CN116333944B - 一种节杆菌c2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用 - Google Patents

一种节杆菌c2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用，属于木质素降解技术领域。本发明提供的耐冷木质素降解节杆菌（Arthrobactersp.）C2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。本发明的节杆菌C2及其重组节杆菌能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，提高了严寒地区秸秆还田的效率，降低了成本，提高了经济效益。

Description

一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用
技术领域
本发明涉及木质素降解技术领域，尤其涉及一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。
背景技术
木质素是由各种芳香族单体结构组成的复杂大分子化合物，各种单体之间通过醚键与碳碳键相连接。作为秸秆的重要组成成分之一，木质素的结构组成十分稳定，难以被微生物水解酶降解。同时，由于我国北方地区冬季时间长，平均气温低，严重影响了微生物降解秸秆的效率，阻碍秸秆还田工作的推进。因此，提高耐冷木质素降解菌的低温耐受能力及低温木质素降解能力对于提高秸秆降解效率，同时推进北方秸秆还田工作进程有非常重要的意义。
生物处理法是微生物通过生理代谢产生各种水解酶降解木质素，其降解酶包括：染料脱色过氧化物酶（Dye-decolorizing peroxidase, DyP）、锰过氧化物酶（manganeseperoxidase, MnP）、漆酶（laccase, Lac）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase, LiP）。其中，染料脱色过氧化物酶是一类含血红素的微生物过氧化物酶，它可以参与菌体氧化应激调节，提高菌体对氧化能力抗性，并且对木质素的降解发挥重要的作用，是处理农业废料等生物生产工艺过程中的理想酶。
研究表明，当环境温度降低时，生物体内一种蛋白的表达水平会显著提高，被称为“冷休克蛋白(coldshockprotein, Csp)”。Csp是一类结构高度保守，分子量约7.4 KDa的核酸结合蛋白，被发现广泛存在于各种微生物体内，并对微生物的耐冷适应机制发挥着重要的作用。Csp作为分子伴侣能够在冷应激时上调表达，增加翻译效率，以这种方式改善微生物在低温下受到抑制的生理代谢，增强菌体的低温适应能力。
存在于低温环境中的微生物，在长期的进化中获得了能够在寒冷环境中生存的能力。它们具有独特的低温启动子，使RNA聚合酶即使在0℃也能进行基因的高效转录。目前，国际上有关低温启动子的研究主要以大肠杆菌冷休克蛋白启动子为主，但研究表明，冷休克蛋白启动子并非完全温度敏感型启动子，其能够在常温下微弱转录，并且在低温下增强转录，而不需要其他调控因子的参与。因此，将低温启动子用于构建温度敏感型表达载体，可以使载体通过温度变化控制目的基因的表达，不需要外源诱导剂的添加，避免了过度的经济支出以及化学药剂对细胞造成毒性。这使得低温表达系统具有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。本发明的节杆菌C2和重组节杆菌能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，提高了严寒地区秸秆还田的效率，降低了成本，提高了经济效益。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株耐冷木质素降解节杆菌（Arthrobactersp.）C2，所述节杆菌C2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。
本发明还提供了一种上述节杆菌C2在降解木质素中的应用，所述节杆菌C2降解木质素时的温度为15~25℃。
本发明还提供了一种来自上述节杆菌C2基因组的低温诱导型强启动子P2789，所述强启动子P2789的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明还提供了一种重组节杆菌，以上述节杆菌C2为底盘微生物，包含目的基因和上述强启动子P2789。
优选的，所述目的基因为冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因。
优选的，所述目的基因位于所述强启动子P2789的下游。
本发明还提供了一种上述重组节杆菌的构建方法，将冷休克蛋白基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA-Csp；
将染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA-DyP；
将冷休克蛋白基因和染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2 pA-PCD。
本发明还提供了一种上述重组节杆菌在降解木质素中的应用，所述重组节杆菌降解木质素时的温度为15~25℃。
本发明提供了一种节杆菌C2及其重组节杆菌在降解木质素中的应用。本发明以节杆菌C2为底盘微生物，筛选出了能够在低温条件下诱导基因高效表达的低温诱导型强启动子P2789，通过将该启动子与冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因串联，并在节杆菌C2过表达，制备得到了单基因过表达重组节杆菌C2 pA-Csp和C2 pA-DyP，双基因共表达重组菌C2 pA-PCD。
本发明的节杆菌C2和重组节杆菌C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD能够在25℃以下的环境中有效降解木质素，当培养温度是15℃，培养时间7 d的时候，检测出木质素降解率可达44.14%。本发明提供的节杆菌C2及其重组节杆菌显著提高了菌株的低温适应能力和木质素的降解率，为提高严寒地区秸秆还田效率提供了优质的菌种资源和菌种改造技术方法。
附图说明
图1为筛选出来的菌株C2在苯胺蓝固体培养基中产生的脱色圈。
图2为菌株C2的菌落形态分布图。
图3为菌株C2经革兰氏染色后在光学显微镜下的菌体形态图。
图4为菌株C2在透射电镜下的菌体形态图。
图5为菌株C2的16S rDNA序列扩增产物电泳检验图。
图6为基于16S rDNA序列的菌株C2相似菌株的系统发育树。
图7为提取的节杆菌C2基因组DNA的电泳检测结果图。
图8为启动子PCR扩增产物电泳检测结果图，条带1为P0229，条带2为P1273，条带3为P1513，条带4为P2014，条带5为P2789，条带6为P3150，条带7为P3160。
图9为启动子片段与pUCm-T克隆载体的连接过程示意图。
图10为pET-promoter-RFP载体构建过程示意图。
图11为pET-promoter-RFP载体电泳验证结果图。
图12为启动子控制的RFP基因相对荧光强度检测结果图，0 h为冷激前样品的相对荧光强度，2 h为冷激后2 h时样品的相对荧光强度，4 h为冷激后4 h时样品的相对荧光强度，8 h为冷激后8 h时样品的相对荧光强度。
图13为启动子控制的RFP基因mRNA相对转录水平计算结果图。
图14为表达载体pA-Csp、pA-Dyp、pA-PCD的验证结果图，其中A为pA-Csp载体的验证结果电泳图，B为pA-DyP载体的验证结果电泳图，C为pA-PCD载体的验证结果电泳图。
图15为25℃和15℃条件下细菌生长量和木质素降解率测定结果图，其中，A图中的折线表示25℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量测定结果，直方图表示25℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的木质素降解率测定结果；B图中的折线表示15℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量测定结果，直方图表示15℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的木质素降解率测定结果。
保藏说明
节杆菌（Arthrobacter sp.）C2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了耐冷木质素降解节杆菌Arthrobacter sp. C2的筛选过程。此节杆菌筛选自秸秆垛底部冰冻土壤（温度-10.0℃）。具体过程如下：
1.耐冷木质素降解菌株的筛选与分离
称取10 g土壤样品，加入装有90 mL秸秆木质素富集培养基（培养基组分：木质素15.0 g、(NH4)2SO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 2.0 g、CaCl2 0.3 g、FeSO4·7H2O 5mg、MnSO4 1.6 mg、ZnCl2 1.7 mg和CoCl2 1.7 mg，用蒸馏水定容至1L，pH 7.0，于121℃高压灭菌20 min，4℃保存备用）的三角瓶中，置于摇床上振荡培养，10℃，160 r/min，培养2代，取第2代培养液10 mL转接到木质素磺酸钠富集培养基中（培养基组分：木质素磺酸钠15.0g、(NH4)2SO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 2.0 g、CaCl2 0.3 g、FeSO4·7H2O 5 mg、MnSO4 1.6 mg、ZnCl2 1.7 mg和CoCl2 1.7 mg，用蒸馏水定容至1L，pH 7.0，于121℃高压灭菌20 min，4℃保存备用），于相同条件下继续培养。取1 mL富集培养液注入盛有9 mL无菌水的试管中，充分混匀。然后再用1 mL的无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管以此类推制成10-1~10-8各种稀释度的样品溶液。分别吸取10-5、10-6、10-7的稀释液0.1 mL，在木质素磺酸钠固体培养基平板上涂布，置于10℃恒温培养箱中倒置培养，待其长出菌落。将长出的单菌落挑出划线，经反复划线纯化得到单菌落，并且将菌株接种于含有0.1 g/L的苯胺蓝固体平板培养基上，10℃倒置培养，以苯胺蓝固体培养基中菌落周围是否产生脱色圈来定性检测菌株是否具有木素过氧化物酶（LiP）活性及锰过氧化物酶（MnP）活性，挑选出脱色圈明显的菌株。如图1所示，筛选出能够在10℃低温条件下生长并产生脱色圈的细菌菌株1株，命名为C2。
2.耐冷木质素降解菌的鉴定
2.1菌株形态学特征分析
对筛选出的木质素降解菌株进行形态观察，将该菌株C2在木质素平板上划线，10℃，培养7 d后，其菌落形态分布如图2所示，可以看出，该菌株可形成圆形凸起、边缘整齐、不透明、表面光滑湿润有光泽的黄色菌落，直径4 mm左右。
挑取单菌落进行革兰氏染色、芽孢染色，在光学显微镜及透射电子显微镜下观察菌体形态，革兰氏染色后的菌株在光学显微镜下的菌体形态如图3所示，可以看出，该菌株为革兰氏阳性细菌，菌体细胞呈不规则的杆状。透射电镜下的菌体形态如图4所示（放大倍数60000×），该菌体细胞无芽孢、无鞭毛、无纤毛，细胞大小为0.845 μm×1.484 μm。
2.2菌株生理生化特征分析
菌株生理生化特征分析根据《常见细菌系统鉴定手册》进行。如表1所示，菌株C2生理生化试验结果，将试验所得菌株C2生理生化指标与《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)中各模式菌株生理生化指标进行比对，初步确定C2为节杆菌属（Arthrobactor sp.）。
表1 菌株C2生理生化特征试验结果
注:“+”代表阳性;“-”代表阴性。
2.3 16S rDNA序列测定
按照宝生物工程（大连）有限公司DNA基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌C2的基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA条带大小。采用细菌的16S rDNA通用引物BSF8/20(27F)和BSF1510/1492(1492R)对各菌株16S rDNA进行PCR扩增，反应体系为：2 μLdNTP、2.5 μL buffer、0.5 μL Forward primer、0.5 μL Reverse primer、0.5 μL rTaq酶、1.5 μL模板DNA、ddH2O补齐至25 μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃保持。通用引物序列如表2所示。图5是耐冷木质素降解菌C2 PCR的电泳结果，大小约为1400 bp左右。
表2 菌株16S rDNA扩增引物
2.4 系统发育树构建
数据处理采用BLAST软件在GenBank进行同源性比较，采用MEGA 7.0软件进行多序列比对，采用邻接法构建系统发育树，如图6所示，可以看出，菌株C2 16S rDNA序列与Arthrobacter sulfureusstrain OB130 (KF424296.1)、Arthrobactersp. Amico5(AY512632.1)相似性为99%。由此确定C2为节杆菌属（Arthrobactorsp.）。将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCC No.20606。
实施例2
本实施例从耐冷木质素降解节杆菌C2（保藏编号：CGMCC No.20606）中筛选得到了一种低温诱导型强启动子P2789。具体过程如下：
1.转录子表达量筛选
将过夜活化的节杆菌C2接种于葡萄糖培养基中，在常温（25℃）条件下培养12 h后，迅速转移至5℃条件下冷激4 h，以常温培养的菌液为对照组，冷激后的菌液为实验组。分别提取对照组与实验组细菌总RNA，并进行转录组测序。根据25℃和5℃处理的C2菌株的基因转录组数据，以基因表达量FPKM值为标准，筛选在25℃下显著上调表达前10的基因的启动子序列片段和5℃下表达量高于常温表达量的基因的启动子序列。转录组表达基因筛选结果如表3所示。
表3 转录组表达基因筛选结果
从表3可以看出，基因C2_GM002014和C2_GM001273是节杆菌C2中天然的冷休克蛋白基因。根据冷休克蛋白启动子的结构特性，二者有可能属于低温敏感型启动子。另外，基因C2_GM001513、C2_GM002789和C2_GM003160从转录组表达量前10的基因筛选出，且这些基因在5℃下的基因表达量高于25℃下的基因表达量。此外，基因C2_GM003150和C2_GM000229在转录组表达量前20的基因筛选出，且低温表达量高于常温表达量10倍以上。选择上述基因并克隆其启动子区域，进行启动子表达能力筛选。
2.启动子功能区预测
使用原核启动子在线分析预测网站BPROM（http://linux1.softberry.com/）预测启动子-10区、-35区及间隔区距离，预测结果如表4所示。
表4 启动子预测结果
从表4可以看出，启动子P2014、P2789、P3160、P0229的间隔区距离分别为18 bp、16 bp、16 bp和17 bp，符合强启动子标准。但由于启动子结构预测的结果可能会存在一定的偏差，后续将构建报告基因表达系统以验证启动子强度。
3.构建报告基因表达系统验证启动子强度
3.1 提取节杆菌C2菌株基因组总DNA
按照宝生物工程（大连）有限公司DNA基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌C2的基因组DNA。取LB培养基过夜培养的节杆菌C2菌液，12000 rpm离心5 min富集菌体。加入180 µL溶菌酶（20 mg/mL）裂解液，37℃孵育30 min。加入20 μL Proteinase K溶液，震荡混匀。加入250 μL Buffer GB，震荡混匀后，在70℃水浴10 min。将上清液转移至吸附柱内，过柱纯化。12000 rpm离心2 min，弃下层滤液。加入500 μL Buffer PB试剂，12000 rpm离心1 min，弃下层滤液。加入600 μL PW，12000 rpm离心1 min，弃滤液。将收集管置于1.5 mL离心管上，向吸附柱中滴入50 μL ddH2O，室温放置5 min，12000 rpm离心1 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA条带大小，电泳结果如图7所示。可以看出，目的条带位于15000 bpDNA marker 条带上方，表明节杆菌C2基因组DNA提取成功。
3.2 PCR扩增启动子序列
将目的基因开放阅读框起始密码子上游区域至上一个基因终止密码子之间的区域定义为启动子区域，以节杆菌C2的基因组DNA作为模板，克隆启动子片段。启动子扩增引物序列如表5所示。
表5 启动子PCR引物序列
反应体系为：2 μL C2 Genomic DNA、1 μL Forward primer、1 μL Reverseprimer、25 μL 2×Taq PCR Master Mix、ddH2O补齐至50 μL；反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃保持。
将扩增产物经琼脂凝胶电泳，条带如图8所示，其中条带1为P0229，条带2为P1273，条带3为P1513，条带4为P2014，条带5为P2789，条带6为P3150，条带7为P3160。各个启动子序列大小均在200-500 bp之间。扩增条带胶回收后送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果与基因组测序序列一致。P0229的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；P1273的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；P1513的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；P2014的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示；P2789的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；P3150的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；P3160的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
3.3 启动子序列连接pUCm-T载体
分别将上述PCR扩增出的各个启动子片段（目的基因片段）连接至pUCm-T克隆载体上，连接过程如图9所示。连接体系为：2 μL目的基因片段、1 μL pUCm-T载体、1 μL 10×Ligation Buffer、1 μL 50% PEG 4000、1 μL T4 DNA连接酶、无菌ddH2O补齐至10μL。将连接体系于16℃恒温过夜反应，成功连接的载体分别命名为pUCm-T-promoter。
3.4 E.coli DH5α感受态细胞的制备
根据超级感受态细胞制备试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）说明书，将E.coli DH5α细胞于LB平板上进行划线，经37℃培养16 h后，挑取正常生长的单菌落于LB培养基中，37℃，160 rpm活化培养16 h。挑取活化后的菌液接种于准备好的50 mL BT Media中，于37℃摇床中培养至菌液OD600=0.5，将菌液转移至50 mL离心管中，冰浴5 min。4℃，5000 rpm离心，收集菌体。使用16 mL冰上预冷的BT Buffer A轻柔充分重悬菌体，冰浴15min。4℃，5000 rpm离心，收集菌体后，加入4 mL冰上预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体，并按照每管100 µL感受态细胞分装到干净的1.5 mL离心管内。
3.5 热激法转化pUCm-T-promoter克隆载体进入E.coli DH5α感受态细胞
取100 µL 3.4中的感受态细胞，冰浴30 min。42℃热激90 s后冰浴5 min，加入900µL SOC培养基，37℃振荡培养1 h后，4000 rpm离心3 min，用枪头吸取750 µL上清液，用100µL SOC培养基重新悬浮细胞。将细胞悬液稀释至10-6倍均匀涂布在Amp抗性LB固体平板（含20 µL IPTG，100 µL X-gal）上。过夜培养后，进行蓝白斑菌落筛选，挑取白斑菌落进行目的基因PCR鉴定，将鉴定阳性的菌落接种于含有100 mg/L Amp的LB培养基中，37℃，160 rpm培养，取样送往上海生工生物工程股份有限公司测序，保留测序正确的菌株。
3.6 构建启动子表达载体pET-promoter-RFP
将测序正确的含有不同启动子的pUCm-T-promoter的DH5α菌株分别接种于含有100 mg/L Amp的LB液体培养基中，37℃，160 rpm过夜培养。使用质粒提取试剂盒（EasyPurePlasmid MiniPrep Kit）提取pUCm-T-promoter质粒。配制双酶切体系：5 μL pUCm-T-promoter / pET-RFP、2 μL 10×Ligation Buffer、1 μL Quickcut BamH I酶、1 μLQuickcut Kpn I酶、无菌ddH2O补齐至20 μL，双酶切pUC-promoter质粒和pET-RFP质粒，将双酶切体系于35℃水浴下酶切30 min。反应结束后，纯化回收目的基因片段。
纯化后的目的基因片段直接用于进行连接反应。连接体系为：4 μL目的基因片段、10 μL酶切后的pET-promoter-RFP片段、1 μL 10×Ligation Buffer、1 μL 50% PEG 4000、1 μL T4 DNA连接酶、无菌ddH2O补齐至20 μL。将连接体系于16℃过夜反应，构建得到表达载体pET-promoter-RFP。构建过程如图10所示。
按照3.5的热激法将pET-promoter-RFP转化进入E.coli BL21感受态细胞中。将转化的菌株在含100 mg/L Amp的LB固体培养基上涂布，37℃培养16 h。并挑取平板上生长的菌落于100 mg/L Amp的LB液体培养基中。
3.7 启动子片段与RFP基因连接验证
从3.6成功转化pET-promoter-RFP载体的BL21细胞中提取pET-promoter-RFP载体，并使用Quickcut BamH I和Quickcut EcoR I双酶切pET-promoter-RFP重组表达载体。使用1%琼脂糖凝胶电泳验证结果，验证结果如图11所示，pET-promoter-RFP载体（约5000bp）和promoter-RFP基因重组片段（约1000 bp）条带与电泳结果长度一致，证明载体构建成功。
3.8 启动子控制的RFP基因相对荧光强度检测
将3.6成功转化pET-promoter-RFP载体的BL21菌种接种于含100 mg/L Amp的LB液体培养基中，37℃，160 rpm培养16 h后，以1%的接种量转接于含100 mg/L Amp的LB的2 mL48孔板中。37℃，220 rpm培养16 h。然后将其冰浴冷激5 min，转入15℃，160 rpm条件下培养，分别于2 h、4 h、8 h时取样。用多功能酶标仪分别检测冷激前样品（0 h）和冷激后不同时间点取得的菌体浓度（OD600值）和荧光强度（激发波长588 nm，发射波长618 nm），用荧光强度值除以OD600值，即得到各个启动子控制的RFP基因表达的相对荧光强度。
结果如图12所示。可以看出，经过37℃，16 h培养后，相对荧光强度从高到低依次为：P2789（1778.13）＞P2014（1362.61）＞P1513（942.46）＞P3150（830.13）＞P3160（771.61）＞P0229（780.02）＞P1273（647.27），括号内为相对荧光强度。经过15℃，8 h冷诱导后的相对荧光强度从高到低依次为：P2789（6490.29）＞P2014（4162.21）＞P3150（2634.05）＞P3160（2467.93）＞P1513（2237.62）＞P0229（1826.56）＞P1273（1497.06）。可见，含有启动子P2789的重组菌经冷激诱导8 h后，P2789诱导的RFP基因相对荧光强度较冷诱导之前的相对荧光强度提高了3.65倍，为所有启动子中最高水平，因此，P2789低温诱导能力最强。
3.9 RT-qPCR检测启动子控制的RFP基因mRNA相对转录水平
为了进一步验证各启动子的低温诱导能力，使用RT-qPCR检测了启动子控制的RFP基因mRNA相对转录水平。启动子控制下RFP基因mRNA的相对转录水平能够反映出冷激诱导之后启动子诱导强度的变化。将3.6成功转化pET-promoter-RFP载体的BL21菌种在37℃，160 rpm条件下培养16 h，然后将其冰浴冷激5 min，转入15℃，160 rpm条件下培养，分别于2 h、4 h、8 h时取样。分别测定冷激前和冷激后不同时间点取得的样品RFP基因的mRNA相对表达量，测定过程如下：
取2 mL菌种细胞悬液于离心管中，4℃下6000 rpm离心10 min，使用800 μLTRIZOL溶液重悬，室温静置5 min，加入200 μL氯仿，震荡混匀15 s后，室温放置3 min后，4℃、8000 rpm离心15 min；吸取上层水相转移至干净离心管中，加入0.5 mL异丙醇混匀，室温放置10 min后，4℃、12000 rpm离心，弃上清，室温下晾干，向离心管中加入50 μL DEPC水溶解RNA。使用cDNA反转录试剂盒对RFP基因进行反转录。cDNA合成反应体系：4 μL 5×qRTSuperMix a、1 pg-1 μgRNA模板、RNase free ddH2O补齐至20 μL。逆转录反应体系为：50℃15 min，80℃ 2 min。
RFP基因的RT-qPCR引物如表6所示，配制RT-qPCR扩增反应体系：10 μL 2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master MIX a、0.4 μL Primer F、0.4 μL Primer R、2 μL cDNA模板、ddH2O补齐至20 μL，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，40个循环。融解反应程序为：95℃ 15 s，65℃ 60 s，95℃ 30 s，60℃ 15 s。获得各样品的CT值，用相对定量2-△△CT法进行分析，以内参基因16S rRNA校正。
表6 RT-qPCR扩增引物
按照（冷激不同时间后mRNA相对表达量/冷激前的mRNA相对表达量）计算各启动子的转录水平，计算结果如图13所示，可以看出，启动子P2014、P2789、P3150在冷激后的转录水平较高，分别为冷激前的4.51倍、8.99倍和2.81倍。其中，启动子P2789的低温诱导能力最强，与上述相对荧光强度检测结果一致。因此，选择启动子P2789为低温诱导型强启动子。
实施例3
本实施例构建了重组节杆菌C2 PA-Csp，C2 PA-Dyp，C2 PA-PCD。具体过程如下：
1.PCR扩增目的基因片段
按照表7所示的引物，分别扩增得到以下目的基因。
表7 PCR引物列表
2.In-Fusion无缝克隆法连接表达载体
配制单酶切体系：5 μL载体、2 μL 10×Ligation Buffer、1 μL Quickcut BamHI/Kpn I/SalI、无菌ddH2O补齐至20 μL。将单酶切体系于35℃水浴下酶切30 min。反应结束后，纯化回收线性化的pART2载体。
配制连接体系：1 μL载体、2 μL上一步扩增的目的基因、1 μL In-Fusion® SnapAssembly Master Mix、无菌ddH2O补齐至5 μL。将连接体系于50℃水浴下反应15 min后，得到表达载体。
载体构建过程如下：按照上述单酶切体系得到线性化的pART2载体，按照上述连接体系，将步骤1的P2789基因连接至pART2载体上，得到pA-P2789载体，再分别将Csp+3’UTR基因和DyP基因连接至pA-P2789载体上的P2789下游，分别构建得到pA-Csp载体和pA-DyP载体。以pA-DyP载体为模板，按照表7中所示的P-DyP的引物序列，扩增得到P2789+DyP融合目的基因，按照上述连接体系将其连接至pA-Csp载体上，得到pA-PCD载体。
为了验证重组载体是否构建成功，以pA-Csp载体为模板，扩增Csp基因条带（201bp）、P2789+Csp融合条带（525 bp）以及pART2载体特异性条带（1198 bp，空质粒上条带大小为551 bp）；以pA-DyP载体为模板，扩增DyP基因条带（1233 bp）、P2789+DyP条带（1533 bp）以及pART2载体特异性条带（2006 bp）；以pA-PCD载体为模板，扩增P2789条带（218 bp）、Csp基因条带（201 bp）、DyP基因条带（1233 bp）、pART2载体特异性条带（2727 bp）。结果如图14所示，其中，A为pA-Csp载体的验证结果电泳图，B为pA-DyP载体的验证结果电泳图，C为pA-PCD载体的验证结果电泳图。从图14可以看出，pA-Csp、pA-DyP、pA-PCD表达载体构建成功。将构建成功的表达载体采用实施例2 3.5所示的热激法分别转化于DH5α感受态细胞内，保存备用。
3.C2感受态细胞的制备
将节杆菌C2于LB培养液内活化，25℃，160 rpm培养至OD600=0.6。向培养液中加入终浓度为10 mg/L的Amp母液（Amp母液与培养液体积比例为1：105），以抑制细胞壁的合成，继续培养30 min。将菌液转入50 mL离心管中，预冷10 min后，分装到2 mL离心管中，4℃、4000 rpm离心15 min。加入2 mL体积的甘油山梨醇混合液重悬细胞，冰上预冷10 min，再次离心，并重复3遍。最后，加入100 μL甘油山梨醇重悬，分装到预冷的1.5 mL离心管中，剩余的感受态细胞于液氮中速冷，并放置于-80℃冰箱内保存。
4.电转化过表达重组菌的构建
从步骤2的DH5α感受态细胞内分别提取表达载体（pA-Csp、pA-DyP、pA-PCD），取10μL提取的表达载体，加入解冻的上述C2感受态细胞内，继续冰上放置30 min后，加入到预冷的电转杯中，设置电转化条件为：1500 KV，800 Ω。电转后的菌液加入1 mL的SB培养液中复苏培养1 h后，取菌液进行平板涂布，过夜培养并挑菌验证重组菌是否构建成功。将转化了pA-Csp载体的重组菌命名为C2 pA-Csp，转化了pA-DyP载体的重组菌命名为C2 pA-DyP，转化了pA-PCD载体的重组菌命名为C2 pA-PCD。
实施例4
本实施例测定了节杆菌C2（下称C2 WT）以及重组菌C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的木质素降解能力，具体过程如下：
配置1 g/L的碱木质素母液，分别稀释为0.02 g/L、0.04 g/L、0.06 g/L、0.08 g/L、0.1 g/L、0.12 g/L、0.14 g/L、0.16 g/L、0.18 g/L、0.2 g/L的碱木质素溶液，测定其600nm下分光光度值，使用origin2021pro软件拟合，绘制木质素标准曲线。经拟合后获得木质素降解标准曲线：
y=0.01353+2.10424x，R2=0.99987
取过夜培养C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的菌液，调节为菌液OD600=2.0，以2%的接种量（v/v）接种于碱木质素液体培养基（包括以下浓度的原料：1.0 g/LK2HPO4、1.0 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4、0.015 g/L CaCl2、0.002 g/L FeSO4、0.0004 g/L CuSO4、0.004 g/L MnSO4、0.001 g/L CoCl2、0.002 g/LNiCl2·6H2O、0.5 g/L蛋白胨、3.0 g/L碱木质素），分别在25℃、15℃和160 rpm下培养。分别于1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取样。将不同时间点取得的样品于4℃，8000 rpm离心5min，取上清液，测定其OD600吸光度值，并根据上述标准曲线计算碱木质素降解率。每组设置3个生物学重复。
OD600吸光度值测定结果和碱木质素降解率计算结果如图15所示，其中，A图中的折线表示25℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量测定结果，直方图表示25℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的木质素降解率测定结果；B图中的折线表示15℃下C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量测定结果，直方图表示25℃下C2WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的木质素降解率测定结果。可以看出，25℃条件下（A图），C2 WT、C2 pA-Csp、C2 pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量均在第3 d达到最大；木质素降解率在第7 d分别为29.54%、33.41%、34.17%、35.10%。15℃条件（B图）下，C2 WT、C2 pA-Csp、C2pA-DyP、C2 pA-PCD的生长量分别在第4 d、4 d、4 d、5 d达到最大，OD600值分别为：0.584、0.629、0.564、0.592；木质素降解率在第7 d分别为33.14%、36.01%、42.13%、44.14%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种来自耐冷木质素降解节杆菌(Arthrobactersp.)C2基因组的低温诱导型强启动子P2789，其特征在于，所述强启动子P2789的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述节杆菌C2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年9月7日，保藏编号为CGMCCNo.20606。
2.一种重组节杆菌，其特征在于，以耐冷木质素降解节杆菌C2为底盘微生物，包含目的基因和权利要求1所述强启动子P2789。
3.如权利要求2所述的重组节杆菌，其特征在于，所述目的基因为冷休克蛋白基因和/或染料脱色过氧化物酶基因。
4.如权利要求3所述的重组节杆菌，其特征在于，所述目的基因位于所述强启动子P2789的下游。
5.一种权利要求4所述重组节杆菌的构建方法，其特征在于，将冷休克蛋白基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2pA-Csp；
将染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2pA-DyP；
将冷休克蛋白基因和染料脱色过氧化物酶基因串联至启动子P2789下游并在所述节杆菌C2中过表达得到重组节杆菌C2pA-PCD。
6.一种权利要求2～4任一项所述的重组节杆菌或按照权利要求5所述的构建方法得到的重组节杆菌在降解木质素中的应用，其特征在于，所述重组节杆菌降解木质素时的温度为15～25℃。
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