CN110846268B - 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 - Google Patents
一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110846268B CN110846268B CN201911223430.9A CN201911223430A CN110846268B CN 110846268 B CN110846268 B CN 110846268B CN 201911223430 A CN201911223430 A CN 201911223430A CN 110846268 B CN110846268 B CN 110846268B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mul
- lactobacillus plantarum
- lacm
- food
- laca
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 title claims abstract description 61
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 40
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 244000185256 Lactobacillus plantarum WCFS1 Species 0.000 claims abstract description 22
- 235000011227 Lactobacillus plantarum WCFS1 Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 6
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 130
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 51
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 41
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 31
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 31
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 30
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 30
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 30
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 30
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 16
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 13
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 10
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 7
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 7
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 7
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 7
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 7
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 7
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 2
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 claims 1
- 101150090507 lacM gene Proteins 0.000 abstract description 37
- 101150086432 lacA gene Proteins 0.000 abstract description 33
- 101100325906 Bacillus subtilis (strain 168) ganA gene Proteins 0.000 abstract description 20
- 101100111413 Thermoanaerobacter pseudethanolicus (strain ATCC 33223 / 39E) lacZ gene Proteins 0.000 abstract description 20
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 101150094189 gshAB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150009839 lacF gene Proteins 0.000 description 3
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100301559 Bacillus anthracis repS gene Proteins 0.000 description 1
- 101710085076 Beta-galactosidase LacA Proteins 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100247969 Clostridium saccharobutylicum regA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100136641 Escherichia coli (strain K12) pifC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100412434 Escherichia coli (strain K12) repB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100301564 Staphylococcus aureus repF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101100114425 Streptococcus agalactiae copG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-VANKVMQKSA-N alpha-D-tagatofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-VANKVMQKSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 101150056134 lacL gene Proteins 0.000 description 1
- -1 lactococcus Chemical compound 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 101150044854 repA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043558 repc gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
- A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。所述食品级植物乳杆菌表达系统包含食品级宿主植物乳杆菌NZ1210、食品级表达载体pLP4180；所述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacM基因而获得，丧失利用乳糖的能力；所述表达系统在异源蛋白表达中应用，表达效果显著；所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记，可以直接应用于酸奶发酵中。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够发酵碳水化合产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的通称，包括乳球菌，乳杆菌，双歧杆菌和链球菌等。他们被广泛应用于食品发酵行业，如牛奶，肉类，蔬菜和谷物中。此外，乳酸菌菌株是用作益生菌的最常见微生物。乳酸菌通常被认为是安全的，而基因工程技术在改善现有菌株或开发新菌株方面的应用是活跃的研究领域。基因技术允许通过引入新基因或修饰其代谢功能对菌株进行修饰。这些变化可以改善食品技术并促进人体健康。传统上，抗生素抗性基因通常被用作实验室研究中载体的选择标记。然而，出于法律和道德原因，由于抗生素抗性的基因的转移，在食品或临床应用中不能采取这种方法。因此，需要使用其它替代的选择标记。
基于染色体基因中特定突变的互补是获得稳定和可选择的宿主/载体系统的一种重要方法，该基因编码特定代谢途径中的必要步骤或赋予生物体或表型某些特性。第一步，构建可行的敲除突变体，在宿主染色体中携带所需的基因缺失。第二步包含携带相容性互补的表达载体的构建。其优点是可以在发酵系统中保持选择性压力，例如在发酵牛奶中可以不添加任何补充剂。植物乳杆菌代谢背景清晰，它不仅能够利用葡萄糖，还可以利用乳糖作为碳源进行良好生长。其乳糖代谢依赖于体内的β-半乳糖苷酶LacA和LacLM，其中LacA由基因lacA(2052bp)所编码，LacLM是由lacL(1881bp)和lacM(960bp)基因编码蛋白所形成的异源二聚体。因此拟选择lacM基因作为筛选标记，开发其为植物乳杆菌的食品级表达系统，为乳酸菌在功能性酸奶领域的研究提供一种有效安全的手段。
中国文献《“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展》(郝凤奇、杨桂连、叶丽萍等，中国预防兽医学报，第30卷第10期，2008年10月)公开了乳糖选择标记，MacCormick等将完整乳糖操纵子整合到一株敲除质粒的乳酸乳球MG5276的染色体上，并通过双交换使lacF基因失活，结果该菌株不能利用乳糖(Lac-)，然后再将克隆有lacF基因的质粒转到上述菌株中，该菌则恢复了利用乳糖的能力(Lac+)。
乳糖在乳酸乳球菌中的代谢，首先通过磷酸转移酶系统将胞外的乳糖磷酸化后，转运至胞内，再经过胞内的塔格糖-6-磷酸途径进一步代谢。上述技术中，lacF基因的功能即为负责磷酸化乳糖向胞内转运。而在植物乳杆菌中，乳糖代谢途径与乳酸乳球菌显著不同。首先由乳糖透过酶将乳糖直接转运至胞内，胞内的β-半乳糖苷酶再将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这两个单糖分别进一步代谢，而且植物乳杆菌中β-半乳糖苷酶具有两种同工酶。因此与上述现有技术相比，本发明针对植物乳杆菌中乳糖独特代谢途径，开发了一种适合植物乳杆菌的食品级载体构建方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，该套植物乳杆菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。
本发明的技术方案如下：
一株食品级宿主植物乳杆菌NZ1210的构建，包括如下步骤：
(1)提取植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对扩增基因lacA的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增基因lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
LacA-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTCCGTGGAATAAACCGGTTCA SEQ ID NO.1
LacA-up-R:TTAAGTGGGGTGAAATTAATGGCAC SEQ ID NO.2
LacA-down-F:GTGCCATTAATTTCACCCCACTTAATCAAACGCACCCTCACTTCT SEQ ID NO.3
LacA-down-R:agtggatcccccgggctgcagCACCCACGGCCAACGGAT SEQ ID NO.4
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3018bp目的产物的菌体即为lacA基因敲除菌株；
所得菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况稍为减弱；
LacA-test-F:TCAGAATGTCAGATGCAG SEQ ID NO.5
LacA-test-R:TTTACACACCGTGTTACC SEQ ID NO.6
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
(5)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的引物对扩增基因lacM的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10的引物对扩增基因lacM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacM基因敲除连接臂；
LacM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGCACTTGTGGTCACCACAAACG SEQ ID NO.7
LacM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTTTATTTGTGTAAGCCATAATAATAT SEQ IDNO.8
LacM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.9
LacM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.10
(6)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(5)中制得的lacM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(7)将步骤(6)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12的引物对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3043bp目的产物即为同时敲除lacA和lacM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ1210；
植物乳杆菌NZ1210在MRS-乳糖培养基失去生长能力。
LacM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.11
LacM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.12
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-down-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)或(6)验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中转化子的培养条件，转化子在含有5μg/mL红霉素的MRS平板上进行培养，温度为30℃。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中MRS-乳糖培养基每升组分如下：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-test-F 2μL，引物LacA-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacM上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacM下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-down-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacM上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-test-F 2μL，引物LacM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
食品级表达载体pLP4180，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
所述食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因；将合成的表达载体pLP4180转化入植物乳杆菌NZ1210后，其在MRS-乳糖培养基中的生长情况可以得到恢复。
根据本发明优选的，食品级表达载体pLP4180的序列由上海生工生物工程有限公司进行合成。
一种食品级植物乳杆菌表达系统，包含上述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和上述食品级表达载体pLP4180。
上述食品级植物乳杆菌表达系统中，植物乳杆菌WCFS1的lacM基因是食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和食品级表达载体pLP4180完成互补筛选的食品级标记；食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacM基因而获得，丧失乳糖利用的能力。
上述食品级植物乳杆菌表达系统在生产异源物中的应用。
上述食品级植物乳杆菌表达系统生产的异源物在酸奶制备中的应用。
根据本发明优选的，所述食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达谷胱甘肽的应用，包括以下步骤：
a利用核苷酸序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物对gshF-F和gshF-R进行PCR扩增谷胱甘肽合成酶基因gshF；
gshF-F:ATACATATGACATTAAACCAACTTC；SEQ ID NO.14
gshF-R:ATACTCGAGTTAAGTTTGACCAGCCAC；SEQ ID NO.15
b将步骤a制备的谷胱甘肽合成酶基因gshF插入食品级表达载体pLP4180多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ1210中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中谷胱甘肽的含量控制发酵过程。
本发明的有益效果：
本发明涉及一种食品级植物乳杆菌表达系统，该系统具备食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和食品级表达载体pLP4180，且lacM基因是宿主和载体可以完成互补筛选的食品级标记，筛选压力只需更换MRS培养基中的碳源为乳糖，在外源基因的表达过程中无需添加抗生素，避免了因抗性因子转移带来的生物安全性的潜在危害，并且该系统在酸奶发酵中具有良好应用。
附图说明
图1：lacA基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片；
其中：左侧为Marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；
图2：lacM基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片；
其中：左侧为Marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；
图3：载体pLP4180结构示意图；
其中：repA和repC为复制元件，Pldh为启动子和Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及lacM；
图4：食品级载体pLP4180表达绿色荧光蛋白柱状图；
其中：RFU表示荧光强度，pLP4180-gfp表示转化入绿色荧光蛋白基因的菌株，pLP4180表示转化入空载体的菌株；
图5：食品级载体pLP4180在酸奶中生产谷胱甘肽柱状图；
其中：pLP4180-gsh表示转化入谷胱甘肽合成酶基因的菌株，pLP4180表示转化入空载体的菌株；
图6：不同菌株在MRS-乳糖培养基中的24小时生长OD；
其中：WCFS1代表野生型菌株，ΔlacA代表lacA基因敲除菌株，NZ1210代表lacA和lacM基因双敲除菌株，ΔlacM代表lacM基因敲除菌株，NZ1210+pLP4180代表菌株NZ1210转化质粒pLP4180；
图7：代表性菌株在MRS-乳糖培养基中的24小时生长水平；
其中：WCFS1代表野生型菌株，ΔlacA代表lacA基因敲除菌株，ΔlacM代表lacM基因敲除菌株，NZ1210代表lacA和lacM基因双敲除菌株，NZ1210+pLP4180代表菌株NZ1210转化质粒pLP4180。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
植物乳杆菌WCFS1：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
大肠杆菌XL-Blue1感受态细胞:购自北京全式金生物技术有限公司，普通市售已知菌株；
嗜热链球菌：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
质粒pNZ8149：购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
质粒pTVP1GFP：包含绿色荧光蛋白基因，购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
细菌基因组提取试剂盒：购自北京天根生物科技有限公司；
柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：购自南京诺韦赞生物科技有限公司；
红霉素、琼脂糖、核酸染料等购自上海生工生物工程有限公司；
Ex taq及rtaq等聚合酶、限制性内切酶(PstI、XhoI，NdeI、BamHI)、T4DNA连接酶，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司提供；
谷胱甘肽定量检测试剂盒：购自北京索莱宝生物科技有限公司；
实施例中所述的MRS-乳糖培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
实施例中所述的MRS平板，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，琼脂粉20.0g，余量水。
MRS液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
实施例1
食品级宿主植物乳杆菌NZ1210的构建，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌WCFS1接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；MRS培养基成分每升含有：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对LacA-up-F和LacA-up-R进行PCR扩增基因lacA的上游同源臂，
LacA-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTCCGTGGAATAAACCGGTTCA SEQ ID NO.1
LacA-up-R:TTAAGTGGGGTGAAATTAATGGCAC SEQ ID NO.2
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对LacA-down-F和LacA-down-R进行PCR扩增基因lacA的下游同源臂，
LacA-down-F:GTGCCATTAATTTCACCCCACTTAATCAAACGCACCCTCACTTCT SEQ ID NO.3
LacA-down-R:agtggatcccccgggctgcagCACCCACGGCCAACGGAT SEQ ID NO.4
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-down-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中，制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体管，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对第二次同源交换成功的菌株进行PCR检测，扩增出3018bp的目的产物即为lacA基因敲除菌株如图1，敲除lacA基因后，菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况稍微减弱(图6和图7)。
LacA-test-F:TCAGAATGTCAGATGCAG SEQ ID NO.5
LacA-test-R:TTTACACACCGTGTTACC SEQ ID NO.6
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-test-F 2μL，引物LacA-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(6)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的引物对LacM-up-F和LacM-up-R进行PCR扩增基因lacM的上游同源臂，
LacM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGCACTTGTGGTCACCACAAACG SEQ ID NO.7
LacM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTTTATTTGTGTAAGCCATAATAATAT SEQ IDNO.8
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对LacM-down-F和LacM-down-R进行PCR扩增基因lacM的下游同源臂，
LacM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.9
LacM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.10
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-down-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacM基因敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(7)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(6)制得的lacM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒。
(8)将步骤(7)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。第一次同源交换菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点终于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基，30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12的引物对LacM-test-F和LacM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，扩增出3043bp的目的产物即为lacM基因敲除菌株如图2。
LacM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.11
LacM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.12
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-test-F 2μL，引物LacM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(9)最终获得同时敲除lacA和lacM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ1210，植物乳杆菌NZ1210在MRS-乳糖培养基失去生长能力(图6和图7)。
实施例2
食品级表达载体pLP4180
食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因。其图谱如图3所示，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。将合成的表达载体pLP4180转化入植物乳杆菌NZ1210后，其在MRS-乳糖培养基中的生长情况不仅得到了恢复，还接近野生型WCFS1的菌体量水平(图6和图7)。
实施例3
利用上述食品级表达系统表达绿色荧光蛋白
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的引物对gfp-F和gfp-R进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将载体pLP4180使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4DNA聚合酶就进行连接，连接产物转化植物乳杆菌NZ1210，转化子在MRS-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的液体MRS-乳糖培养基，37℃培养24小时后，利用荧光酶标仪检测绿色荧光蛋白在NZ1210中的表达，结果如图4所示。
gfp-F:ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC SEQ ID NO.16
gfp-R:ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG SEQ ID NO.17
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
实施例4
利用上述食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达谷胱甘肽的应用
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物对gshF-F和gshF-R扩增嗜热链球菌的谷胱甘肽合成酶基因gshF，扩增产物使用NdeI和XhoI双酶切，并将载体pLP4180使用NdeI和XhoI双酶切，酶切的产物使用T4DNA聚合酶就进行连接，连接产物转化植物乳杆菌NZ1210，转化子在MRS-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于牛奶中，42℃培养12小时后，测定发酵酸奶中谷胱甘肽的含量，结果如图5所示。
gshF-F:ATACATATGACATTAAACCAACTTC SEQ ID NO.14
gshF-R:ATACTCGAGTTAAGTTTGACCAGCCAC SEQ ID NO.15
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gshF-F 2μL，引物gshF-R 2μL，嗜热链球菌基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例1
构建单独敲除lacM的植物乳杆菌，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌WCFS1接种于MRS培养基中，37℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；MRS培养基成分每升含有：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacM-up-F和LacM-up-R扩增基因lacM的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-μp-F 2μL，引物LacM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacM-down-F和LacM-down-R扩增基因lacM的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-down-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGCACTTGTGGTCACCACAAACG
LacM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTTTATTTGTGTAAGCCATAATAATAT
LacM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC
LacM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacM-test-F和LacM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-test-F 2μL，引物LacM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3043bp大小的目的产物即为lacM基因敲除菌株。
LacM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG
LacM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA
(6)获得敲除lacM基因的植物乳杆菌，菌株在MRS-乳糖培养基中的生长最终获得的菌体量仅为野生型菌株的1/2，表明lacM对菌株利用乳糖的能力具有显著影响(图6和图7)。
对比例2
构建单独敲除lacA的植物乳杆菌，构建方法同实施例1的步骤(1)-步骤(5)获得lacA基因敲除菌株，检测该菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况。结果显示其在MRS-乳糖培养基中的生长最终获得的菌体量为野生型菌株的5/6(图6)，表明lacA基因对菌株利用乳糖的能力影响不显著，也表明lacA基因不适合作为筛选标记。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggtaccgggc cccccctcga gtccgtggaa taaaccggtt ca 42
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ttaagtgggg tgaaattaat ggcac 25
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gtgccattaa tttcacccca cttaatcaaa cgcaccctca cttct 45
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
agtggatccc ccgggctgca gcacccacgg ccaacggat 39
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
tcagaatgtc agatgcag 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
tttacacacc gtgttacc 18
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ggtaccgggc cccccctcga ggcacttgtg gtcaccacaa acg 43
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
gttcttttga aatcaaaata acttttattt gtgtaagcca taataatat 49
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
aagttatttt gatttcaaaa gaac 24
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
agtggatccc ccgggctgca ggttaggcgt accagatcgt ggc 43
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
cgtataccct caatcaag 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
gcttgactat gggaatca 18
<210> 13
<211> 3505
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
aattcagcaa tttagccttg atttacaatc ataagcgtgt gtaataagaa tttactaaca 60
aaaattcaat tttttgaata atatctgttt acaaatcaga ttaggctata tataatattt 120
aaggattctc agtgatgggt gcgcgatttg gccttttcac taggatgtag tataatacta 180
actaaagaat tgttgagacc attttggcct cgacgttatt cttgcgaaaa tcacaggagg 240
tttcacatat gagatatctg cagggatcca tgcataccat cgatctcgag tgcatatttt 300
cggcaatctt ctcaatgaga tgctcttcag catgttcaat gatgtcgatt ttttattaaa 360
acgtctcaaa atcgtttctg agacgtttta gcgtttattt cgtttagtta tcggcataat 420
cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct ttgcagcgaa 480
gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc gcagcgtcct 540
tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa taaatcgttt ctgagacgtt 600
ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta 660
aaagcccttg agcgtagcgt ggctttgcag cgaagatgtt gtctgttaga ttatgaaagc 720
cgatgactga atgaaataat aagcgcagcg tccttctatt tcggttggag gaggctcaag 780
ggagtttgag ggaatgaaat tccctcatgg gtttgatttt aaaaattgct tgcaattttg 840
ccgagcggta gcgctggaaa atttttgaaa aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg 900
aaaggaagcg aattttgctt ccgtactacg accccccatt aagtgccgag tgccaatttt 960
tgtgccaaaa acgctctatc ccaactggct caagggtttg aggggttttt caatcgccaa 1020
cgaatcgcca acgttttcgc caacgttttt tataaatcta tatttaagta gctttatttt 1080
tgtttttatg attacaaagt gatacactaa ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt 1140
aaatggtgat ttcagaatcg aaaaaaagag ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata 1200
aaaaattaac agatatggcg aaacaaaaag atttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag 1260
ctatagaaga atatgcaaga aaggaatcag aacaaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt 1320
ttagaaggat acgagttttc gctacttgtt tttgataagg taattatatc atggctatta 1380
aaaatactaa agctagaaat tttggatttt tattatatcc tgactcaatt cctaatgatt 1440
ggaaagaaaa attagagagt ttgggcgtat ctatggctgt cagtccttta cacgatatgg 1500
acgaaaaaaa agataaagat acatggaata gtagtgatgt tatacgaaat ggaaagcact 1560
ataaaaaacc acactatcac gttatatata ttgcacgaaa tcctgtaaca atagaaagcg 1620
ttaggaacaa gattaagcga aaattgggga atagttcagt tgctcatgtt gagatacttg 1680
attatatcaa aggttcatat gaatatttga ctcatgaatc aaaggacgct attgctaaga 1740
ataaacatat atacgacaaa aaagatattt tgaacattaa tgattttgat attgaccgct 1800
atataacact tgatgaaagc caaaaaagag aattgaagaa tttactttta gatatagtgg 1860
atgactataa tttggtaaat acaaaagatt taatggcttt tattcgcctt aggggagcgg 1920
agtttggaat tttaaatacg aatgatgtaa aagatattgt ttcaacaaac tctagcgcct 1980
ttagattatg gtttgagggc aattatcagt gtggatatag agcaagttat gcaaaggttc 2040
ttgatgctga aacgggggaa ataaaatgac aaacaaagaa aaagagttat ttgctgaaaa 2100
tgaggaatta aaaaaagaaa ttaaggactt aaaagagcgt attgaaagat acagagaaat 2160
ggaagttgaa ttaagtacaa caatagattt attgagagga gggattattg aataaataaa 2220
agcccccctg acgaaagtcg aataagacct ttagaacaag atttggtaac gctttacaaa 2280
tttatcacgt tatcgattca aattcttctt atcgcccgtt gtcgttgtca gtagttgttg 2340
tcatttagtt aaagtttaac taaaacgaca tatacaaatt taatattttg ttttatgata 2400
attgtaagcg tttttattta tgtaactttg aaaggagctt cctcatggct tacacaaata 2460
atcaactaca cgttatttac ggcgacggga gtttaggact acagggggct aatttccact 2520
acctctttag ctacgaacgt ggcggacttg aatcactcgt cgtcaacgat aaagagtggc 2580
tctatcgtac acccacgccc atcttttggc gggcgacaac cgataatgat cacggtagcg 2640
gcttttcagt caaatccgca cagtggtacg cggccgataa gttctcaact tgtcaagata 2700
tcgaattgac ggttgacgac caaccagtca caccgttacc aatcgcgcca ctcaataaca 2760
aatacacgga tcacgaaatc gccacgaaag tctcactggc ttaccacttc gttaccacga 2820
ccgttcctag taccatcgtc acagtgactt atacggtgac agcagacggt cagatcaata 2880
tcgccaccca ttatagcggt cagtctgatt tgccagagct acccgcattt ggtctgcggt 2940
ttatcatacc aactaccgcg accggcttcg actataccgg tttgtccggt gagacttatc 3000
ctgaccggct ggccggcgca acgcacgggc gattccacgt tgacagtctg ccagtcacac 3060
catacttggt cccacaagaa tgcggcatgc acatgcaaac tgaacaagtg acagtaacgc 3120
gatcaacaac acaaaataac gctgaccacg acaacacacc gttcagtttg acatttagcc 3180
aagccgatgc accattcgcc ttcagctgcc ttccctatac cgccgctgaa ctagaaaacg 3240
caacgcacat ggaagaatta ccattagcac ggcgaacggt cttatcaatc tacggtgccg 3300
ttcgtggggt cggtggcatt gatagttggg gaacagacgt agaatcccca tatcatatcc 3360
ccgctgatca agacattgac ttcagcttta atattcattt ctaaaagtta ttttgatttc 3420
aaaagaacgc tccggcgagt tatttgccag agcgttcttt tagattaacg atgattaagt 3480
tttaatatgt ttaatggctg agctt 3505
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
atacatatga cattaaacca acttc 25
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
atactcgagt taagtttgac cagccac 27
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
atacatatga gcaaaggaga agaac 25
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
ataggatcct tagtatagct catccatg 28
Claims (11)
1.一种食品级植物乳杆菌表达系统构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）一株食品级宿主植物乳杆菌NZ1210的构建方法，括如下步骤：
①提取植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1的基因组DNA；
②以步骤①的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对扩增基因lacA的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增基因lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
③使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤②中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
④将步骤③得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3018bp目的产物的菌体即为lacA基因敲除菌株；
⑤以步骤①获得的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物对扩增基因lacM的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对扩增基因lacM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacM基因敲除连接臂；
⑥使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤⑤中制得的lacM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
⑦将步骤⑥得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3043bp目的产物即为同时敲除lacA和lacM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ1210，丧失乳糖利用的能力；
（2）将食品级表达载体pLP4180转化到步骤（1）中的食品级宿主植物乳杆菌NZ1210中，所述食品级表达载体pLP4180的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
2.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤②中，lacA上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacA-up-F 2 µL，引物LacA-up-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，lacA下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacA-down-F 2 µL，引物LacA-down-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，lacA上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacA-up-F 2 µL，引物LacA-down-R 2 µL，上游同源臂 1 µL，下游同源臂 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水12 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
3.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统构建方法，其特征在于，所述步骤③或⑥验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250 µg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250 µg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
4.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中转化子的培养条件，转化子在含有5µg/mL红霉素的MRS平板上进行培养，温度为30℃。
5.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5 µg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5 µg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5 µg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
6.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
7.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5 µg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株；
所述步骤④或⑦中MRS-乳糖培养基每升组分如下：蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，乳糖20.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，醋酸钠5.0 g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05 g，吐温80 1.0 mL，余量水。
8.如权利要求1所述食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacA-test-F 2 µL，引物LacA-test-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑤中，lacM上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacM-up-F 2 µL，引物LacM-up-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑤中，lacM下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacM-down-F 2 µL，引物LacM-down-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑤中，lacM上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacM-up-F 2 µL，引物LacM-down-R 2 µL，上游同源臂 1 µL，下游同源臂 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水12 µL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑦中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25 µL，dNTP 4 µL，引物LacM-test-F 2 µL，引物LacM-test-R 2 µL，基因组DNA 1 µL，Ex taq 1 µL, 双蒸水13 µL；
PCR检测反应条件为： 95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
9.权利要求1构建的一种食品级植物乳杆菌表达系统，其特征在于，包含食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和食品级表达载体pLP4180。
10.权利要求9所述食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达异源物的应用。
11.权利要求10所述应用，其特征在于，食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达谷胱甘肽的应用，包括以下步骤：
a 利用核苷酸序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物对gshF-F和gshF-R进行PCR扩增谷胱甘肽合成酶基因gshF；
b将步骤a制备的谷胱甘肽合成酶基因gshF插入食品级表达载体pLP4180多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ1210中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中谷胱甘肽的含量控制发酵过程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911223430.9A CN110846268B (zh) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911223430.9A CN110846268B (zh) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110846268A CN110846268A (zh) | 2020-02-28 |
| CN110846268B true CN110846268B (zh) | 2021-06-25 |
Family
ID=69607680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911223430.9A Active CN110846268B (zh) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110846268B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111254106B (zh) * | 2020-03-27 | 2022-06-24 | 齐鲁工业大学 | 一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 |
| CN111363714B (zh) * | 2020-04-07 | 2022-06-28 | 齐鲁工业大学 | 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 |
| CN112080451A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-12-15 | 宁波大学 | 一种嗜酸乳杆菌的食品级基因表达体系及其制备方法和应用 |
| CN113817760B (zh) * | 2021-10-13 | 2023-08-22 | 齐鲁工业大学 | 一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108220219A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-29 | 南京师范大学 | 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9029136B2 (en) * | 2012-07-25 | 2015-05-12 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
-
2019
- 2019-12-03 CN CN201911223430.9A patent/CN110846268B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108220219A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-29 | 南京师范大学 | 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "食品级"乳酸菌表达载体系统的研究进展;郝凤奇 等;《中国预防兽医学报》;20081031;第30卷(第10期);第824页右栏第3-4段 * |
| Development of strong lactose/galactose-inducible expression system for Lactobacillus plantarum by optimizing promoter;Susu Zhang et al.;《Biochemical Engineering Journal》;20190727;第151卷;摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110846268A (zh) | 2020-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110846268B (zh) | 一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 | |
| US8802403B2 (en) | Method of preparation of a compound using a genetically modified homolactic thermophilic bacilli | |
| CN110241061B (zh) | 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用 | |
| US8741622B2 (en) | Stress tolerant Bifidobacteria | |
| CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN110791522B (zh) | 一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用 | |
| CN111254106B (zh) | 一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用 | |
| CN108220219B (zh) | 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用 | |
| Rothstein et al. | Towards high-throughput genome engineering in lactic acid bacteria | |
| CN106636168A (zh) | 一种调控丙酮丁醇梭菌胞外聚合物合成的方法 | |
| CN111363714B (zh) | 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 | |
| CN116121288B (zh) | 一组克隆恶臭假单胞菌大片段dna的载体及其应用 | |
| CN116676246A (zh) | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 | |
| CN113583931B (zh) | 魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用 | |
| CN101374951B (zh) | 同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰 | |
| CN114875055B (zh) | 一种嗜热链球菌重组菌的构建方法及应用 | |
| CN109593701B (zh) | 一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法 | |
| US6331140B1 (en) | Mobile genetic elements as tools for genetic modification of L. delbrueckii or L. helveticus | |
| CN109628366B (zh) | 一种提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法 | |
| CN113817760B (zh) | 一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用 | |
| Xu et al. | A food-grade vector for Streptococcus thermophilus based on the α-complementation of β-galactosidase | |
| CN113355271B (zh) | 提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用 | |
| Liu et al. | Hsp from Lactobacillus plantarum Expression in Lactococcus lactis MG1363 | |
| CN118460443A (zh) | 一种提高乳酸菌多重胁迫耐受性的方法 | |
| CN117126834A (zh) | S-核糖同型半胱氨酸酶LuxS突变体、工程菌及制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20200228 Assignee: Shandong jiehelix Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: Qilu University of Technology Contract record no.: X2021980012832 Denomination of invention: Food grade Lactobacillus plantarum expression system and its application in yoghurt preparation Granted publication date: 20210625 License type: Exclusive License Record date: 20211122 |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501 Patentee after: Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences) Country or region after: China Address before: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501 Patentee before: Qilu University of Technology Country or region before: China |