.69、1.21、1.32、1.11(g/Kg)。堆肥处理组中总钾和总磷均高于CK组，其中堆肥T组中总钾和总磷的含量最高，为微生物的生物活性的发挥提供充足的营养成分。
总有机碳(TOC)对不同堆肥分组的响应：堆肥初期，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的TOC含量分别为42.4％、41.6％、40.1％、40.3％、40.0％，微生物对有机碳的矿化导致TOC比率的不断降低。堆肥末期，堆肥组T、T1、T2、T3、CK的TOC含量分别为18.1％、21.6％、24.5％、23.2％、26.0％。根据矿化结果，T组的堆肥效果更显著。
凯氏氮(TKN)对不同堆肥分组的响应：堆肥组T、T1、T2、T3、CK的凯氏氮比率分别从1.40％、1.60％、1.50％、1.30％、1.60％增加至2.60％、2.50％、2.20％、2.60％、2.10％，其中T组增加最显著，表明有机质被迅速降解，氨损失较低，推测是由于添加腐殖酸和微生物复合菌剂协同作用所致。
碳氮比(C:N)对不同堆肥分组的响应：堆肥过程中，由于氨的消耗和氨气的挥发，各堆肥组碳氮比逐渐降低，直到堆肥结束。所有堆肥分组中的碳氮比均小于25，表明所有分组的堆肥均已腐熟。相比于其他分组(T1、T2、T3、CK)，T组的碳氮比下降最明显，说明微生物复合菌剂和腐殖酸的共同作用可显著促进氨的消耗。
17β-雌二醇以及雌酮含量对不同堆肥分组的响应：堆肥组T、T1、T2、T3、CK的类固醇雌激素17β-雌二醇的初浓度从4883ng/kg分别降至0、365、410、526、706(ng/kg)，降解率分别为100％、92.5％、91.6％、98.2％、85.5％；雌酮的初浓度从4637ng/kg分别降至100、381、296、282、395(ng/kg)，降解率分别为97.8％、91.8％、93.6％、93.9％、91.5％说明微生物复合菌剂添加后能够有效的降解类固醇雌激素17β-雌二醇和雌酮。
以上是本发明的详细实施方案和低温微生物复合菌剂的效果验证，但本发明的保护范围并不局限于此，任何根据本发明实施方案或思路进行替换或者修改的方案，均涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，包括由两株耐冷纤维素降解菌组成的耐冷纤维素降解菌剂以及由一株17β-雌二醇降解菌和一株雌酮降解菌组成的类固醇雌激素降解菌剂；
其中，所述的两株耐冷纤维素降解菌为季也蒙念珠菌(Meyerozymaguilliermondii)YC1以及季也蒙念珠菌(Meyerozymaguilliermondii)YC3，分别保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20604以及CGMCC NO.20605；
所述的17β-雌二醇降解菌为红球菌(Rhodococcuserythropolis)D310-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.11569；
所述的雌酮降解菌为小杆菌(Microbacterium)ML-6，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.20608。
2.如权利要求1所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3按照等浓度进行混合，获得耐冷纤维素降解菌剂；将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1与雌酮降解菌ML-6按照等浓度进行混合，获得类固醇雌激素降解菌剂。
3.如权利要求1所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水将耐冷纤维素降解菌YC1，YC3的菌悬液浓度调至原浓度的10％，然后按照体积比1：1混合两株耐冷纤维素降解菌，获得耐冷纤维素降解菌剂；同时，将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6培养至指数生长期，离心富集菌体至终浓度为OD600＝2，用无菌水稀释至原浓度的10％，按照体积比1：1混合17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6，获得类固醇雌激素降解菌剂。
4.如权利要求3所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，将所述的耐冷纤维素降解菌YC1，YC3分别接种于PDB培养基中，10℃，160rpm培养至指数生长期。
5.如权利要求4所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，所述的PDB培养基中含有马铃薯提取物200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨6g/L。
6.如权利要求3所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，将所述的17β-雌二醇降解菌D310-1以及雌酮降解菌ML-6分别接种于LB培养基中，25℃，160rpm培养至指数生长期。
7.如权利要求6所述的低温堆肥微生物复合菌剂，其特征在于，所述的LB培养基中含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
8.一种低温农业废弃物堆肥方法，其特征在于，包括使用权利要求1-7任一项所述的低温堆肥微生物复合菌剂和低温堆肥反应的步骤，堆肥过程中环境周围温度范围为11-12.5℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)秸秆的预处理
秸秆使用粉碎机粉碎，过40目筛，获得的秸秆粉末备用；
(2)堆肥混合物制备
将秸秆粉与畜禽粪便均匀混合，向混合物中喷洒无菌水，保持混合物的含水量为60％；
(3)堆肥
在堆肥初期，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的权利要求书1-7任一项所述的耐冷纤维素降解菌剂以及质量百分比为2％的腐殖酸；随着堆肥反应的启动，堆肥温度逐渐上升，到达中温期(20℃-30℃)，向堆肥混合物中加入其质量百分比为10％的权利要求书1-7任一项所述的类固醇雌激素降解菌剂；
整个堆肥过程曝气率为0.025L/min，每隔8小时，曝气15分钟，每12小时检测一次堆肥温度，直到堆肥结束。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，秸秆和畜禽粪便的干重混合比例为7:5，碳氮比为29.7。
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