CN104611267A - 一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂及其制备方法和应用,它涉及一种低温高效降解功能复合菌剂及其制备方法和应用。本发明是要解决了严寒地区由于低温限制造成有机生活垃圾降解速度慢的问题。本发明的菌剂由低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌组成。制备方法为:一、菌株的筛选;二、制作成菌剂,即得。本发明按堆肥有机生活垃圾质量的0.5%~8.0%的比例投加菌剂,进行动态发酵。生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,可以在低温条件下使有机生活垃圾堆肥迅速升温,进入高温期,缩短发酵周期,提高转化效率,而且对不同环境的适应能力强,在低温有机生活垃圾处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂范围,特别涉及一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的构建、制作及其在有机生活垃圾处理与资源化中的应用。
背景技术
随着人类物质生活水平的提高,农村有机生活垃圾已成为严重的社会问题。据有关统计资料显示,我国垃圾年均增长率达到10%以上,成为世界上垃圾围城最严重的国家之一,特别是在严寒地区,由于低温限制,生活垃圾降解速度极慢,迫切需要有效控制低温条件下生活垃圾对环境的污染问题,亟需全面对生活垃圾进行有效的处理。
堆肥化是自然界有机物分解,促进元素循环的重要环节,而随着生产集约化程度的提高和城市规模的扩大,有机生活垃圾集中越加严重的背景下,堆肥化技术是处理有机生活垃圾减轻环境压力和制造有机肥的重要途径。
堆肥化过程是在微生物的作用下,可分解的有机物全部分解,进入安全状态,部分元素矿化成为植物养分的过程。其过程可分为:糖类、淀粉和蛋白质等易分解物分解产热而升温阶段,伴随纤维素、半纤维素分解而持续产热的高温发酵阶段,以及剩余分解物继续分解和形成腐殖质的后熟阶段,这三个过程。其中第一阶段是时间较长,堆肥温度升温的阶段,第二阶段是堆肥化物质变化剧烈的关键阶段,第三阶段是相对温和的必经阶段,因此堆肥化腐熟速度的关键是第一阶段升温的速度。
目前北方严寒地区,由于低温限制,导致生活垃圾堆肥启动慢,堆肥周期长,不能快速有效的降解生活垃圾,所以本研究针对该问题筛选低温高效的功能性菌株,制备成低温高效降解菌剂使生活垃圾在低温下能够快速启动,进入高温期,缩短发酵周期,提高转化效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能加速生活垃圾低温降解过程的功能复合菌剂,解决严寒地区由于低温限制造成有机生活垃圾降解速度慢的问题,为达到加速有机生活垃圾在低温条件下快速降解的目的,提供一种加速生活垃圾降解的功能复合菌剂及制备方法和应用。
本发明的一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,所述菌剂由低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌组成,各菌剂体积比为1:1:1:1;
所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
本发明的一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,它是按照以下步骤进行的:
一、菌株的筛选:采用稀释涂布、分离划线和传代培养的方法筛选低温高效降解菌;
二、菌剂的制作:将步骤一筛选得到的低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液的浊度OD600均调至1.9~2.1,然后将低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液按照体积比为1:1:1:1的比例混合均匀,即得生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂;
其中,所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
本发明的一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的应用,它用于生活垃圾处理。
本发明包含以下有益效果:
本发明菌剂中的微生物种群间具有良好的协同作用,不仅对低温条件下有机生活垃圾具有高效稳定的降解能力,而且对不同环境的适应能力强,菌剂可加速有机生活垃圾的堆肥化进程,提高发酵效率,缩短堆肥时间,降低处理成本。
低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌株间没有拮抗作用且具有良好的协同作用,这种协同作用可有效的加速堆肥化的进程。本发明解决了严寒地区由于低温限制造成有机生活垃圾降解速度慢的问题,可以在低温条件下使有机生活垃圾堆肥迅速升温,进入高温期,缩短发酵周期,提高转化效率,而且对不同环境的适应能力强,在低温有机生活垃圾处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1好氧堆肥中加入本发明复合菌剂后堆肥物料颜色的变化图;
图2好氧堆肥中不加入本发明复合菌剂堆肥物料颜色的变化图;
图3好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂温度的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;为环境温度曲线;
图4好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂pH的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图5好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂含水率的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图6好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂电导率的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图7好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂有机质含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图8好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂全碳含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图9好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂全氮含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图10好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂碳氮比的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图11好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂铵态氮含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图12好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂硝态氮含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图13好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂全磷含量的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线;
图14好氧堆肥中加入本发明复合菌剂和不加入本发明复合菌剂种子发芽指数的变化趋势曲线图;其中,为实验组曲线;为对照组曲线。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式的一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,所述菌剂由低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌组成,各菌剂体积比为1:1:1:1;
所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
具体实施方式二:本实施方式的一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,它是按照以下步骤进行的:
一、菌株的筛选:采用稀释涂布、分离划线和传代培养的方法筛选低温高效降解菌;
二、菌剂的制作:将步骤一筛选得到的低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液的浊度OD600均调至1.9~2.1,然后将低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液按照体积比为1:1:1:1的比例混合均匀,即得生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂;
其中,所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式二不同的是:步骤一种采用稀释涂布、分离划线和传代培养的方法筛选低温高效降解菌的具体过程如下:
一、将采集的土壤样品混合均匀,按质量体积比为1g:10mL的比例将土壤样品溶于无菌水中,加入玻璃珠,在转速为160r/min的摇床中振荡培养1h,取上清液溶于无菌水中,分别配制成10-1至10-12的浓度梯度的菌悬液;其中,采集的土壤样品为-10℃环境下采集的土壤样品;
二、取步骤一中配制的各浓度梯度的菌悬液,将各浓度梯度的菌悬液分别涂布于低温高效纤维素降解细菌的固体培养基、低温高效淀粉降解细菌的固体培养基、低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基和低温高效糖降解细菌的固体培养基上,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
三、挑取步骤二中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落分别接种于对应的四种菌的液体培养基中,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
四、分别取步骤三在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,分别以2%的接种量接种对应的四种菌的液体培养基内,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
五、重复步骤四的操作2次;
六、分别取步骤五在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,在其对应的四种菌的固体培养基上分别进行划线,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
七、分别挑取步骤六中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落,重新进行划线培养,直至培养出单菌落,即得到低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌的纯菌株;其中,重新进行划线培养是指:将挑取的单菌落分别在对应的固体培养基上进行划线,然后在10℃的条件下倒置培养5天。其它与具体实施方式二相同。
本实施方式步骤六和七中所述的四种菌的固体培养基是指步骤二中的四种菌的固体培养基,即为低温高效淀粉降解细菌的固体培养基、低温高效纤维素降解细菌的固体培养基、低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基和低温高效糖降解细菌的固体培养基。
本实施方式的土壤样品是在-10℃环境下,从黑龙江省哈尔滨市南岗区后兴隆生活垃圾场选取四个地点采取的土样。
本实施方式中,将在低温高效纤维素降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株点种在羧甲基纤维素钠固体培养基上,在10℃的培养条件倒置培养5天,加入1mg/mL的刚果红染色1h,随后用1mol/L的NaCl脱色15min,观察菌落周围是否有透明圈产生,若有,对其进行纤维素酶活测定。
本实施方式中,将在低温高效淀粉降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株点种在淀粉固体培养基上,在10℃的培养条件倒置培养5天,加入适量的稀碘液,观察菌落周围是否有透明圈产生,若有,对其进行淀粉酶活的测定。
本实施方式中,将在低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株采用福林试剂法测定其蛋白质降解率。
本实施方式中,将在低温高效糖降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株采用菲林试剂法测定其糖降解率。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式二不同的是:步骤二中所述的低温高效纤维素降解细菌的固体培养基为羧甲基纤维素钠培养基,配方如下:15.0g的羧甲基纤维素钠、1.4g的(NH4)2SO4、0.5g的MgSO4·7H2O、2.0g的K2HPO4、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.6mg的MnSO4、1.7mg的ZnCl2、20g的琼脂、1.7mg的CoCl2和1000mL的蒸馏水,自然pH;
步骤二中所述的低温高效淀粉降解细菌所使用的固体培养基为淀粉培养基,配方如下:10g的可溶性淀粉、3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的NaCl、20g的琼脂和1000mL的蒸馏水,pH调至7.0;
步骤二中所述的低温高效蛋白质降解细菌所使用的固体培养基为酪素培养基,配制如下:A液:1.07g的Na2HPO4.7H2O和4g的干酪素,加水后加热溶解;B液:将0.36g的KH2PO4加水溶解;将A液和B液混合后,加入酪素水解液100mL和20g的琼脂,再加入蒸馏水1000mL,自然pH,即得;其中,酪素水解液配制如下:将1g的酪蛋白溶于碱性缓冲液中,再加入质量百分含量为1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL,加水至100mL,30℃水解1h,即得;
步骤二中所述的低温高效糖降解细菌所使用的固体培养基为乳糖蛋白胨培养基,配方如下:3g牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的氯化钠、5g的乳糖、20g的琼脂和1000mL的蒸馏水,pH调至7.3。其它与具体实施方式二相同。
本实施方式所述的自然pH是指pH=7.0。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式二不同的是:步骤三和四中所述的四种菌的液体培养基如下:
低温高效纤维素降解细菌的液体培养基为羧甲基纤维素钠培养基,配方如下:15.0g的羧甲基纤维素钠、1.4g的(NH4)2SO4、0.5g的MgSO4·7H2O、2.0g的K2HPO4、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.6mg的MnSO4、1.7mg的ZnCl2、1.7mg的CoCl2和1000mL的蒸馏水,自然pH;
低温高效淀粉降解细菌所使用的液体培养基为淀粉培养基,配方如下:10g的可溶性淀粉、3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的NaCl和1000mL的蒸馏水,pH调至7.0;
低温高效蛋白质降解细菌所使用的液体培养基为酪素培养基,配制如下:A液:1.07g的Na2HPO4.7H2O和4g的干酪素,加水后加热溶解;B液:将0.36g的KH2PO4加水溶解;将A液和B液混合后,加入酪素水解液100mL,再加入蒸馏水1000mL,自然pH,即得;其中,酪素水解液配制如下:将1g的酪蛋白溶于碱性缓冲液中,再加入质量百分含量为1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL,加水至100mL,30℃水解1h,即得;
低温高效糖降解细菌所使用的液体培养基为乳糖蛋白胨培养基,配方如下:3g牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的氯化钠、5g的乳糖和1000mL的蒸馏水,pH调至7.3。其它与具体实施方式二相同。
具体是实施方式六:本实施方式的一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的应用,它用于生活垃圾处理。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式六不同的是:它是按如下方式进行生活垃圾处理:按堆肥有机生活垃圾质量的0.5%~8.0%的比例投加权利要求1的生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,进行动态发酵。其它与具体实施方式六相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容,其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果:
实施例1生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂应用于好氧堆肥
请参阅附图1~图13。
实施例1按照以下步骤进行:
1.制作生活垃圾跌温暖高效降解功能复合菌剂:
低温高效降解菌筛选过程如下:
一、将采集的土壤样品混合均匀,按质量体积比为1g:10mL的比例将土壤样品溶于无菌水中,加入玻璃珠,在转速为160r/min的摇床中振荡培养1h,取上清液溶于无菌水中,分别配制成10-1至10-12的浓度梯度的菌悬液;其中,采集的土壤样品为-10℃环境下采集的土壤样品;
二、取步骤一中配制的各浓度梯度的菌悬液,将各浓度梯度的菌悬液分别涂布于低温高效纤维素降解细菌的固体培养基、低温高效淀粉降解细菌的固体培养基、低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基和低温高效糖降解细菌的固体培养基上,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
三、挑取步骤二中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落分别接种于对应的四种菌的液体培养基中,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
四、分别取步骤三在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,分别以2%的接种量接种对应的四种菌的液体培养基内,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
五、重复步骤四的操作2次;
六、分别取步骤五在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,在其对应的四种菌的固体培养基上分别进行划线,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
七、分别挑取步骤六中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落,重新进行划线按照步骤六的条件进行培养,直至培养出单菌落,即得到低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌的纯菌株。
八、将步骤七筛选得到的低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液的浊度OD600均调至1.9~2.1,然后将低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液按照体积比为1:1:1:1的比例混合均匀,即得生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂;
其中,所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成;
所述的低温高效纤维素降解细菌的液体培养基为羧甲基纤维素钠培养基,配方如下:15.0g的羧甲基纤维素钠、1.4g的(NH4)2SO4、0.5g的MgSO4·7H2O、2.0g的K2HPO4、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.6mg的MnSO4、1.7mg的ZnCl2、1.7mg的CoCl2和1000mL的蒸馏水,自然pH;低温高效纤维素降解细菌的固体培养基为在上述液体培养基配方基础上另加20g的琼脂;
所述的低温高效淀粉降解细菌所使用的液体培养基为淀粉培养基,配方如下:10g的可溶性淀粉、3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的NaCl和1000mL的蒸馏水,pH调至7.0;低温高效淀粉降解细菌所使用的固体培养基为在上述液体培养基配方基础上另加20g的琼脂;
所述的低温高效蛋白质降解细菌所使用的液体培养基为酪素培养基,配制如下:A液:1.07g的Na2HPO4.7H2O和4g的干酪素,加水后加热溶解;B液:将0.36g的KH2PO4加水溶解;将A液和B液混合后,加入酪素水解液100mL,再加入蒸馏水1000mL,自然pH,即得;其中,酪素水解液配制如下:将1g的酪蛋白溶于不多于50mL的碱性缓冲液中,再加入质量百分含量为1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL,加水至100mL,30℃水解1h,即得;低温高效蛋白质降解细菌所使用的基固体培养基为在上述液体培养基配方基础上另加20g的琼脂;
所述的低温高效糖降解细菌所使用的液体培养基为乳糖蛋白胨培养基,配制如下:3g牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的氯化钠、5g的乳糖和1000mL的蒸馏水,pH调至7.3;低温高效糖降解细菌所使用的固体培养基为在上述液体培养基配方基础上另加20g的琼脂。
将在低温高效纤维素降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株点种在羧甲基纤维素钠固体培养基上,在10℃的培养条件倒置培养5天,加入1mg/mL的刚果红染色1h,随后用1mol/L的NaCl脱色15min,观察菌落周围是否有透明圈产生,若有,对其进行纤维素酶活测定。
将在低温高效淀粉降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株点种在淀粉固体培养基上,在10℃的培养条件倒置培养5天,加入适量的稀碘液,观察菌落周围是否有透明圈产生,若有,对其进行淀粉酶活的测定。
将在低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株采用福林试剂法测定其蛋白质降解率。
将在低温高效糖降解细菌的固体培养基中分离的纯菌株采用菲林试剂法测定其糖降解率。
堆肥:堆肥生活垃圾中各成分的含量依据我国农村生活垃圾组分比例设计(垃圾成分见表1),垃圾样品取自五大连池风景区,甘泉村,清泉村和双泉村附近几个垃圾中转站的新鲜生活垃圾,混匀后在堆肥反应器实验装置中,实验组按照堆肥质量的2%添加实施例1的生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,对照组不添加任何物质;
两组均在同样的环境条件下堆肥,定期通风,分别对实验组和对照组堆肥中的温度、pH、含水率、电导率、有机质含量、全碳含量、全氮含量、碳氮比、铵态氮含量、硝态氮含量、全磷含量和种子发芽指数进行监测,实验结果见附图1~13。
表1 堆肥生活垃圾组分含量
堆肥实验进行了40天,通过对比添加低温功能复合菌剂的实验组和对照组色度、温度、pH、含水率、电导率、有机质含量、全碳含量、全氮含量、碳氮比、铵态氮含量、硝态氮含量、全磷含量和种子发芽指数结果可以发现,堆肥过程中对照组物料颜色浅灰色,而实验组物料颜色变黑,堆肥产品腐熟之后呈现黑色或者黑褐色;对照组温度一直未到高温阶段,到第36天才达到30℃,而实验组堆肥物料在第11天进入中温期,5天后进入高温阶段,高温阶段持续了11天,最高温度达到61.2℃,从第27天进入降温腐熟期,第33天堆肥物料腐熟;对照组的pH一直在7.5左右浮动,而实验组的pH一直处于上升趋势,初始为7.49,在第36天达到了8.85,腐熟的堆肥pH一般在8-10之间,达到腐熟标准;对照组的含水率变化不大,在第36天为57.4%,而实验组含水率变化较大,从最初的69.4%下降到27.7%,腐熟的堆肥物料含水率应低于35%,达到腐熟标准;对照组的电导率变化范围不大,实验组从第26天达到9.0mS/cm,堆肥的电导率若小于9.0mS/cm,对种子发芽不会产生抑制作用,电导率的变化说明堆肥达到腐熟标准;,对照组的有机质总体上没有被降解,在第36天才达到56.3%,而实验组在第36天达到了26.43%;对照组碳含量变化不大,而实验组在第36天时降至20%以下,成熟堆肥的全碳应该在20%以下,达到腐熟标准;对照组的氮含量在堆肥过程中基本保持不变,而实验组变化明显,在第36天达到了3.21%,全氮变化呈现出堆肥初期下降,随后又缓慢上升的趋势,这是由于堆肥初期微生物分解有机氮转化为铵态氮,并进一步挥发,氮素的损失较为严重,后来全氮含量升高,由于堆肥过程中微生物将有机物分解为CO2和H2O,堆肥总体质量减少,从而导致堆肥绝对氮含量下降,而相对含量增大,腐熟的堆肥全氮含量应该在2.5%以上,达到腐熟标准;对照组C/N无太大浮动,而实验组C/N变化较为明显,从34:1下降至第36天的14:1,腐熟的堆肥C/N在16:1以下,达到腐熟标准;对照组的氨氮含量处于一直上升的趋势,而实验组上升到第20天达到最大值,为1321mg/kg,之后开始下降,第36天达到421mg/kg,腐熟的堆肥氨氮含量在400mg/kg左右,达到腐熟标准;对照组硝态氮含量数值基本无变化,而实验组的硝态氮含量在第36天已经达到了2300mg/kg,腐熟堆肥的硝态氮含量应该在1900mg/kg以上,达到腐熟标准;对照组全磷含量基本保持不变,而实验组则呈现逐渐上升的趋势,在第36天为2.77%,腐熟堆肥的全磷含量应该在2.5%左右,达到腐熟标准;对照组发芽指数始终未达到20%,而实验组在第20天时已经达到78%以上,腐熟堆肥的种子发芽指数在60%以上,达到腐熟标准。以上说明生活垃圾堆肥过程中添加低温功能复合菌剂后可使生活垃圾迅速升温,缩短发酵周期,提高转化效率,加速堆肥物料腐熟。
Claims (7)
1.一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,其特征在于所述菌剂由低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌组成,各菌剂体积比为1:1:1:1;
所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
2.一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,其特征在于它是按照以下步骤进行的:
一、菌株的筛选:采用稀释涂布、分离划线和传代培养的方法筛选低温高效降解菌;
二、菌剂的制作:将步骤一筛选得到的低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液的浊度OD600均调至1.9~2.1,然后将低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌菌悬液按体积比为1:1:1:1的比例混合均匀,即得生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂;
其中,所述低温高效纤维素降解细菌由高产纤维素酶的节杆菌属(Arthrobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)按体积比为1:3:2的比例混合而成;
低温高效淀粉降解细菌由高产淀粉酶的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)和节杆菌属(Arthrobacter sp.)按体积比为1:2:3的比例混合而成;
低温高效蛋白质降解细菌由高产蛋白质酶的佐氏库特菌属(Kurthia sp)、莫拉氏菌属(Moraxella fulton sp.)和克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)按体积比为1:1:1的比例混合而成;
低温高效糖降解细菌由高产乳糖酶的至贺氏菌属(Shigella sp.)、单胞菌属(Pseudomonas sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、伯克氏菌属(Burkholderia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按体积比为1:1:1:1:1的比例混合而成。
3.根据权利要求2所述的一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,其特征在于步骤一种采用稀释涂布、分离划线和传代培养的方法筛选低温高效降解菌的具体过程如下:
一、将采集的土壤样品混合均匀,按质量体积比为1g:10mL的比例将土壤样品溶于无菌水中,加入玻璃珠,在转速为160r/min的摇床中振荡培养1h,取上清液溶于无菌水中,分别配制成10-1至10-12的浓度梯度的菌悬液;其中,采集的土壤样品为-10℃环境下采集的土壤样品;
二、取步骤一中配制的各浓度梯度的菌悬液,将各浓度梯度的菌悬液分别涂布于低温高效纤维素降解细菌的固体培养基、低温高效淀粉降解细菌的固体培养基、低温高效蛋白质降解细菌的固体培养基和低温高效糖降解细菌的固体培养基上,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
三、挑取步骤二中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落分别接种于对应的四种菌的液体培养基中,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
四、分别取步骤三在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,分别以2%的接种量接种对应的四种菌的液体培养基内,在温度为10℃、转速为160r/min的条件下培养5天;
五、重复步骤四的操作2次;
六、分别取步骤五在四种菌的液体培养基内培养后的培养液,在其对应的四种菌的固体培养基上分别进行划线,然后在10℃的条件下倒置培养5天;
七、分别挑取步骤六中在四种菌的固体培养基上生长的单菌落,重新进行划线培养,直至培养出单菌落,即得到低温高效纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白质降解细菌和糖降解细菌的纯菌株。
4.根据权利要求3所述的一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,其特征在于步骤二中所述的低温高效纤维素降解细菌的固体培养基为羧甲基纤维素钠培养基,配方如下:15.0g的羧甲基纤维素钠、1.4g的(NH4)2SO4、0.5g的MgSO4·7H2O、2.0g的K2HPO4、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.6mg的MnSO4、1.7mg的ZnCl2、20g的琼脂、1.7mg的CoCl2和1000mL的蒸馏水,自然pH;
步骤二中所述的低温高效淀粉降解细菌所使用的固体培养基为淀粉培养基,配方如下:10g的可溶性淀粉、3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的NaCl、20g的琼脂和1000mL的蒸馏水,pH调至7.0;
步骤二中所述的低温高效蛋白质降解细菌所使用的固体培养基为酪素培养基,配制如下:A液:1.07g的Na2HPO4.7H2O和4g的干酪素,加水后加热溶解;B液:将0.36g的KH2PO4加水溶解;将A液和B液混合后,加入酪素水解液100mL和20g的琼脂,再加入蒸馏水1000mL,自然pH,即得;其中,酪素水解液配制如下:将1g的酪蛋白溶于碱性缓冲液中,再加入质量百分含量为1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL,加水至100mL,30℃水解1h,即得;
步骤二中所述的低温高效糖降解细菌所使用的固体培养基为乳糖蛋白胨培养基,配方如下:3g牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的氯化钠、5g的乳糖、20g的琼脂和1000mL的蒸馏水,pH调至7.3。
5.根据权利要求3所述的一种制备生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的方法,其特征在于步骤三和四中所述的四种菌的液体培养基如下:
低温高效纤维素降解细菌的液体培养基为羧甲基纤维素钠培养基,配方如下:15.0g的羧甲基纤维素钠、1.4g的(NH4)2SO4、0.5g的MgSO4·7H2O、2.0g的K2HPO4、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.6mg的MnSO4、1.7mg的ZnCl2、1.7mg的CoCl2和1000mL的蒸馏水,自然pH;
低温高效淀粉降解细菌所使用的液体培养基为淀粉培养基,配方如下:10g的可溶性淀粉、3g的牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的NaCl和1000mL的蒸馏水,pH调至7.0;
低温高效蛋白质降解细菌所使用的液体培养基为酪素培养基,配制如下:A液:1.07g的Na2HPO4.7H2O和4g的干酪素,加水后加热溶解;B液:将0.36g的KH2PO4加水溶解;将A液和B液混合后,加入酪素水解液100mL,再加入蒸馏水1000mL,自然pH,即得;其中,酪素水解液配制如下:将1g的酪蛋白溶于碱性缓冲液中,再加入质量百分含量为1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL,加水至100mL,30℃水解1h,即得;
低温高效糖降解细菌所使用的液体培养基为乳糖蛋白胨培养基,配方如下:3g牛肉膏、10g的蛋白胨、5g的氯化钠、5g的乳糖和1000mL的蒸馏水,pH调至7.3。
6.一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的应用,其特征在于它用于生活垃圾处理。
7.根据权利要求6所述的一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂的应用,其特征在于它是按如下方式进行生活垃圾处理:按堆肥有机生活垃圾质量的0.5%~8.0%的比例投加权利要求1的生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂,进行动态发酵。
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