CN110791522B - 一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用 - Google Patents

一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用。所述食品级植物乳杆菌表达系统包含食品级宿主植物乳杆菌NZ0203、食品级表达载体pLP4180和pLP5120；所述食品级宿主植物乳杆菌NZ0203是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacLM基因而获得，丧失利用乳糖的能力；所述表达系统在异源蛋白表达中应用，表达效果显著；所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记，可以直接应用于酸奶发酵中。

Description

一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用。
背景技术
质粒是存在于细胞质中，具有自主复制能力，相对独立于染色体的遗传原件。它能在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子，广泛存在于各种微生物中。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
到目前为止，已经有很多外源基因被连接到不同的表达载体中,转化入受体宿主，从而赋予宿主新的表型特征，满足人类的需要。值得一提的是,很多生物学功能并不是由一个基因或一种蛋白来控制和完成的,而是多个相关基因或蛋白的共同作用，这就需要将多个外源基因在同一细胞内共同表达。但是，质粒表达系统的容量是有限的，随着连接片段的长度增加，与载体的连接和转化受体菌的难度都进一步增加。而双质粒共表达系统是将不同的外源基因分别构建到不同的载体中去,然后通过2个质粒在宿主中的共同表达来实现，其可以容纳的外源基因长度大大增加。
植物乳杆菌是常用的益生菌乳酸菌株，其进行代谢背景清晰，目前已经有多项异源蛋白表达的相关研究。它不仅能够利用葡萄糖，还可以利用乳糖作为碳源进行良好生长。其乳糖代谢依赖于体内的β-半乳糖苷酶LacA和LacLM，其中LacA由基因lacA所编码，LacLM是由lacL和lacM基因编码蛋白所形成的异源二聚体。因此拟选择lacLM基因作为筛选标记，开发植物乳杆菌的双质粒食品级表达系统，为乳酸菌在功能性酸奶领域的研究提供一种有效安全的手段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，该套植物乳杆菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。
本发明的技术方案如下：
一株食品级宿主植物乳杆菌NZ0203的构建，包括如下步骤：
(1)提取植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对扩增基因lacA的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增基因lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
LacA-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTCCGTGGAATAAACCGGTTCA SEQ ID NO.1
LacA-up-R:TTAAGTGGGGTGAAATTAATGGCAC SEQ ID NO.2
LacA-down-F:GTGCCATTAATTTCACCCCACTTAATCAAACGCACCCTCACTTCT SEQ ID NO.3
LacA-down-R:agtggatcccccgggctgcagCACCCACGGCCAACGGAT SEQ ID NO.4
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3018bp目的产物的菌体即为lacA基因敲除菌株；
所得菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况稍为减弱；
LacA-test-F:TCAGAATGTCAGATGCAG SEQ ID NO.5
LacA-test-R:TTTACACACCGTGTTACC SEQ ID NO.6
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
(5)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的引物对扩增基因lacLM的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10的引物对扩增基因lacLM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacLM基因敲除连接臂；
LacLM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTTGTAATCGGCGTAATGCTTCTT SEQ ID NO.7
LacLM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTGAGGAAGCTCCTTTCAAAG SEQ ID NO.8
LacLM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.9
LacLM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.10
(6)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(5)中制得的lacLM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(7)将步骤(6)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12的引物对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3000bp目的产物即为同时敲除lacA和lacLM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ0203；
植物乳杆菌NZ0203在MRS-乳糖培养基失去生长能力。
LacLM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.11
LacLM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.12
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-down-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，lacA上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)或(6)验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中转化子的培养条件，转化子在含有5μg/mL红霉素的MRS平板上进行培养，温度为30℃。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)或(7)中MRS-乳糖培养基每升组分如下：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-test-F 2μL，引物LacA-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacLM上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacLM下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-down-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，lacLM上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-test-F 2μL，引物LacLM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
双质粒食品级表达载体pLP4180和pLP5120，核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示。
所述食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因。
所述食品级表达载体pLP5120包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制起点，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacL基因。
将合成的表达载体pLP4180和pLP5120转化入植物乳杆菌NZ0203后，其在MRS-乳糖培养基中的生长情况可以得到恢复。
根据本发明优选的，食品级表达载体pLP4180和pLP5120的序列由上海生工生物工程有限公司进行合成。
一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统，包含上述食品级宿主植物乳杆菌NZ0203和上述食品级表达载体pLP4180和pLP5120。
上述食品级植物乳杆菌表达系统中，植物乳杆菌WCFS1的lacM和lacL基因是食品级宿主植物乳杆菌NZ0203和食品级表达载体pLP4180以及pLP5120完成互补筛选的食品级标记；食品级宿主植物乳杆菌NZ0203是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacLM基因而获得，丧失乳糖利用的能力。
上述食品级植物乳杆菌表达系统生产的异源物在酸奶制备中的应用。
根据本发明优选的，所述食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达乳酸链球菌素合成基因簇的应用，包括以下步骤：
a利用核苷酸序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物对nis1-F和nis1-R进行PCR扩增乳酸链球菌素合成基因簇中的nisABTCI基因；
nis1-F:GCGCTCGAGATGAGTACAAAAGATTTTAAC； SEQ ID NO.15
nis1-R:GCGCTCGAGCTAGTTTCCTACCTTCGTTG； SEQ ID NO.16
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的引物对nis2-F和nis2-R进行PCR扩增乳酸链球菌素合成基因簇中的nisPRKFEG基因；
nis2-F:GCGCTCGAGGTGAAAAAAATACTAGGTTTC； SEQ ID NO.17
nis2-R:GCGCTCGAGTTATCTAATCTTTTTTTTAG； SEQ ID NO.18
b将步骤a制备的乳酸链球菌素合成基因簇中的nisABTCI基因插入食品级表达载体pLP4180多克隆位点，同时将步骤a制备的乳酸链球菌素合成基因簇中的nisPRKFEG基因插入食品级表达载体pLP5120多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ0203中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中乳酸链球菌素的含量控制发酵过程。
本发明的有益效果：
本发明涉及一种食品级植物乳杆菌表达系统，该系统具备食品级宿主植物乳杆菌NZ0203以及双质粒食品级表达载体pLP4180和pLP5120，且lacM和lacL基因是宿主和载体可以完成互补筛选的食品级标记，筛选压力只需更换MRS培养基中的碳源为乳糖，在外源基因的表达过程中无需添加抗生素，避免了因抗性因子转移带来的生物安全性的潜在危害，并且该系统在酸奶发酵中具有良好应用。
附图说明
图1：lacA基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片；
其中：左侧为Marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；
图2：lacLM基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片；
其中：左侧为Marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；
图3：载体pLP4180结构示意图；
其中：repA和repC为复制元件，Pldh为启动子和Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及lacM；
图4：载体pLP5120结构示意图；
其中：ori为复制起点，Pldh为启动子和Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及lacL；
图5：不同菌株在MRS-乳糖培养基中生长24小时OD值柱状图；
其中：WCFS1代表野生型菌株，ΔlacA代表lacA基因敲除菌株，NZ0203代表lacA基因、lacM和lacL基因敲除菌株，ΔlacM代表lacM基因敲除菌株，ΔlacL代表lacL基因敲除菌株，ΔlacA+ΔlacM代表lacA基因和lacM基因敲除菌株，ΔlacA+ΔlacL代表lacA基因和lacL基因敲除菌株，ΔlacM+ΔlacL代表lacL基因和lacM基因敲除菌株，NZ0203+pLP4180+pLP5120代表NZ0203菌株转入质粒pLP4180和pLP5120；
图6：代表性菌株在MRS-乳糖培养基中生长24小时发酵液图片；
其中：WCFS1代表野生型菌株，ΔlacA代表lacA基因敲除菌株，ΔlacL+ΔlacM代表lacL基因和lacM基因敲除菌株，NZ0203代表lacA基因、lacM和lacL基因敲除菌株，NZ0203+pLP4180+pLP5120代表NZ0203菌株转入质粒pLP4180和pLP5120。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
植物乳杆菌WCFS1：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
大肠杆菌XL-Blue1感受态细胞:购自北京全式金生物技术有限公司，普通市售已知菌株；
乳酸乳球菌：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
质粒pNZ8149：购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
细菌基因组提取试剂盒：购自北京天根生物科技有限公司；
柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：购自南京诺韦赞生物科技有限公司；
红霉素、琼脂糖、核酸染料等购自上海生工生物工程有限公司；
Ex taq及rtaq等聚合酶、限制性内切酶(PstI、XhoI)、T4DNA连接酶，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司提供；
实施例中所述的MRS-乳糖培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
实施例中所述的MRS平板，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，琼脂粉20.0g，余量水。
MRS液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
实施例1
食品级宿主植物乳杆菌NZ0203的构建，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌WCFS1接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；MRS培养基成分每升含有：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对LacA-up-F和LacA-up-R进行PCR扩增基因lacA的上游同源臂，
LacA-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTCCGTGGAATAAACCGGTTCA SEQ ID NO.1
LacA-up-R:TTAAGTGGGGTGAAATTAATGGCAC SEQ ID NO.2
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对LacA-down-F和LacA-down-R进行PCR扩增基因lacA的下游同源臂，
LacA-down-F:GTGCCATTAATTTCACCCCACTTAATCAAACGCACCCTCACTTCT SEQ ID NO.3
LacA-down-R:agtggatcccccgggctgcagCACCCACGGCCAACGGAT SEQ ID NO.4
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-down-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中，制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体管，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对第二次同源交换成功的菌株进行PCR检测，扩增出3018bp的目的产物即为lacA基因敲除菌株如图1，敲除lacA基因后，菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况稍微减弱(图5和图6)。
LacA-test-F:TCAGAATGTCAGATGCAG SEQ ID NO.5
LacA-test-R:TTTACACACCGTGTTACC SEQ ID NO.6
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-test-F 2μL，引物LacA-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(6)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的引物对LacLM-up-F和LacLM-up-R进行PCR扩增基因lacLM的上游同源臂，
LacLM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTTGTAATCGGCGTAATGCTTCTT SEQ ID NO.7
LacLM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTGAGGAAGCTCCTTTCAAAG SEQ ID NO.8
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对LacLM-down-F和LacLM-down-R进行PCR扩增基因lacLM的下游同源臂，
LacLM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.9
LacLM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.10
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-down-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacLM基因敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(7)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(6)制得的lacLM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒。
(8)将步骤(7)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。第一次同源交换菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点终于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基，30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12的引物对LacLM-test-F和LacLM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，扩增出3000bp的目的产物即为lacLM基因敲除菌株如图2。
LacLM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.11
LacLM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.12
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-test-F 2μL，引物LacLM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(9)最终获得同时敲除lacA和lacLM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ0203，植物乳杆菌NZ0203在MRS-乳糖培养基失去生长能力(图5和图6)。
实施例2
食品级表达载体pLP4180和pLP5120
食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因。其图谱如图3所示，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。食品级表达载体pLP5120包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制起点，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacL基因。其图谱如图4所示，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。将合成的表达载体pLP4180和pLP5120共转化入植物乳杆菌NZ0203后，其在MRS-乳糖培养基中的生长情况不仅可以得到恢复，其最终生物量比野生型还要高(图5和图6)。
实施例3
利用上述双质粒食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达乳酸链球菌素的应用
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物对nis1-F和nis1-R扩增乳酸链球菌素合成簇基因nisABTCI，扩增产物使用XhoI酶切，并将载体pLP4180使用XhoI酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶就进行连接；利用核苷酸序列为SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18的引物对nis2-F和nis2-R扩增乳酸链球菌素合成簇基因nisPRKFEG，扩增产物使用XhoI酶切，并将载体pLP5120使用XhoI酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶就进行连接。连接产物共转化植物乳杆菌NZ0203，转化子在MRS-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子以2％转接于牛奶中，42℃培养12小时后，测定发酵酸奶中乳酸链球菌素的含量，结果为180 IU/mL。
nis1-F:GCGCTCGAGATGAGTACAAAAGATTTTAAC； SEQ ID NO.15
nis1-R:GCGCTCGAGCTAGTTTCCTACCTTCGTTG； SEQ ID NO.16
nis2-F:GCGCTCGAGGTGAAAAAAATACTAGGTTTC； SEQ ID NO.17
nis2-R:GCGCTCGAGTTATCTAATCTTTTTTTTAG； SEQ ID NO.18
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物nis1-F 2μL，引物nis1-R 2μL，乳酸乳球菌基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物nis2-F 2μL，引物nis2-R 2μL，乳酸乳球菌基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸8min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例1
构建单质粒食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达乳酸链球菌素的应用
1)构建敲除lacA的植物乳杆菌，构建方法同实施例1的步骤(1)-步骤(5)获得lacA基因敲除菌株，检测该菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况。结果显示其在MRS-乳糖培养基中的生长最终获得的菌体量为野生型菌株的5/6，表明lacA基因对菌株利用乳糖的能力影响不显著(图5)。
2)以实施例1中步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacM-up-F和LacM-up-R扩增基因lacM的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-μp-F 2μL，引物LacM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacM-down-F和LacM-down-R扩增基因lacM的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-down-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGCACTTGTGGTCACCACAAACG SEQ ID NO.19
LacM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTTTATTTGTGTAAGCCATAATAATAT SEQ IDNO.20
LacM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.21
LacM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.22
3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤2)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacM-test-F和LacM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-test-F 2μL，引物LacM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3043bp大小的目的产物即为同时敲除lacA和lacM基因的菌株。敲除lacM基因后，菌株在MRS-乳糖培养基中不生长(图5)。
LacM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.23
LacM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.24
(6)构建食品级表达载体pLP4180，构建方法如实施例2中所述。载体pLP4180转化入敲除lacA和lacM基因的植物乳杆菌后，其在MRS-乳糖培养基中恢复生长。
(7)使用nis1-F和nis2-R扩增乳酸链球菌素合成基因簇，将其连接于载体pLP4180上后，所获得的载体转化植物乳杆菌失败，其原因可能是质粒太大。
对比例2
构建敲除lacM的植物乳杆菌，检测其在MRS-乳糖培养基中的生长的菌体量与野生型比较
1)以实施例1中步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacM-up-F和LacM-up-R扩增基因lacM的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-μp-F 2μL，引物LacM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacM-down-F和LacM-down-R扩增基因lacM的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-down-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-up-F 2μL，引物LacM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL，双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGCACTTGTGGTCACCACAAACG SEQ ID NO.19
LacM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTTTATTTGTGTAAGCCATAATAATAT SEQ IDNO.20
LacM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.21
LacM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.22
2)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤1)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(4)将步骤(3)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacM-test-F和LacM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacM-test-F 2μL，引物LacM-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3043bp大小的目的产物即为敲除lacM基因的菌株。敲除lacM基因的菌株在MRS-乳糖培养基中生长最终生物量为野生型的1/2(图5)。
LacM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.23
LacM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.24
对比例3
构建敲除lacL的植物乳杆菌，检测其在MRS-乳糖培养基中的生长的菌体量与野生型比较
1)以实施例1中步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacL-up-F和LacL-up-R扩增基因lacL的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-μp-F 2μL，引物LacL-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacL-down-F和LacL-down-R扩增基因lacL的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-down-F 2μL，引物LacL-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-up-F 2μL，引物LacL-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacL-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTTGTAATCGGCGTAATGCTTCTT SEQ ID NO.25
LacL-up-R:GTTGATTATTTGTGTAAGCCATGAGGAAGCTCCTTTCAAAG SEQ ID NO.26
LacL-down-F：ATGGCTTACACAAATAATCAAC SEQ ID NO.27
LacL-down-R:agtggatcccccgggctgcagAAATAACTCGCCGGAGCGTT SEQ ID NO.28
2)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤1)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。提取验证正确的转化子的质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(4)将步骤(3)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacL-test-F和LacL-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-test-F 2μL，引物LacL-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3041bp大小的目的产物即为敲除lacL基因的菌株。敲除lacL基因的菌株在MRS-乳糖培养基中生长最终生物量为野生型的1/2(图5)。
LacL-test-F:GCCATTCTAATTCCTCCT SEQ ID NO.29
LacL-test-R:GACGAGCCCAGATGAATT SEQ ID NO.30
对比例4
构建敲除lacA和lacL的植物乳杆菌，检测其在MRS-乳糖培养基中的生长的菌体量与野生型比较
1)构建敲除lacA的植物乳杆菌，构建方法同实施例1的步骤(1)-步骤(5)获得lacA基因敲除菌株，检测该菌株在MRS-乳糖培养基中的生长情况。结果显示其在MRS-乳糖培养基中的生长最终获得的菌体量为野生型菌株的5/6，表明lacA基因对菌株利用乳糖的能力影响不显著.
2)以实施例1中步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacL-up-F和LacL-up-R扩增基因lacL的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-μp-F 2μL，引物LacL-up-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacL-down-F和LacL-down-R扩增基因lacL的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-down-F 2μL，引物LacL-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-up-F 2μL，引物LacL-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacL-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTTGTAATCGGCGTAATGCTTCTT SEQ ID NO.25
LacL-up-R:GTTGATTATTTGTGTAAGCCATGAGGAAGCTCCTTTCAAAG SEQ ID NO.26
LacL-down-F：ATGGCTTACACAAATAATCAAC SEQ ID NO.27
LacL-down-R:agtggatcccccgggctgcagAAATAACTCGCCGGAGCGTT SEQ ID NO.28
3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤2)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacL-test-F和LacL-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacL-test-F 2μL，引物LacL-test-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3041bp大小的目的产物即为同时敲除lacA和lacL基因的菌株。敲除lacA和lacL基因的菌株在MRS-乳糖培养基中不再生长(图5)。
LacL-test-F:GCCATTCTAATTCCTCCT SEQ ID NO.29
LacL-test-R:GACGAGCCCAGATGAATT SEQ ID NO.30
对比例5
构建敲除lacM和lacL的植物乳杆菌，检测其在MRS-乳糖培养基中的生长的菌体量与野生型比较
1)以实施例1中步骤(1)的基因组DNA为模板，利用引物对LacLM-up-F和LacLM-up-R扩增基因lacLM的上游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-μp-F 2μL，引物LacLM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。利用引物对LacLM-down-F和LacLM-down-R扩增基因lacLM的下游同源臂，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-down-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，PCR扩增体系为：Ex taqbuffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
LacLM-up-F:ggtaccgggccccccctcgagTTGTAATCGGCGTAATGCTTCTT SEQ ID NO.7
LacLM-up-R:GTTCTTTTGAAATCAAAATAACTTGAGGAAGCTCCTTTCAAAG SEQ ID NO.8
LacLM-down-F：AAGTTATTTTGATTTCAAAAGAAC SEQ ID NO.9
LacLM-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTAGGCGTACCAGATCGTGGC SEQ ID NO.10
2)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤1)中连接的上下游同源臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。提取验证正确的转化子的质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基。30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换。42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(4)将步骤(3)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体管，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用引物对LacLM-test-F和LacLM-test-R对第二次同源交换成功的菌株进行检测，PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-test-F 2μL，引物LacLM-test-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸3min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。扩增出3000bp大小的目的产物即为敲除lacLM基因的菌株。敲除lacLM基因的菌株在MRS-乳糖培养基中生长最终生物量为野生型的1/2(图5和图6)。
LacLM-test-F:CGTATACCCTCAATCAAG SEQ ID NO.11
LacLM-test-R:GCTTGACTATGGGAATCA SEQ ID NO.12。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggtaccgggc cccccctcga gtccgtggaa taaaccggtt ca 42
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ttaagtgggg tgaaattaat ggcac 25
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gtgccattaa tttcacccca cttaatcaaa cgcaccctca cttct 45
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
agtggatccc ccgggctgca gcacccacgg ccaacggat 39
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
tcagaatgtc agatgcag 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
tttacacacc gtgttacc 18
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ggtaccgggc cccccctcga gttgtaatcg gcgtaatgct tctt 44
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
gttcttttga aatcaaaata acttgaggaa gctcctttca aag 43
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
aagttatttt gatttcaaaa gaac 24
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
agtggatccc ccgggctgca ggttaggcgt accagatcgt ggc 43
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
cgtataccct caatcaag 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
gcttgactat gggaatca 18
<210> 13
<211> 3505
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
aattcagcaa tttagccttg atttacaatc ataagcgtgt gtaataagaa tttactaaca 60
aaaattcaat tttttgaata atatctgttt acaaatcaga ttaggctata tataatattt 120
aaggattctc agtgatgggt gcgcgatttg gccttttcac taggatgtag tataatacta 180
actaaagaat tgttgagacc attttggcct cgacgttatt cttgcgaaaa tcacaggagg 240
tttcacatat gagatatctg cagggatcca tgcataccat cgatctcgag tgcatatttt 300
cggcaatctt ctcaatgaga tgctcttcag catgttcaat gatgtcgatt ttttattaaa 360
acgtctcaaa atcgtttctg agacgtttta gcgtttattt cgtttagtta tcggcataat 420
cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct ttgcagcgaa 480
gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc gcagcgtcct 540
tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa taaatcgttt ctgagacgtt 600
ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta 660
aaagcccttg agcgtagcgt ggctttgcag cgaagatgtt gtctgttaga ttatgaaagc 720
cgatgactga atgaaataat aagcgcagcg tccttctatt tcggttggag gaggctcaag 780
ggagtttgag ggaatgaaat tccctcatgg gtttgatttt aaaaattgct tgcaattttg 840
ccgagcggta gcgctggaaa atttttgaaa aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg 900
aaaggaagcg aattttgctt ccgtactacg accccccatt aagtgccgag tgccaatttt 960
tgtgccaaaa acgctctatc ccaactggct caagggtttg aggggttttt caatcgccaa 1020
cgaatcgcca acgttttcgc caacgttttt tataaatcta tatttaagta gctttatttt 1080
tgtttttatg attacaaagt gatacactaa ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt 1140
aaatggtgat ttcagaatcg aaaaaaagag ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata 1200
aaaaattaac agatatggcg aaacaaaaag atttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag 1260
ctatagaaga atatgcaaga aaggaatcag aacaaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt 1320
ttagaaggat acgagttttc gctacttgtt tttgataagg taattatatc atggctatta 1380
aaaatactaa agctagaaat tttggatttt tattatatcc tgactcaatt cctaatgatt 1440
ggaaagaaaa attagagagt ttgggcgtat ctatggctgt cagtccttta cacgatatgg 1500
acgaaaaaaa agataaagat acatggaata gtagtgatgt tatacgaaat ggaaagcact 1560
ataaaaaacc acactatcac gttatatata ttgcacgaaa tcctgtaaca atagaaagcg 1620
ttaggaacaa gattaagcga aaattgggga atagttcagt tgctcatgtt gagatacttg 1680
attatatcaa aggttcatat gaatatttga ctcatgaatc aaaggacgct attgctaaga 1740
ataaacatat atacgacaaa aaagatattt tgaacattaa tgattttgat attgaccgct 1800
atataacact tgatgaaagc caaaaaagag aattgaagaa tttactttta gatatagtgg 1860
atgactataa tttggtaaat acaaaagatt taatggcttt tattcgcctt aggggagcgg 1920
agtttggaat tttaaatacg aatgatgtaa aagatattgt ttcaacaaac tctagcgcct 1980
ttagattatg gtttgagggc aattatcagt gtggatatag agcaagttat gcaaaggttc 2040
ttgatgctga aacgggggaa ataaaatgac aaacaaagaa aaagagttat ttgctgaaaa 2100
tgaggaatta aaaaaagaaa ttaaggactt aaaagagcgt attgaaagat acagagaaat 2160
ggaagttgaa ttaagtacaa caatagattt attgagagga gggattattg aataaataaa 2220
agcccccctg acgaaagtcg aataagacct ttagaacaag atttggtaac gctttacaaa 2280
tttatcacgt tatcgattca aattcttctt atcgcccgtt gtcgttgtca gtagttgttg 2340
tcatttagtt aaagtttaac taaaacgaca tatacaaatt taatattttg ttttatgata 2400
attgtaagcg tttttattta tgtaactttg aaaggagctt cctcatggct tacacaaata 2460
atcaactaca cgttatttac ggcgacggga gtttaggact acagggggct aatttccact 2520
acctctttag ctacgaacgt ggcggacttg aatcactcgt cgtcaacgat aaagagtggc 2580
tctatcgtac acccacgccc atcttttggc gggcgacaac cgataatgat cacggtagcg 2640
gcttttcagt caaatccgca cagtggtacg cggccgataa gttctcaact tgtcaagata 2700
tcgaattgac ggttgacgac caaccagtca caccgttacc aatcgcgcca ctcaataaca 2760
aatacacgga tcacgaaatc gccacgaaag tctcactggc ttaccacttc gttaccacga 2820
ccgttcctag taccatcgtc acagtgactt atacggtgac agcagacggt cagatcaata 2880
tcgccaccca ttatagcggt cagtctgatt tgccagagct acccgcattt ggtctgcggt 2940
ttatcatacc aactaccgcg accggcttcg actataccgg tttgtccggt gagacttatc 3000
ctgaccggct ggccggcgca acgcacgggc gattccacgt tgacagtctg ccagtcacac 3060
catacttggt cccacaagaa tgcggcatgc acatgcaaac tgaacaagtg acagtaacgc 3120
gatcaacaac acaaaataac gctgaccacg acaacacacc gttcagtttg acatttagcc 3180
aagccgatgc accattcgcc ttcagctgcc ttccctatac cgccgctgaa ctagaaaacg 3240
caacgcacat ggaagaatta ccattagcac ggcgaacggt cttatcaatc tacggtgccg 3300
ttcgtggggt cggtggcatt gatagttggg gaacagacgt agaatcccca tatcatatcc 3360
ccgctgatca agacattgac ttcagcttta atattcattt ctaaaagtta ttttgatttc 3420
aaaagaacgc tccggcgagt tatttgccag agcgttcttt tagattaacg atgattaagt 3480
tttaatatgt ttaatggctg agctt 3505
<210> 14
<211> 3077
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
aattcagcaa tttagccttg atttacaatc ataagcgtgt gtaataagaa tttactaaca 60
aaaattcaat tttttgaata atatctgttt acaaatcaga ttaggctata tataatattt 120
aaggattctc agtgatgggt gcgcgatttg gccttttcac taggatgtag tataatacta 180
actaaagaat tgttgagacc attttggcct cgacgttatt cttgcgaaaa tcacaggagg 240
tttcacatat gagatatctg cagggatcca tgcataccat cgatctcgag tgcatatttt 300
cggcaatctt ctcaatgaga tgctcttcag catgttcaat gatgtcgatt ttttattaaa 360
acgtctcaaa atcgtttctg agacgtttta gcgtttattt cgtttagtta tcggcataat 420
cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct ttgcagcgaa 480
gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc gcagcgtcct 540
tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa taaatcgttt ctgagacgtt 600
ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta 660
aaagcccttg agcgtagcgt ggctttgcag cgaagatgtt gtctgttaga ttatgaaagc 720
cgatgactga atgaaataat aagcgcagcg tccttctatt tcggttggag gaggctcaag 780
ggagtttgag ggaatgaaat tccctcatgg gtttgatttt aaaaattgct tgcaattttg 840
ccgagcggta gcgctggaaa atttttgaaa aaaatttgga atttggaaaa aaataagacc 900
tttagaacaa gatttggtaa cgctttacaa atttatcacg ttatcgattc aaattcttct 960
tatcgcccgt tgtcgttgtc agtagttgtt gtcatttagt taaagtttaa ctaaaacgac 1020
atatacaaat ttaatatttt gttttatgat aattgtaagc gtttttattt atgtaacttt 1080
gaaaggagct tcctcatgca agctaatctt caatggttag atgacccaga agtcttccgg 1140
gtcaaccaat tacctgcaca tagtgatcac cattattatc acgacacagc agaattcaaa 1200
acgggtagtc gcttcatcaa gagtctcaat ggcgcttggc gttttaactt cgccaagaca 1260
ccggctgaac gcccagttga tttttatcaa cccgatttcg atgcaaccga ctttgatacg 1320
attcaagttc ccggtcatat tgaactagcc ggctatggtc aaattcaata cattaacacg 1380
ctatacccat gggaaggtaa aatttatcgt cgcccaccgt ataccctcaa tcaagatcaa 1440
ttaacaccag gcctattcag cgacgctgcg gacaacaccg tcggctcgta cctcaaaacc 1500
tttgatctcg acgatgcttt taaagggcaa cgtattatca ttcagttcca aggggtagaa 1560
gaagccctgt acgtctggtt aaatggccat tttattggct acgctgaaga tagtttcacc 1620
ccttcagaat ttgatttgac gccgtatatt caggaccaag gtaacgtttt agcggttcgg 1680
gtctacaaac gcagtactgc tgcctttatt gaagaccaag atatgttccg tttctctggt 1740
attttccgtg acgtcaatat actggcggag cctgccagcc atattactga tttggacatc 1800
cgaccagttc caaatgccaa tctcaaaagt ggtgagctca acatcactac taaagtaacc 1860
ggtgaaccag ccactttagc gctgaccgtt aaagaccatg acgggcgagt actgacgagt 1920
caaacgcaaa ccggtagtgg cagtgtaacc tttgatacca tgttattcga ccaactgcac 1980
ttgtggtcac cacaaacgcc gtatctctat caattgacaa ttgaagttta cgatgctgat 2040
cgccaactct tggaagtcat cccatatcag tttgggttcc ggacggtcga gctgcgcgat 2100
gacaaagtca tttacgtcaa caataaacgg ttggtgatca acggggttaa ccggcacgaa 2160
tggaacgccc acaccggtcg cgttatcagt atggatgata tgcgcgctga tatccaaacc 2220
atgttagcta acaatatcaa tgccgatcgg acctgccatt atcctgatca attaccttgg 2280
tatcaattat gtgacgaggc cggtatctac ctaatggccg aaaacaacct cgaatcgcac 2340
gggtcatggc aaaagatggg tgctatcgag ccttcttaca atgttcctgg cgataatcca 2400
cactggttag cagcggtgat cgaccgggcc cgttcgaact acgaatggtt taaaaaccac 2460
ccatcgatca ttttttggtc acttggcaat gaatcgtatg ctggcgaaga tatcgcggcg 2520
atgcaggctt tttataaaga acacgatgat tcacgactcg tccactacga aggtgttgtc 2580
cacacaccag aattaaaaga tcgcatttct gatgttgaaa gtcggatgta cgaaaagccc 2640
caaaatattg tagcttactt ggaagataac ccaaccaaac ctttcctaga ttgtgaatat 2700
atgcatgaca tggggaattc tctgggcggt atgcaatcat ataatgattt gatcgacaag 2760
tatccgatgt atcaaggtgg ctttatttgg gactttattg atcaagccct cttcgttcat 2820
gacccaatta ccgaccaaga cgtgctccgg tatggcggtg atttcgacga acgccactcc 2880
gattatgaat tctccggtga cggcttaatg tttgccgacc ggacaccaaa accagcaatg 2940
caagaggtga aatattatta tggcttacac aaataaaagt tattttgatt tcaaaagaac 3000
gctccggcga gttatttgcc agagcgttct tttagattaa cgatgattaa gttttaatat 3060
gtttaatggc tgagctt 3077
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
gcgctcgaga tgagtacaaa agattttaac 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
gcgctcgagc tagtttccta ccttcgttg 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
gcgctcgagg tgaaaaaaat actaggtttc 30
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
gcgctcgagt tatctaatct tttttttag 29
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
ggtaccgggc cccccctcga ggcacttgtg gtcaccacaa acg 43
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
gttcttttga aatcaaaata acttttattt gtgtaagcca taataatat 49
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
aagttatttt gatttcaaaa gaac 24
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
agtggatccc ccgggctgca ggttaggcgt accagatcgt ggc 43
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 23
cgtataccct caatcaag 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 24
gcttgactat gggaatca 18
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 25
ggtaccgggc cccccctcga gttgtaatcg gcgtaatgct tctt 44
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 26
gttgattatt tgtgtaagcc atgaggaagc tcctttcaaa g 41
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 27
atggcttaca caaataatca ac 22
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 28
agtggatccc ccgggctgca gaaataactc gccggagcgt t 41
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 29
gccattctaa ttcctcct 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 30
gacgagccca gatgaatt 18

Claims (9)

1.一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)一株食品级宿主植物乳杆菌NZ0203的构建方法，包 括如下步骤：
①提取植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)的基因组DNA；
②以步骤①的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对扩增基因lacA的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增基因lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；
③使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤②中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
④将步骤③得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3018bp目的产物的菌体即为lacA基因敲除菌株；
⑤以步骤①获得的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物对扩增基因lacLM的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对扩增基因lacLM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacLM基因敲除连接臂；
⑥使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤⑤中制得的lacLM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
⑦将步骤⑥得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3000bp目的产物即为同时敲除lacA和lacLM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ0203，丧失乳糖利用的能力；
(2)将双质粒食品级表达载体pLP4180和pLP5120转化到步骤(1)构建的植物乳杆菌NZ0203中，所述表达载体pLP4180和pLP5120的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
2.如权利要求1所述一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤②中，lacA上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-up-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，lacA下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-down-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，lacA上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacA-up-F 2μL，引物LacA-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
3.如权利要求1所述一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤③或⑥验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
4.如权利要求1所述一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中转化子的培养条件，转化子在含有5μg/mL红霉素的MRS平板上进行培养，温度为30℃。
5.如权利要求1所述一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
6.如权利要求1所述一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④或⑦中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的MRS液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的MRS液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换；
所述步骤④或⑦中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的MRS平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加5μg/mL红霉素的MRS平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株；
所述步骤④或⑦中MRS-乳糖培养基每升组分如下：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水；
所述步骤⑤中，lacLM上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑤中，lacLM下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-down-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤⑤中，lacLM上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物LacLM-up-F 2μL，引物LacLM-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
7.权利要求1构建的一种双质粒食品级植物乳杆菌表达系统，其特征在于，包含食品级宿主植物乳杆菌NZ0203以及食品级表达载体pLP4180和pLP5120。
8.权利要求7所述双质粒食品级植物乳杆菌表达系统在生产用于酸奶制备的异源物中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述双质粒食品级植物乳杆菌表达系统在制备酸奶过程中表达乳酸链球菌素的应用，包括以下步骤：
a利用核苷酸序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物对nis1-F和nis1-R进行PCR扩增乳酸链球菌素合成基因簇中的nisABTCI基因；
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的引物对nis2-F和nis2-R进行PCR扩增乳酸链球菌素合成基因簇中的nisPRKFEG基因；
b将步骤a制备的乳酸链球菌素合成基因簇中的nisABTCI基因插入食品级表达载体pLP4180多克隆位点，同时将步骤a制备的乳酸链球菌素合成基因簇中的nisPRKFEG基因插入食品级表达载体pLP5120多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ0203中，筛选，制得转化子；
c将步骤b制得的转化子接种于牛奶中，通过检测发酵酸奶中乳酸链球菌素的含量控制发酵过程。
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