CN113583931B - 魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用。它是敲除了ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌，所述的ansB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌ansB基因的工程菌，在25°C和30°C，以及LB、TSB和NB等培养基中培养，提高了其在聚苯烯材料上的生物被膜形成能力，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于重金属离子吸附和构建细胞蛋白合成微工厂等的应用场景和范围。

Description

魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用。
背景技术
柠檬酸杆菌属的细菌，营化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源生长，因此得名。该属的细菌都是革兰氏阴性菌，通常周生鞭毛，兼性厌氧，有呼吸和发酵两种类型的代谢方式，发酵葡萄糖产酸产气。该属的细菌常发现于人和动物的粪便，可能是正常肠道栖居菌，也见于土壤、水、污水和食物中，但也时常作为条件性致病菌分离自临床样品。近年来，该属的细菌被广泛的应用于重金属离子吸附和污水处理等污染环境治理等领域，而该属的典型代表魏氏柠檬酸杆菌，具备柠檬酸杆菌属的典型特点，并且，由于该种属细菌全基因组的测定完成以及基于基因工程手段技术的进步，从基因水平对魏氏柠檬酸杆菌进行必要的干预和改造，使其具备更加优良的表型，如通过敲除其中的ompA基因使其具备更好的生物被膜形成能力和对杀菌剂的抗药性（专利：一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法），已经成为一种切实可行的手段。
ansB基因是一种编码Ⅱ类谷氨酰胺酶/天冬酰胺酶的基因，其主要的作用是催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，该基因的转录受到cAMP受体蛋白（CRP）和FNR基因产物FNR蛋白的正调控；已经有研究证实ansB是单顺反子，即该基因只编码一个蛋白，并且该基因的表达依赖于σ54；另外，有报道称，在鼠伤寒沙门氏菌中，ansB是抑制T细胞增殖、细胞因子产生以及下调T细胞受体表达所必需的；ansB用来治疗急性淋巴细胞白血病的机制，可能涉及白血病细胞的氨基酸饥饿；另外，该基因还对人类病原体如空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌和鼠伤寒沙门氏菌在宿主中的定植具有一定的影响。而魏氏柠檬酸杆菌中的ansB基因，全长1047bp，编码的蛋白有348个氨基酸序列，该基因在魏氏柠檬酸杆菌中可能具有重要的功能，也可以使用基因工程等手段对其进行开发利用。
而自然界中的大部分细菌往往都不是以单个的细胞（个体）存在，而是互相聚集，以生物被膜的形式生存和生长，生物被膜作为一个细菌的聚集群体，其结构构成主要包括：水、菌体、胞外多聚物、蛋白和遗传物质，如eDNA和RNA等，并且，具有比单个的个体更优良的表型，如抵抗外界营养和环境胁迫能力增加，而更为重要的是，由于生物被膜具有三维立体结构，具有很多的孔道和比表面积，具有更好的吸附能力，同时具有自我修复和再植能力，已经成为在环境污染治理和蛋白合成微工厂等领域应用的重要材料和载体。但上述应用必须以菌体能够形成足够多的生物被膜为基础，而如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研的难点和热点，另外，生物被膜的形成也受到外界营养和环境条件的影响和制约，寻找最佳的生物被膜形成条件，也应引起足够的重视。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌在特定条件下生物被膜形成能力有限的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株，从而提高其在环境治理和蛋白合成微工厂等方面的应用潜力。
本发明的第一个目的是提供一种魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株，其是敲除了ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌，所述的ansB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株是魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）ΔansB，是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8菌株中的ansB基因从第1位到1047位之间的编码基因被完全敲除，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCCNo.61849，保藏日期：2021年8月2日。
本发明的第二个目的是提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力的方法，其是敲除魏氏柠檬酸杆菌的ansB基因，提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力。
优选，是PCR扩增ansB基因的上下游同源片段，将其与质粒pYG4连接构建敲除载体pYG4-ansB，然后转化大肠杆菌S17-1；将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌接合转移，获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。
优选，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8。
优选，
（1）引物序列：
ansB-up-F：aaaagtgccacctgcagatctTTCGATATTTGGTGGGACTAAGTAGC
ansB-up-R：gccacctgcatcgaGTTATTTCTCCAGTTACTTGAATTTGC
ansB-down-F：aataacTCGATGCAGGTGGCTGCG
ansB-down-R：agtcatatgccgcggagatctCGGTCTGGGGCTACGTAGC
ansB-QJ-F：CGCTGGAAAACGATCGTAAAAC；
ansB-QJ-R：CAAGCCGTTCGAGTTCTTTATG。
（2）以提取的魏氏柠檬酸杆菌基因组DNA作为模板，分别以ansB-up-F和ansB-up-R，ansB-down-F和ansB-down-R为引物，扩增得到ansB基因的上下游同源序列；
（3）用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收；
（4）将扩增得到的ansB基因的上下游同源片段连接到质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4-ansB，然后热激转化大肠杆菌S17-1；
（5）将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌共孵育，将共孵育物洗脱下来，稀释后涂布于卡那霉素和利福平抗性筛选LB平板，用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定ansB基因一次交换重组子；
（6）然后将一次交换重组子用LB液体培养基扩大培养并稀释后涂布到含质量分数5%蔗糖的LB平板上，挑取单克隆，使用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。
优选，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8。
本发明的第三个目的是提供魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株在吸附重金属离子或蛋白合成微工厂中的应用。
优选，是在以聚苯烯附着材料、LB培养基、30°C和静置培养的条件下进行应用。
本发明所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌ansB基因的工程菌，在25°C和30 °C，以及LB、TSB和NB等培养基中培养，提高了其在聚苯烯材料上的生物被膜形成能力，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于重金属离子吸附和构建细胞蛋白合成微工厂等的应用场景和范围。
魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）野生菌株- Citrobacter werkmaniiGDFMZ BF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No.61858；保藏日期：2021年8月10日。
Citrobacter werkmaniiΔansB，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No.61849，保藏日期：2021年8月2日。
附图说明
图1是魏氏柠檬酸杆菌ansB敲除菌株ΔansB的PCR鉴定图（泳道1：Marker III，购买自：天根生化科技（北京）有限公司；泳道2：ansB上游片段；泳道3：ansB下游片段；泳道4：敲除鉴定片段）。
图2是魏氏柠檬酸杆菌野生菌株（BF-8）和ansB敲除菌株ΔansB在不同温度和不同培养基上的生物被膜形成量。A：25°C、静置培养；B：30°C、静置培养；C：37°C、静置培养；D：25°C、120 rpm振荡培养；E：30°C、120 rpm振荡培养；F：37°C、120 rpm振荡培养。注：柱子上方的数字为均值。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中使用的野生魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8。
实施例1：
一、ansB敲除载体的构建
首先，将魏氏柠檬酸杆菌的ansB基因（1047bp；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：ATGGAGTTTTTCAAGAAAACGGCACTTGCCGCACTGGTTATGGGTTTCAGCGGCGCGGCGCTTGCACTGCCAAACATCACTATTTTAGCAACCGGCGGGACCATTGCCGGCGGTGGTGATTCCGCGACAAAATCTAACTACACGGCAGGCAAGGTAGGCGTAGAGAATCTGGTTGAAGCCGTACCTCAGTTGAAAGACATCGCGGTTGTTAAAGGCGAGCAGGTGGTGAACATCGGCTCTCAGGATATGAATGACGACGTCTGGTTAACGCTGGCGAAAAAGATTAACACCGAGTGTGATAAAACCGACGGTTTTGTCGTGACACATGGTACGGATACCATGGAAGAAACTGCCTATTTCCTCGACCTGACCGTCAAGTGCAACAAGCCGGTAGTGCTGGTGGGTGCAATGCGTCCGTCTACAGGGATGAGCGCCGATGGCCCGTTCAACCTGTATAACGCAGTGGTGACGGCTGCAGACAAAGCCTCTGCCAACCGTGGCGTGCTGGTGGTGATGAACGACACCGTGATGGATGGTCGCGACGTGACCAAAACCAACACTACCGATGTAGCCACCTTCAAATCCGTTAACTATGGCCCGCTGGGCTACATCCATAACGGCAAGATTGACTACCAGCGTACGCCTGCGCGTAAGCACACCACGTCTACTCCGTTCGATGTGTCTAAGCTGACCGAACTGCCGAAAGTGGGGATTGTTTACAACTACGCTAACGCCTCGGATCTGCCAGCCAAAGCGCTGGTCGACGCGGGTTATGCGGGTATCGTCAGTGCGGGTGTAGGTAACGGCAACTTGTATAAAACGGTATTCGATACGCTGGCCACTGCCGCGCATAAAGGTACCGTCGTGGTGCGTTCCTCCCGTGTACCAACCGGCTCCACCACGCAGGATGCTGAAGTTGATGATGCGAAATACGGCTTTGTGGCTTCAGGTTCTCTGAACCCGCAAAAAGCGCGTGTTCTGCTGCAGCTTGCGCTGACGCAAACCAAGGATCCTAAGCAGATCCAGGAAATGTTTAATCAGTATTAA）的上游同源序列（978 bp；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）和下游序列（795 bp；其核苷酸序列如SEQID NO.3所示），以及pYG4质粒序列（5796 bp；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示），拷贝到软件CE Design V1.04的多片段克隆（ClonExpress MultiS）的相关位置，并进行相关设置：载体线性化方式选择单酶切线性化，插入片段个数选择2，请选择线性化酶切位点选择BglII。用软件CE Design V1.04设计输出的ansB-up-F/ansB-up-R和ansB-down-F/ansB-down-R引物对，委托北京擎科新业生物技术有限公司广州分公司进行引物合成。以野生魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8的基因组作为模板，使用ansB-up-F/ansB-up-R和ansB-down-F/ansB-down-R引物对和高保真扩增酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase（TaKaRa）分别扩增ansB基因上下游同源臂（图1 泳道2和3）。
引物序列如下：
ansB-up-F：aaaagtgccacctgcagatctTTCGATATTTGGTGGGACTAAGTAGC
ansB-up-R：gccacctgcatcgaGTTATTTCTCCAGTTACTTGAATTTGC
ansB-down-F：aataacTCGATGCAGGTGGCTGCG
ansB-down-R：agtcatatgccgcggagatctCGGTCTGGGGCTACGTAGC
其混合体系如下：
Figure 638973DEST_PATH_IMAGE001
PCR程序如下：
Figure 740135DEST_PATH_IMAGE002
用上述方法扩增出来的产物，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，确认片段的正确性并割胶回收相应的ansB上下游同源片段。
与此同时，用质粒提取试剂盒（生工生物）提取pYG4质粒，并使用下面的酶切体系进行酶切：
Figure 175664DEST_PATH_IMAGE003
上述酶切体系中使用的BglII购买自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa)，同时，将混匀的上述体系放入37°C培养箱孵育15 min，然后，使用胶回收试剂盒（Omega）对酶切后的载体片段进行回收。
将酶切并割胶回收的pYG4质粒载体片段和ansB基因上下游同源臂片段，按照一步无缝连接试剂盒In-Fusion® HD Cloning Kit（TaKaRa）说明书的要求进行连接反应：
Figure 570873DEST_PATH_IMAGE004
将上述体系混合好以后，放置于50°C水浴中15 min，然后置于冰上终止反应，吸取10 μl全部的连接反应液，热激法转化大肠杆菌S17-1（42°C水浴热激90 s），摇床恢复培养1h以后，涂布Kana平板，并放置于37°C培养箱过夜培养，待长出单菌落以后，挑取单菌落并用引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定转化成功的转化子（扩增出来的片段长度是：568 bp，其序列如SEQ ID NO.5所示），则证明敲除载体pYG4-ansB构建正确，可用于后续实验。
ansB-QJ-F：CGCTGGAAAACGATCGTAAAAC；
ansB-QJ-R：CAAGCCGTTCGAGTTCTTTATG。
二、接合转移和ansB敲除子鉴定
将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8野生菌进行接合转移。具体来说，就是先将上述两株菌分别过夜培养，然后调节OD600=1.0左右，并按照1：3的体积比将菌液混合，然后，将混合菌液滴在放有0.22 μm滤膜的LB平板上，静置2 h以后，将平板转移到37°C培养箱，正置培养1 d后，将菌体用PBS洗下并适当稀释以后涂布在含有100 mg/L 卡那霉素和20 mg/L利福平的双抗LB平板上，37°C培养1-2 d。挑取生长菌落利用引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R进行PCR验证，ansB基因一次交换重组菌应该两条带，一个是1615 bp大条带和568 bp小条带。
将一次交换重组成功的菌株用LB液体培养基扩大培养，用扩大培养菌液适当稀释后在含质量分数5%蔗糖的LB平板上划线，培养72 h后，挑取平板上的单菌落用引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R进行PCR验证（图1 泳道4），确定ansB敲除菌，敲除菌株应该是发生了双交换，所以只能扩增出小条带，即568 bp条带（其序列如SEQ ID NO.5所示）；将PCR鉴定为阳性的菌落分别在含100 mg/L 卡那霉素 LB平板或含20 mg/L利福平LB平板上划线，具有利福平抗性、对卡那霉素敏感菌株为最终的ansB基因敲除菌ΔansB，用于后续实验。
将ansB基因敲除菌ΔansB命名为魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）Δ ansB，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No.61849，保藏日期：2021年8月2日。
三、ansB敲除子生物被膜形成能力测定
分别使用3种不同的培养基：普通LB培养基、营养肉汤培养基（NB）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和3种温度条件（25°C、30°C和37°C）测定ΔansB的生物被膜形成能力，其实验步骤主要是：分别用LB、NB和TSB过夜培养ΔansB和野生魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，第二天将菌液的浓度分别用新鲜的LB、NB和TSB调节到OD600=1.0待用；在96孔板（Corning）中分别加入180 μl新鲜无菌LB、NB和TSB培养基，然后，再加入20 μl调好菌浓度的菌液；将上述加了样品的96孔板，分别放入25°C、30°C和37°C培养箱静置培养或者振荡培养（120rpm）2天后，首先将浮游菌舍弃，并对96孔板进行清洗，然后用0.1%的结晶紫进行染色，用灭菌水洗脱掉多余的染料以后，用95%的酒精洗脱残余在96孔板孔壁上的结晶紫，并用酶标仪测定样品在590 nm的光吸收值，用来表示生物被膜的形成量。所有的处理均设8个重复，并且在不同的时间重复至少3次。
魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8和ansB基因敲除子ΔansB在不同条件下的生物被膜形成能力见图2，与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8相比，ΔansB在不同条件下的生物被膜形成能力提高的倍数如下表所示：
Figure 509880DEST_PATH_IMAGE005
从图2和上表可以看出，温度较高的时候（37°C），魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZBF-8在静置条件下，可以形成较多的生物被膜（图2C），但在温度较低的时候（25°C和30°C），野生菌株BF-8生物被膜形成量较少（图2A和2B）；但无论在25°C、30°C还是37°C条件下，在LB培养基中，无论是静置还是振荡，其ΔansB的生物被膜形成能力都有提高，但以30°C静置培养最佳，共计提高了2.68倍；而对于NB培养基，其ΔansB形成生物被膜的最佳条件是25°C静置培养（提高1.67倍）；对于TSB培养基，其ΔansB形成生物被膜的最佳条件是30°C静置培养（提高1.73倍）；综上所述，若想获得比魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8更多的生物被膜，其培养条件是聚苯烯附着材料、LB培养基、30°C和静置培养。
上述结果说明，可以通过敲除魏氏柠檬酸杆菌ansB基因实现该菌株生物被膜生物量的提高（所需的优化条件为：聚苯烯附着材料、LB培养基、30°C和静置培养），具备特定条件下的实际应用潜力和前景。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用
<141> 2021-09-16
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8(Citrobacter werkmanii GDFMZ BF-8)
<400> 1
atggagtttt tcaagaaaac ggcacttgcc gcactggtta tgggtttcag cggcgcggcg 60
cttgcactgc caaacatcac tattttagca accggcggga ccattgccgg cggtggtgat 120
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gtacctcagt tgaaagacat cgcggttgtt aaaggcgagc aggtggtgaa catcggctct 240
caggatatga atgacgacgt ctggttaacg ctggcgaaaa agattaacac cgagtgtgat 300
aaaaccgacg gttttgtcgt gacacatggt acggatacca tggaagaaac tgcctatttc 360
ctcgacctga ccgtcaagtg caacaagccg gtagtgctgg tgggtgcaat gcgtccgtct 420
acagggatga gcgccgatgg cccgttcaac ctgtataacg cagtggtgac ggctgcagac 480
aaagcctctg ccaaccgtgg cgtgctggtg gtgatgaacg acaccgtgat ggatggtcgc 540
gacgtgacca aaaccaacac taccgatgta gccaccttca aatccgttaa ctatggcccg 600
ctgggctaca tccataacgg caagattgac taccagcgta cgcctgcgcg taagcacacc 660
acgtctactc cgttcgatgt gtctaagctg accgaactgc cgaaagtggg gattgtttac 720
aactacgcta acgcctcgga tctgccagcc aaagcgctgg tcgacgcggg ttatgcgggt 780
atcgtcagtg cgggtgtagg taacggcaac ttgtataaaa cggtattcga tacgctggcc 840
actgccgcgc ataaaggtac cgtcgtggtg cgttcctccc gtgtaccaac cggctccacc 900
acgcaggatg ctgaagttga tgatgcgaaa tacggctttg tggcttcagg ttctctgaac 960
ccgcaaaaag cgcgtgttct gctgcagctt gcgctgacgc aaaccaagga tcctaagcag 1020
atccaggaaa tgtttaatca gtattaa 1047
<210> 2
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcgatattt ggtgggacta agtagcacag ggtcggcaaa tgccggcccg atttgtattg 60
agggaaagat atgatgcgca aaacgctgct ggcggcagtc ctcacgttca cggcgatggc 120
cgcacatgcc gattacaagt gcagcgtcac cccacgtgac gatgtgattt tgagcccaca 180
aacggtgcag gtaaaaggcg aaaacggcga tctggtcatt acccaggccg gtgatgtcac 240
ctttaacggt aagcagtaca acctcaacgc cgcacagcgt gagcaggcta aagattatca 300
ggcggcgttg cgtagcagcc tgccgtggat tgacgaaggt gccagagcgc gcgtagagaa 360
aggtcgcgtg gcactggaca aaatcatcgc caaagaggtc ggtgaaagca gcaacatgcg 420
tggccgctta accaagctgg atgcgcaatt gaaagcgcag atgaaccgca tcatcgaaca 480
tcgtactgat gggctgacct tccactataa ggcgattgac caggtccgcg ccgacgggca 540
gcaattagtg aatcaggcga tgggcggcat tttgcaggac agcatcaacg agatgggcgc 600
caaagctgtg ctcaaaggcg gtggtaaccc gctgcagggc gtgctcggga gcctcggtgg 660
tttgcaaacc tcaattcaga acgaatggaa gaatcaggaa caagacttcc agcagtttgg 720
caaagatgtt tgtgcccgcg tcgtgacgct ggaaaacgat cgtaaaacgc tggttagcac 780
gctgaaataa ttttcacctc tttttaacgg cacagaaaca ttctgtgccg ttttattttg 840
tatctttctg tttttttgat atccatctct aagaatggca atttgatgga gatataaatc 900
tggttaattg gaactcgtca cattattcat ctgtaagata gacataatgc tgcaaattca 960
agtaactgga gaaataac 978
<210> 3
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgatgcagg tggctgcgct tatcgcccta accctgtagg cctgataagc gcagcgccat 60
caggcaattt gccggatggc ggctcaaggt cttatccggc ctacatcgtt accgtattac 120
tccgccagaa acagctccag cagcgaattc aaaaacagct taccgtgttg ggtaatctgc 180
cagtattcat cgcattcact caggtaaccc tgggcgatag ctgcatcaat ctgtcgacga 240
ataacgtctt cggcaagccc ggtgtattgc gtgaattctg cacgcggcgc ggcctccagt 300
aaccggaaac gattcataaa gaactcgaac ggcttgtcgg cttcggcaac atcacgctgg 360
ctttccaggt aacgtccttg catgtatccg cgtggatgcc gcgttttggt ggtgcgcaaa 420
atgcgtccgt ccgggaaagt gattttgccg tgcgcgccac agccaatgcc aagatagtcg 480
ccaaaacgcc agtaattgag attgtgctga cactgatagc ccggcttcgc ataggctgag 540
gtttcgtact gctgataccc cgctgcagtc agcaactggt ggccttgctc aaaaatatcc 600
cacagtgcgt catcgtccgg tagaaccggc ggacgtgaac caaatagcgt gttgggttcg 660
atggtcaact gataccagga aagatgcggc gggttgagcg cgatggcctg ctgcaaatca 720
ctcaatgctt cttccagcga ctgatccggc aggccgtgca tcagatcgag attaaagcta 780
cgtagcccca gaccg 795
<210> 4
<211> 5796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgct gcctcgcgcg tttcggtgat 60
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 120
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 180
gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 240
cagagcagat tgtactgaga gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 300
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 360
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 420
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 480
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgcagatctc cgcggcatat gactagtgcg 540
gccgcgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat 600
gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc 660
aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg 720
ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg 780
ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg 840
ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca 900
agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa 960
cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg 1020
cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc 1080
gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa caatttggtt gatgcgagtg 1140
attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc 1200
tgcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1260
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1320
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1380
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg atggtcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1440
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 1500
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 1560
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 1620
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 1680
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 1740
cagacctcag cgcgagctcg gccgcctagg ccgggccctc tagagaattc ttaattaacc 1800
cacgtgttga gaaataaaag aaaatgccaa tgaagtatcg gcattttctt tttgctgtta 1860
ttagttgact gtcagctgtc cttgctccag gatgctgttt ttgacaacgg atgttttatt 1920
gcctttgatg ttcattaaga agctcggggc aaatgttgcc tttttatcct cgaagaagcc 1980
tctgtttgtc atgtagcttg tgataaccac attgttgcct ttggcttgcg gcactgcgaa 2040
gtgagagtaa gtgaatgtca catcgtttgg atcaagaccc atttgcagca caagccctgt 2100
tttgttcagc ggcttgtaag ggccggttaa agagtttgat acataaccaa gcatgtaaat 2160
atcgtttgag ttaataccat cgatcgtcat ttttgaaccg cgtgaatcag tgaacaagta 2220
ccatttgccg ttcattttga aaacattcgc gcgctcgatt tcatcagtta ccgtgtttga 2280
agtgatcagc ggcttcatta cttttttcaa tgtgtaatca ttattaactc tatgataccg 2340
agggcgccgt tcgctaactc agcatcgcgt tttttagcgc tctgctggag cttctggctt 2400
tctttacgga agaagttcgt gccgccgccg tagtacgctt tgttaaataa agattcttcg 2460
ccttggtatc cgttttctgt tcccgtgttg gcttcgaata caagatattt atggcctttg 2520
tcttcaacgt agtgagggtc tctcagcgta tggttgtcgc cggatgtata attgccttca 2580
tcgataaact gctgaacgtt ctgatatgtt tttccgtctc cgtcaaaaat cgttttgtga 2640
tcttccactc cgttgatttt gagtgtgtca tcagattttg acacatttac ctgcgctgtt 2700
gtcaggcttt gtttgccgta atgtttaccg gaatagtcag tgtagaataa acggattttt 2760
ccgtcagatg taaaggttgc agaaccggac cattcttgcg tctgatcttt caggatcgga 2820
tcgttggcgt cgaacttatc gctgtcttta aagacacggc ccgcgttttt ccagctgtcg 2880
attgagttgt cgccgacctt ttgataaaac atgtagattg atgtgtcatc agcgtctttc 2940
gggcttcccg caagagcaaa cacaacgtga tagccgttgt attcagctac tgttccgtca 3000
gcgttttgca gcggccagct gtcccacaca tcaagtcctt ttgcagactc aatattttta 3060
atcgttgatt gatcgaattg aggcacttgg tatttttcgt tttgctgctg tttagggatc 3120
tgcagcatat catggcgtgt aatatgagag acgccgtacg tttctttgta tgctttttgg 3180
ttattttctt tcgcgaaggc ttgagtcgct cctcctgcca gaagtgcagt cgtaaaagtc 3240
agaactgtgg cttgttttac aatttttttg atgttcatgt tcatgtctcc ttctgtatgt 3300
actgtttttt gcgatctgcc gtttcgatcc tcccgaattg actagtgggt aggcctaatt 3360
gcggcctagg gataacaggg taatgcggcc gcggccggcc gtcgacaagc ttggatccgc 3420
ccgggcctaa ttggccggcg cgccaaaaat ttattagagc aatatagtcc tagaatgtca 3480
aaggtaccga tcatgatcta gaattcccat gtcagccgtt aagtgttcct gtgtcactca 3540
aaattgcttt gagaggctct aagggcttct cagtgcgtta catccctggc ttgttgtcca 3600
caaccgttaa accttaaaag ctttaaaagc cttatatatt cttttttttc ttataaaact 3660
taaaacctta gaggctattt aagttgctga tttatattaa ttttattgtt caaacatgag 3720
agcttagtac gtgaaacatg agagcttagt acgttagcca tgagagctta gtacgttagc 3780
catgagggtt tagttcgtta aacatgagag cttagtacgt taaacatgag agcttagtac 3840
gtgaaacatg agagcttagt acgtactatc aacaggttga actgctgatc ttcagatcct 3900
ctacgccgga cgcatcgtgg ccggatccag ccgaccaggc tttccacgcc cgcgtgccgc 3960
tccatgtcgt tcgcgcggtt ctcggaaacg cgctgccgcg tttcgtgatt gtcacgctca 4020
agcccgtagt cccgttcgag cgtcgcgcag aggtcagcga gggcgcggta ggcccgatac 4080
ggctcatgga tggtgtttcg ggtcgggtga atcttgttga tggcgatatg gatgtgcagg 4140
ttgtcggtgt cgtgatgcac ggcactgacg cgctgatgct cggcgaagcc aagcccagcg 4200
cagatgcggt cctcaatcgc gcgcaacgtc tccgcgtcgg gcttctctcc cgcgcggaag 4260
ctaaccagca ggtgataggt cttgtcggcc tcggaacggg tgttgccgtg ctgggtcgcc 4320
atcacctcgg ccatgacagc gggcagggtg tttgcctcgc agttcgtgac gcgcacgtga 4380
cccaggcgct cggtcttgcc ttgctcgtcg gtgatgtact tcaccagctc cgcgaagtcg 4440
ctcttcttga tggagcgcat ggggacgtgc ttggcaatca cgcgcacccc ccggccgttt 4500
tagcggctaa aaaagtcatg gctctgccct cgggcggacc acgcccatca tgaccttgcc 4560
aagctcgtcc tgcttctctt cgatcttcgc cagcagggcg aggatcgtgg catcaccgaa 4620
ccgcgccgtg cgcgggtcgt cggtgagcca gagtttcagc aggccgccca ggcggcccag 4680
gtcgccattg atgcgggcca gctcgcggac gtgctcatag tccacgacgc ccgtgatttt 4740
atagccctgg ccgacggcca gcaggtaggc cgacaggctc atgccggccg ccgccgcctt 4800
ttcctcaatc gctcttcgtt cgtctggaag gcagtacacc ttgataggtg ggctgccctt 4860
cctggttggc ttggtttcat cagccatccg cttgccctca tctgttacgc cggcggtagc 4920
cggccagcct cgcagagcag gattcccgtt gagcaccgcc aggtgcgaat aagggacagt 4980
gaagaaggaa cacccgctcg cgggtgggcc tacttcacct atcctgcccg gctgacgccg 5040
ttggatacac caaggaaagt ctacacgaac cctttggcaa aatcctgtat atcgtgcgaa 5100
aaaggatgga tataccgaaa aaatcgctat aatgaccccg aagcagggtt atgcagcgga 5160
aaagcgctgc ttccctgctg ttttgtggaa tatctaccga ctggaaacag gcaaatgcag 5220
gaaattactg aactgagggg acaggcgaga gacgatgcca aagagctaca ccgacgagct 5280
ggccgagtgg gttgaatccc gcgcggccaa gaagcgccgg cgtgatgagg ctgcggttgc 5340
gttcctggcg gtgagggcgg atgtcgaggc ggcgttagcg tccggctatg cgctcgtcac 5400
catttgggag cacatgcggg aaacggggaa ggtcaagttc tcctacgaga cgttccgctc 5460
gcacgccagg cggcacatca aggccaagcc cgccgatgtg cccgcaccgc aggccaaggc 5520
tgcggaaccc gcgccggcac ccaagacgcc ggagccacgg cggccgaagc aggggggcaa 5580
ggctgaaaag ccggcccccg ctgcggcccc gaccggcttc accttcaacc caacaccgga 5640
caaaaaggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg 5700
ttgctggcgc ctatctcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc 5760
tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcag 5796
<210> 5
<211> 568
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgctggaaaa cgatcgtaaa acgctggtta gcacgctgaa ataattttca cctcttttta 60
acggcacaga aacattctgt gccgttttat tttgtatctt tctgtttttt tgatatccat 120
ctctaagaat ggcaatttga tggagatata aatctggtta attggaactc gtcacattat 180
tcatctgtaa gatagacata atgctgcaaa ttcaagtaac tggagaaata actcgatgca 240
ggtggctgcg cttatcgccc taaccctgta ggcctgataa gcgcagcgcc atcaggcaat 300
ttgccggatg gcggctcaag gtcttatccg gcctacatcg ttaccgtatt actccgccag 360
aaacagctcc agcagcgaat tcaaaaacag cttaccgtgt tgggtaatct gccagtattc 420
atcgcattca ctcaggtaac cctgggcgat agctgcatca atctgtcgac gaataacgtc 480
ttcggcaagc ccggtgtatt gcgtgaattc tgcacgcggc gcggcctcca gtaaccggaa 540
acgattcata aagaactcga acggcttg 568

Claims (6)

1.魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔansB，其保藏编号为：GDMCCNo.61849。
2.一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，是敲除魏氏柠檬酸杆菌的ansB基因，提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，其保藏编号为：GDMCC No.61858，所述的ansB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增ansB基因的上下游同源片段，将其与质粒pYG4连接构建敲除载体pYG4-ansB，然后转化大肠杆菌S17-1；将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌接合转移，获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)引物序列：
ansB-up-F：aaaagtgccacctgcagatctTTCGATATTTGGTGGGACTAAGTAGC
ansB-up-R：gccacctgcatcgaGTTATTTCTCCAGTTACTTGAATTTGC
ansB-down-F：aataacTCGATGCAGGTGGCTGCG
ansB-down-R：agtcatatgccgcggagatctCGGTCTGGGGCTACGTAGC
ansB-QJ-F：CGCTGGAAAACGATCGTAAAAC；
ansB-QJ-R：CAAGCCGTTCGAGTTCTTTATG；
(2)以提取的魏氏柠檬酸杆菌基因组DNA作为模板，分别以ansB-up-F和ansB-up-R，ansB-down-F和ansB-down-R为引物，扩增得到ansB基因的上下游同源序列；
(3)用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收；
(4)将扩增得到的ansB基因的上下游同源片段连接到质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4-ansB，然后热激转化大肠杆菌S17-1；
(5)将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌共孵育，将共孵育物洗脱下来，稀释后涂布于卡那霉素和利福平抗性筛选LB平板，用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定ansB基因一次交换重组子；
(6)然后将一次交换重组子用LB液体培养基扩大培养并稀释后涂布到含质量分数5％蔗糖的LB平板上，挑取单克隆，使用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。
5.权利要求1的魏氏柠檬酸杆菌ΔansB在吸附重金属离子或蛋白合成微工厂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在以聚苯烯附着材料、LB培养基、30℃和静置培养的条件下进行应用。
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