CN117987443A - 一种以fabL基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以fabL基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明构建了一个无抗性标记的枯草芽孢杆菌表达载体pHT254‑L，通过删除抗性基因，插入枯草芽孢杆菌fabL基因作为筛选标记获得，在枯草芽孢杆菌168fabL缺失突变株中使用，功能验证结果表明，该无抗性表达系统能在枯草芽孢杆菌中工作，具有一定应用价值，能够用于食品级安全表达蛋白产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种以fabL基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用。
背景技术
酶制剂的生产在医药、食品等方面存在着日益紧张的需求，由于微生物具有能够进行异源蛋白胞外分泌表达、适应性广、稳定性强等优点，这使得以微生物发酵作为生产方式的模式成为主流。但在生产过程中，如利用微生物发酵时所使用的游离质粒表达重组菌株总是需要引入抗性标记基因来进行筛选，这就会造成在食品安全级别的生产中带来抗生素污染等情况而受到使用限制。也有很多研究通过将异源蛋白表达的操纵子整合至基因组的方法达到无抗性标记生产的目的，但存在整合拷贝数低，远不及游离质粒的复制量，蛋白表达量低的问题，而多拷贝整合在研究中发现当拷贝数超过某一特定值时二者呈负相关，会给宿主生长带来负担且由于传统同源重组整合效率低、Cas9定点整合质粒过大、多拷贝整合过程繁琐等使得蛋白无抗性标记表达急需新的解决方案的出现。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)被公认为是安全菌株(GRAS)，同时因为枯草芽孢杆菌生长迅速、培养条件简单、具有良好的发酵基础和生产技术等优点，使其在科研和工业、农业生产领域被广泛应用。其作为一种重要的工业微生物，具有开发为食品级表达宿主的优势。
目前枯草芽孢杆菌中表达蛋白大都采用质粒表达，用质粒拷贝数多，蛋白表达量大，但其中质粒上都带有抗性基因，在食品级安全表达蛋白中是不符合要求的；而整合表达可以去除抗性，但拷贝数少，表达量低。因此建立一套枯草芽孢杆菌的无抗生素抗性标记基因的表达系统对于应用生产具有重要推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种以fabL基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统的构建方法，所述表达系统以fabL基因作为抗性标记。
优选的是，包括以下步骤：
(1)构建枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株；
(2)构建以fabL基因作为抗性标记表达载体；
(3)将所述以fabL基因作为抗性标记表达载体转化所述枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株，即为所述枯草芽孢杆菌无抗性表达系统。
优选的是，所述构建枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株具体为：
构建敲除载体pRP1028-FabL转入大肠杆菌，得到pRP1028-FabL/DH5α菌株，随后将pRP1028-FabL/DH5α菌株和枯草芽孢杆菌以及pSS1827/DH5α菌株进行三亲本杂交，筛选得到枯草芽孢杆菌168fabL基因敲除完成的菌株，即为所述枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株。
优选的是，所述构建以fabL基因作为抗性标记表达载体具体为：以质粒pHT254作为模板，将氨苄青霉素抗性基因Ampr替换为fabL基因，同时删除Cm抗性片段，获得表达载体pHT254-L。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
本发明还提供所述构建方法得到的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统。
本发明还提供一种以fabL基因作为抗性标记表达载体，所述表达载体为pHT254-L。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统或所述表达载体在安全表达蛋白产品中的应用。
烯脂酰ACP还原酶(Enoyl-Acyl Carrier Protein Reductase，ENR)是Ⅱ型脂肪酸合成系统中的一个关键酶，催化每个延伸循环的最后一步还原，即反式-2-烯脂酰ACP还原为饱和的脂酰ACP。许多细菌都编码ENR，在序列上有较高的同源性(>40％)，都含有保守的Tyr-(Xaa)6-Lys催化活性中心序列，但ENR在不同细菌中显示出结构多样性。最早在大肠杆菌中发现的ENR命名为FabI，通过序列比对在许多基因组中都能找到FabI同源基因。FabI蛋白是广谱抗菌剂三氯生的靶标。
三氯生(triclosan，TCL)作为一种慢结合抑制剂，通过与活性部位的氧化辅因子NADH形成紧密的非共价复合体FabI·NAD+·triclosan，并抑制FabI酶活性。Heath等人在对枯草芽孢杆菌基因组分析发现了一个基因ygaA，其编码蛋白含有Tyr-(Xaa)6-Lys保守活性位点，与FabI同属于短链醇脱氢酶家族(SDR)。YgaA能够被三氯生可逆性抑制，但不能形成FabI蛋白所特有的稳定的三元复合物(图1)。且YgaA能恢复大肠杆菌FabI温度敏感菌株在非允许温度(42℃)生长，并对三氯生产生高抗性(大于2000μg/mL)，YgaA被重新命名为FabL，代表一类新型烯脂酰ACP还原酶。利用枯草芽孢杆菌中fabL基因的特性，本发明通过删除表达载体中的抗生素基因，并将fabL基因插入表达载体来达到代替使用抗生素抗性基因作为筛选标记的作用。
基于上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
本发明构建了一个无抗性标记的枯草芽孢杆菌表达载体pHT254-L，通过删除抗性基因，插入枯草芽孢杆菌fabL基因作为筛选标记获得，在枯草芽孢杆菌168fabL缺失突变株中使用，功能验证结果表明，该无抗性表达系统能在枯草芽孢杆菌中工作，具有一定应用价值，能够用于食品级安全表达蛋白产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为FabL和FabI与三氯生作用机制；
图2为fabL基因敲除盒片段构建示意图及枯草芽孢杆菌168fabL基因缺失突变株PCR鉴定；其中，a中泳道1为fabL-up-down基因片段，M为DL 2000标准分子量DNA Marker；b中泳道1-10是引物168F1、168R2扩增的fabL敲除盒基因片段，其中泳道1为目的片段，泳道11是引物168F1、168R2扩增的fabL敲除盒基因片段，泳道12是盒外引物168F3、168R3扩增基因组中包含fabL敲除盒基因片段和盒外部分基因片段，M为DL2000标准分子量DNA Marker；
图3为枯草芽孢杆菌168fabL基因缺失突变株TCL敏感性检测；
图4为pHT254-L质粒构建示意图及PCR鉴定，其中，a为质粒构建示意图，b为PCR鉴定结果；
图5为pHT254-L质粒抗性验证；
图6为pHT254-L质粒在枯草芽孢杆菌稳定性检测，其中，a为连续传代实验测定质粒保有率，b为摇瓶发酵实验测定的质粒保有率；
图7为pHT254-L-FabL和pHT254-L-PstS质粒PCR鉴定及在B.subtilis 168ΔfabL中诱导表达的Western Blot结果,其中，a中泳道1-3为引物pHT254-L通用引物254F/R扩增的基因片段，其中泳道1为pHT254-L-FabL，泳道3为pHT254-L-PstS，M为DL 2000标准分子量DNA Marker，b中泳道1为空白对照，泳道2为pHT254-L-FabL上清，泳道3为pHT254-L-PstS上清，M为TureColor预染蛋白Marker(标准范围15-130kDa)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例中所用到的材料(如实例中无特殊说明，则按常规试剂使用)包括：
枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌DH5α为本单位保藏；
质粒pRP1028、pSS1827、pSS4332、pHT254为本单位保藏；
质粒pHT254-L为本发明构建；
质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
T4连接酶、连接酶Buffer和高保真DNA聚合酶均购于宝生物工程(大连)有限公司(Takara)；
1.1×S4 Fidelity PCR Mix、2×GS Taq PCR Mix、Uniclone One Step SeamlessCloning Kit无缝克隆试剂盒均购于北京金沙生物科技有限公司(Genesand Biotech Co.,Ltd.)；
限制性核酸内切酶均购于NEB有限公司；
壮观霉素、氯霉素及氨苄青霉素等抗生素、Western Blot使用物品等购于广州鼎国生物公司；
PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成；
DNA提取试剂盒为Omega Biotek(美国)公司生产。
实施例中所用到的常规方法包括(如实例中无特殊说明，则按常规方法操作)：
大肠杆菌感受态的制备方法为：接种5mL种子液摇菌过夜，转接按1％的接种量转接到100mL新鲜培养基中；震荡培养到OD600到0.35-0.4时，4℃4100rpm离心10min收集菌体；去上清，加入0.1倍体积预冷的0.1M MgCl2悬浮，冰浴10min，4℃，4000rpm离心10min；去上清，加入0.04倍体积预冷0.1M CaCl2悬浮，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min；去上清，加入1/25体积预冷的0.1M甘油CaCl2，悬浮沉淀；以100μL/管分装至1.5mL离心管，-80℃保存备用。试剂均用高温湿热灭菌。热激转化方法为将连接体系(10-20μL)或质粒(1-3μL)加入100μL感受态细胞，轻柔混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min；加入800-1000μL新鲜的培养基，37℃温和震荡培养45min；取约100μL培养菌液，均匀涂布平板，晾干水分后倒置培养过夜。
枯草芽孢杆菌感受态制备方法为接种5mL种子液于GMI培养基中过夜培养，取2mL菌液转接到18mL GMI中，37℃震荡培养到OD600到0.4左右时，取10mL菌液转接到90mL GMII中，37℃震荡培养70min，冰浴10min左右，4℃，6000rpm离心5min，取2mL上清液悬浮菌体，加入50％灭菌甘油700μL，并以每管500μL分装，-80℃保存备用。试剂均用高温湿热灭菌。热激转化方法为将取出的感受态于45℃水浴融化后加入15-20μL质粒，45℃热激90s，冰浴1min，37℃温和震荡培养1.5h，取约100μL培养菌液，均匀涂布平板，晾干水分后倒置培养过夜。
三亲本杂交方法分为第一次接合转移和第二次接合转移，第一次接合转移准备供体菌株pRP1028-FabL UD/DH5α，受体菌株枯草芽孢杆菌168、辅助菌株pSS1827/DH5α过夜培养，分别以1﹕100比例转接，均培养至OD＝0.8，分别取1mL菌液，收集菌体，最好保持菌落沉淀数量一致，吸干培养基后，用1mL新鲜LB培养基(无抗)洗2-3遍确保洗净残留抗生素，最后分别用500μL无抗性LB培养基重悬，分别取50μL菌液于一管中充分混匀，然后将150μL混合液点在无抗板上自然晾干正放于28℃培养24h，之后用枪头将菌斑转移到200μL新鲜LB培养基中吹打混匀涂布于含壮观霉素(300μg/mL)和多粘菌素B(60units/mL)的两个LB平板上，28℃培养4-6天，挑取粉红色的菌落，在相应抗性培养基中培养过夜，再以1﹕1000比例在含有相应抗性液体培养基中37℃培养重复转接三次，在37℃含抗性平板划线分离培养，取单菌落于液体培养基中过夜培养，抽提总DNA，PCR验证第一次单交换是否成功。
第二次接合使用供体菌株pSS4332/DH5α、受体菌株为第一次接合枯草芽孢杆菌168、辅助菌株pSS1827/DH5α，方法同第一次接合，在含有卡那霉素(50μg/mL)和多粘菌素B的平板进行筛选，挑取绿色菌落28℃过夜培养后划线分离，进行抗生素敏感性实验，分别取划线分离单菌落点在含有卡那霉素及多粘菌素B板和壮观霉素及多粘菌素B板上，有卡那霉素抗性，无壮观霉素抗性的为阳性转化子，挑取阳性转化子液体培养基培养后抽提总DNA验证第二次单交换是否成功，验证成功质粒进行质粒消除，以1﹕1000比例28℃传代10次以上，划线分离后进行抗生素敏感性实验，取单菌落点在含卡那霉素和不含卡那霉素平板，无抗生长，有卡那霉素不长的为阳性转化子，PCR验证并进行测序验证。
Western Blot方法为：接种表达菌株和空白对照菌株于5mL液体培养基(种子液)中37℃震荡培养过夜；向两份5mL液体培养基中各转接50μL种子液，37℃震荡培养3-4h，待OD600＝0.7-0.8时，向其中一份液体培养基中加入5μL IPTG，37℃震荡培养4h。同时转接空白对照。用15mL培养管分别收集菌体，去净上清，加入2mL Lysis Buffer，200w超声波破碎5min；取1mL破碎液转移到1.5mL离心管，12000rpm离心10min；将上清全部转移到另一支离心管中，用1mL Lysis Buffer悬浮沉淀；将样品和对照的上清进行Western Blot检测。
质粒稳定性检测的方法为：1、连续传代实验：连续传代50次，每五次进行一次稀释涂布，分别涂布无抗和含抗性板，进行平板计数。2、摇瓶发酵培养：分别在摇瓶发酵培养0h、10h、20h、30h、40h、50h。取对应时间点的样，稀释涂布分别涂布无抗和含抗性板，进行平板计数。
本发明实施例中使用的引物名称与序列如表1所示：
表1引物序列
注：下划线为酶切位点。
实施例1枯草芽孢杆菌168fabL基因缺失突变株的构建
本发明在之前的工作中已经验证fabL过表达载体可以提高大肠杆菌及枯草芽孢杆菌对于三氯生的抗性，因此fabL可以作为筛选标记在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中使用。
1.首先构建敲除载体pRP1028-FabL，目的基因全长753bp，为敲除fabL的开放阅读框。本发明以pRP1028质粒为基础，枯草芽孢杆菌168总DNA为模板，引物168F1和168R1、168F2和168R2分别进行PCR扩增目的基因fabL的上、下游片段(同源臂各约700bp，包含部分目的基因序列约70bp。
50μL扩增体系：质粒DNA 1μL，引物各2μL，1.1×S4 Fidelity PCR Mix 45μL。
扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，Tm±5℃退火15s，72℃延伸10～15s/kb，72℃延伸5min。程序循环数：30个循环。
由于引物168F2和168R1有同源序列，共同作为模板，通过重叠PCR方法，用引物168F1和168R2进行扩增，使目的基因上游、下游两个片段“搭桥”成一个大片段敲除盒(FabL-up-down)。分别用限制性核酸内切酶SmaⅠ和BamHⅠ消化敲除盒片段和pPR1028质粒(酶切条件为：片段60μL，10×酶切buffer 10μL，BamHI 2μL，SmaI 2μL，双蒸水补至100μL，37℃反应4h)，回收后用T4连接酶连接(连接条件为：酶切后片段各7.5μL，10×连接酶buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，双蒸水补至20μL。16℃连接4h)，转化后通过菌落PCR筛选阳性重组子(20μL扩增体系：阳性重组子菌液2μL，特殊引物各1μL，2×GS Taq PCR Mix 12.5μL，双蒸水补至20μL。扩增条件：95℃预变性3min，94℃变性25s，Tm±5℃退火25s，72℃延伸10～15s/kb，72℃延伸5min。程序循环数：30个循环)并测序鉴定，获得用于枯草芽孢杆菌fabL基因敲除的敲除盒片段克隆载体pRP1028-FabL。
根据上文所述的枯草芽孢杆菌基因组敲除方法，将测序无误后的pRP1028-FabL/DH5α菌株和枯草芽孢杆菌168以及pSS1827/DH5α菌株进行三亲本杂交第一次接合，经过提取基因组PCR鉴定之后，确认pRP1028-FabL质粒整合进入枯草芽孢杆菌168基因组上，并稳定复制传代。
培养得到的单菌落和pSS1827/DH5α菌株及pSS4332/DH5α菌株进行第二次接合，经过提取基因组PCR鉴定和提取基因组后扩增测序鉴定之后，确认枯草芽孢杆菌168fabL基因敲除完成，并测定了野生型和突变株的TCL抗性。具体原理及结果如图2、3所示。
实施例2pHT254表达载体的改造
本发明构建了fabL基因缺失的枯草芽孢杆菌168，为了达到在使用表达载体时不使用抗生素抗性基因作为筛选标记，在得到FabL可以作为枯草芽孢杆菌和大肠杆菌筛选标记的结论后，本发明拟构建一个以pHT254表达载体作为出发质粒改造为无抗性基因的表达载体以构成一个枯草芽孢杆菌无抗性表达系统。
以质粒pHT254作为模板，FabL F/R作为引物，PCR扩增fabL基因及其启动子区域，由于FabL F/R引物与pHT254载体骨架有同源序列，且是与氨苄青霉素抗性基因的上下游同源，因此用Ω-PCR的方法将大片段和pHT254质粒反应，转化后涂布于三氯生抗性平板通过菌落PCR筛选阳性重组子并测序鉴定，获得替换氨苄青霉素抗性基因(Ampr)为fabL的表达载体，提取重组质粒后以自身为模板，Cm del F/R作为引物，由于Cm del F/R引物与pHT254载体氯霉素抗性基因上下游片段有同源序列，用上述方法进行筛选阳性重组子并测序鉴定，获得删除了Cm抗性片段的表达载体pHT254-L(如SEQ ID NO.1所示)及对pHT254-L抗性检测和其在枯草芽孢杆菌中的质粒稳定性。具体原理及结果如图4-6所示。
SEQ ID NO.1：HTBTTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAGCGCAAAAAAA GTTGCTTTTTCGTACCTATTAATGTATCGTTTTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCAGGCCTTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGT
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CGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCATGC。
B.subtilis 168ΔfabL突变体无痕敲除部分如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：TATCCACAAACGGCCGTCTAAAGGTTTGCTCGCCAACCTGT GGGAATTCCCGAATCTTGAAACACAAAAAGGGATCAAAACTGAGCGTGAACAGCTCATTGCTTTCTTAGAAAACGAATATGGCATACAAGCTGATATCAGTGATCTGCAAGGTGTAGTCGAGCATGTTTTCACCCACCTGGTATGGAATATTTCAGTGTTTTTCGGTAAAGTAAAACAAGTGTCGGATACCAGCAAGCTGAAAAAAGTAACGAAAGAAGAGCTCGAACAATTTGCGTTCCCGGTGTCACATCAAAAAATCTGGAAGATGGCAGGAGAAGCAGCCGCCATCTCGGCTGCTCCGTAAACCATTCTTAATCGTAAGAGACGCGCGTGCCGTGGCTGTAGTCCGCTTCATTGCGCTTCATTCCGCCGCGCGCTTCAATTTCTTGCGTTAATTCCCGGTATTTTGATTGGCCTTCTTCGTTCAAATAAGGCATAATTTGCTGAAAGGCATGATGAAAATAAGCGAGTTCACTGTTCTTCCAATCTTTTTTGGAAACCATGTTCAATTCGCTCATATCACGTCCGACATACATAACAGAAGACCCCCTTTAAAGTTCTTGCCATTATTGTTTGTGGAAATAAAAGAACTATACGCTACAAGGAGATGAGGAAAAATGGAACAAAATAAATGTGCACTCGTAACAGGAAGCAGCCGCGGTGTCGGAAAAGCGGCCGCGATCAGACTTGCTGAGAACGGCTATAACATCGTCATTAACTATGCACGCAGCAAAAAAGCAGCATTAGAAACAGCGGAAGAAATCGAAAAGCTTGGCGTTAAAGTGCTTGTCGTAAAAGCAAACGTAGGACAGCCTGCAAAAATCAAAGAAATGTTTCAGCAAATTGATGAAACGTTCGGCAGACTTGATGTTTTTGTCAATAATGCCGCTTCAGGAGTACTAAGACCTGTCATGGAATTAGAAGAAACACACTGGGACTGGACGATGAACATTAATGCGAAAGCATTGCTTTTCTGCGCTCAGGAAGCTGCCAAGCTAATGGAGAAGAACGGTGGCGGGCATATTGTCAGCATTAGTTCATTAGGCTCTATCCGCTATCTTGAAAACTACACCACGGTCGGTGTATCAAAAGCAGCGTTAGAGGCTTTAACCCGTTATCTTGCCGTTGAGCTTTCACCAAAACAAATTATCGTCAATGCTGTTTCAGGCGGAGCGATCGACACAGATGCGCTGAAGCACTTCCCGAATAGAGAAGATCTGCTTGAGGATGCGCGCCAAAATACGCCGGCGGGACGCATGGTCGAAATTAAAGACATGGTTGATACTGTGGAGTTTCTAGTGTCTTCCAAGGCTGACATGATCCGCGGACAGACAATTATCGTTGACGGCGGACGCTCACTGCTCGTTTAAAAATTTTTAAAAAAGAGGAATAGCTATACGATCACCTGCACATTCTAATGACCGTGGAGGTGATAACAATGGCTAACTCAAATAACTTCAGCAAAACAAACGCTCAACAAGTTAGAAAACAAAACCAACAATCAGCTGCTGGTCAAGGTCAATTTGGCACTGAATTTGCTAGCGAAACAAACGCTCAGCAAGTCAGAAAACAAAACCAGCAATCAGCTGGACAACAAGGTCAATTCGGCACTGAATTCGCTAGTGAAACTGACGCACAGCAGGTAAGACAGCAAAACCAATCTGCTGAACAAAACAAACAACAAAACAGCTAATCACTGAAACAGAAAAAAGCACTTCATCTTCGGGTGGAAGTGCTTTTTTCTGTTTGAAAAACGACAAAACTTGTGGAAGGTCTACAGAATGAGTCAAAGGGTTTGCTTTATGGAGATCGAAATGATTAAAGGAGGAAATGTTTATACTTTCATCAGGCTGAAGGAGGAACCGATGACCGAATTTGAAAAGCTGGTAAGTGAACAGATGAAAACGATGGATAAGCTTCTCGATCTCCAATCAGAGCTCGACCGCTGCAAACAAATTGAGGCGGAACTCCGGCATTTGGAAAGGGATGCAAGGCTGCGTGGGATTCAGGCTGAAATTGCGGT。
实施例3B.subtilis 168ΔfabL/pHT254-L无抗表达体系验证
为了验证pHT254-L表达载体在枯草芽孢杆菌中表达效率，拟插入枯草芽孢杆菌自身的fabL基因和外源蛋白基因沙门氏菌磷酸ABC转运蛋白PstS(周浆磷酸结合蛋白)基因。分别以枯草芽孢杆菌168基因组和沙门氏菌基因组作为模板，FabL F1/R1和PstS F/R作为引物，分别扩增FabL基因和PstS基因，由于FabL F1/R1和PstS F/R引物与pHT254-L载体多克隆位点两边有同源序列，因此用无缝克隆试剂将大片段和pHT254-L质粒反应，转化后通过使用三氯生平板筛选并挑取转化子做菌落PCR筛选阳性重组子并测序鉴定，获得表达载体pHT254-L-FabL和pHT254-L-PstS(PstS为示例的随机蛋白基因，仅为验证无抗体系的表达效果)。提取重组质粒，热激转化B.subtilis 168ΔfabL，通过菌落PCR筛选阳性重组子。获得单菌落在无三氯生培养基中诱导培养进行Western Blot检测表达情况。具体结果如图7所示，fabL基因和Psts基因均可以顺利表达，表明本发明构建的质粒在构建过程中可以使用三氯生作为筛选标记进行筛选，完成构建进行表达时无需使用抗生素也可以稳定表达自身或外源蛋白。
综上，本发明构建了一个无抗性标记的枯草芽孢杆菌表达载体pHT254-L，通过删除抗性基因，插入枯草芽孢杆菌fabL基因作为筛选标记获得，在枯草芽孢杆菌168fabL缺失突变株中使用，功能验证结果表明，该无抗性表达系统能在枯草芽孢杆菌中工作，具有一定应用价值。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术用户来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统的构建方法，其特征在于，所述表达系统以fabL基因作为抗性标记。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株；
(2)构建以fabL基因作为抗性标记表达载体；
(3)将所述以fabL基因作为抗性标记表达载体转化所述枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株，即为所述枯草芽孢杆菌无抗性表达系统。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株具体为：
构建敲除载体pRP1028-FabL转入大肠杆菌，得到pRP1028-FabL/DH5α菌株，随后将pRP1028-FabL/DH5α菌株和枯草芽孢杆菌以及pSS1827/DH5α菌株进行三亲本杂交，筛选得到枯草芽孢杆菌168fabL基因敲除完成的菌株，即为所述枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述构建以fabL基因作为抗性标记表达载体具体为：以质粒pHT254作为模板，将氨苄青霉素抗性基因Ampr替换为fabL基因，同时删除Cm抗性片段，获得表达载体pHT254-L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
6.如权利要求1-5任一项所述构建方法得到的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统。
7.一种以fabL基因作为抗性标记表达载体，其特征在于，所述表达载体为pHT254-L。
8.如权利要求6所述枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统或权利要求7所述表达载体在安全表达蛋白产品中的应用。
Priority Applications (1)
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