CN116536231A - 一种减少乙酸生成的大肠杆菌色氨酸合成菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减少乙酸生成的大肠杆菌色氨酸合成菌株，属于微生物技术领域。本发明在大肠杆菌W3110中建立T7表达系统，利用T7启动子控制色氨酸合成途径的相关的关键基因表达，得到无质粒无抗性的工程菌株，进一步通过ARTP诱变筛选，得到可高葡萄糖浓度下生产色氨酸且乙酸积累量低的大肠杆菌，在摇瓶水平发酵24h的色氨酸产量可达6.7g/L，乙酸积累量为0。

Description

一种减少乙酸生成的大肠杆菌色氨酸合成菌株
技术领域
本发明涉及一种减少乙酸生成的大肠杆菌色氨酸合成菌株，属于生物技术领域。
背景技术
大肠杆菌(Esherichia coli)具有生长快、培养成本低廉、遗传背景清楚、易实现高密度培养等优点，是目前多种氨基酸发酵使用最为广泛的菌株。然而在大肠杆菌生产氨基酸的过程中，补糖速率的快慢往往决定了发酵的成败，其主要原因在于大肠杆菌发酵过程过快的补糖会引起乙酸的产生。一般而言，乙酸在发酵培养基中超过2g/L会对大肠杆菌的生长造成非常大的影响，导致菌株生长的抑制和产物合成的抑制(参考文献：①De Mey,M.,De Maeseneire,S.,Soetaert,W.et al.Minimizing acetate formation in E.colifermentations.J Ind Microbiol Biotechnol 34,689–700(2007).https://doi.org/10.1007/s10295-007-0244-2；②程立坤,黄静,秦永锋,等.代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响[J].微生物学通报,2010,37(2):166-173.)。
色氨酸与谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸并称四大氨基酸，是四大氨基酸中体量最小但附加值相对较高的氨基酸，主要用作饲料添加剂。色氨酸可参与动物体内血浆蛋白质的更新，并可促使核黄素发挥作用，还有助于烟酸及血红素的合成，可显著增加怀孕动物胎仔体内抗体，对泌乳期的乳牛和母猪有促进泌乳作用。当畜禽缺乏色氨酸时，生长停滞，体重下降，脂肪积累降低，种公畜睾丸萎缩。目前色氨酸主要采用大肠杆菌发酵进行生产。
目前工业上色氨酸发酵过程中面临的问题：1)发酵过程中容易产乙酸，乙酸中毒导致发酵转化率低，需要通过控制补糖速度和残糖进行乙酸的控制(参考文献：③程立坤,赵春光,黄静,等.葡萄糖浓度对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响[J].食品与发酵工业,2010,36(3):5-9.)；2)目前菌株基本为带抗性带质粒菌株，质粒的存在会导致发酵过程中容易出现质粒丢失，抗性基因的存在可能会最终有抗性基因的残留，增加了饲料添加剂注册及产品质量要求的风险。
因此解决发酵过程中质粒丢失，提高发酵过程遗传稳定性，去除菌株中的抗性基因，简化补糖控制减少发酵过程中的乙酸积累对于色氨酸的发酵提升非常重要。
发明内容
本发明提供了一种大肠杆菌，在大肠杆菌W3110的基因组上tnaA位点整合了T7RNA聚合酶基因，并通过T7启动子调控trpEfbrDBCA、aroF、serA、tktA、ppsA中的一个或多个基因表达。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌是在大肠杆菌W3110的基础上，进行了如下至少一种改进：
(1)在trpE位点整合表达trpEfbr；
(2)在trpR位点整合表达DAHP合酶基因aroFfbr和磷酸甘油脱氢酶基因serA；
(3)在tnaB位点整合表达转酮酶A基因tktA和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA。
在一种实施方式中，用SEQ ID NO.1所示的调控元件替换trpE原有的衰减子和启动子。
在一种实施方式中，所述aroFfbr和tktA上游具有T7启动子。
在一种实施方式中，所述aroFfbr和serA基因之间具有SEQ ID NO.2所示的间隔序列。
在一种实施方式中，所述tktA和ppsA基因之间具有SEQ ID NO.3所示的间隔序列。
在一种实施方式中，所述trpEfbr具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述aroFfbr具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；所述serA具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述ppsA具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
本发明还提供了在所述大肠杆菌的基础上经过ARTP诱变获得的不积累乙酸的大肠杆菌Trp429E，分类命名为Escherichia coli Trp429E，已于2023年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023039，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明还提供了所述大肠杆菌在生产色氨酸中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述菌株以葡萄糖为碳源，发酵生产色氨酸。
在一种实施方式中，所述葡萄糖的浓度≥30g/L。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、酵母提取物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁。
在一种实施方式中，所述发酵是在30～37℃发酵至少24h。
本发明还要求保护所述大肠杆菌，或所述方法在生产色氨酸或含色氨酸的产品中的应用。
有益效果：
(1)本发明通过在大肠杆菌W3110中建立T7表达系统，利用T7启动子控制色氨酸合成途径的相关的关键基因的整合表达，构建了无质粒无抗性且色氨酸产量提高的工程菌株。
(2)本发明在构建的大肠杆菌工程菌的基础上，通过ARTP诱变技术，筛选获得了色氨酸产量提升且在高葡萄糖浓度下乙酸量低的大肠杆菌，使摇瓶水平发酵24h的色氨酸产量达6.7g/L，乙酸积累量为0。
生物材料保藏
大肠杆菌(Escherichia coli)Trp429E，分类命名为Escherichia coli Trp429E，已于2023年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023039，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1为菌株Trp429摇瓶发酵曲线。
图2为菌株Trp429E摇瓶发酵曲线。
具体实施方式
表1基因来源表
基因 NCBI号 基因位置
T7 RNA聚合酶基因 NC_012892 749861-753066
serA CP017979 2965455-2966687
aroF CP017979 2648357-2649427
ppsA CP017979 1689839-1692217
tktA CP017979 2987921-2989912
tnaA CP017979 3641215-3642629
tnaB CP017979 3640789-3641124
trpR CP017979 4532219-4532545
trpEDCBA CP017979 1243246-1249776
实施例1：T7表达系统在E.coli W3110中的构建
大肠杆菌CRISPR-Cas9系统由两个基本质粒pCas-lac和pTargetF组成，两个质粒根据文献《Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System》中的方法进行特定整合位点基因编辑质粒的构建。
为了获得T7RNA聚合酶表达序列，从E.coli BL21(DE3)的基因组DNA上进行PCR扩增获得该表达盒，BL21(DE3)基因组参考序列如NCBI：NC_012892序列所示。
T7RNA聚合酶在W3110上的整合位点选择tnaA位点。tnaA是色氨酸酶，具有降解色氨酸的作用，将T7 RNA聚合酶插入到该基因位置，既可以满足T7RNA聚合酶的表达目的，也可以破坏tnaA基因，促使色氨酸的积累。tnaA上下游同源臂的扩增及N20位点的选择参考W3110在NCBI上的序列NCBI：CP017979。
含T7 RNA聚合酶基因的donor DNA扩增：以提取的大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，以Primer 1和Primer 2为引物，扩增出670bp大小的tnaA上游同源臂；以Primer 5和Primer 6为引物，扩增出548bp大小的下游同源臂。以提取的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，Primer 3和Primer 4为引物，扩增出3247bp大小的T7 RNA聚合酶表达盒。PCR采用Takata PrimerSTAR MAX DNA Polymerase试剂盒，按说明书进行。上述三个分别扩增的片段继续DNA凝胶回收，对回收的PCR产物分别取1μL进行混合作为混合模板，采用Primer1和Primer 6进行融合PCR得到4424bp大小的融合PCR产物，即为本发明所用的含T7 RNA聚合酶基因的donor DNA。
PTargetF-tnaA-N20载体的构建：以pTargetF质粒为模板，用引物对Primer 7和Primer 8进行扩增，引物中含有靶向tnaA的N20序列atgcaggctgcgatgatgcg；然后PCR产物采用上海生工的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit对PCR产物进行环化，将环化产物转化大肠杆菌E.coli Top10感受态，采用含有50ug/mL壮观霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽取质粒获得pTargetF-tnaA-N20。
本实施例构建所需要的引物和基因组模板如表2所列。
表2引物及基因信息
根据文献《Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9 System》所述的基因编辑方法如下：
(1)W3110-pCas-lac电转化感受态细胞的制备
①将pCas-lac质粒采用CaCl2法转化到E.coli W3110，命名为W3110-pCas-lac。
②将含pCas-lac质粒的W3110-pCas-lac大肠杆菌接种到液体LB(含卡那霉素终浓度为50ug/ml)培养基中，30℃、250rpm培养至OD600 0.4～0.6。
③以1％的接种量接种于装有100mL LB(含卡那霉素终浓度为50ug/ml)培养基的500mL三角瓶中，30℃、200rpm条件培养至OD600为0.2～0.3时，加入终浓度为10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导剂，诱导pCas-lac上的λ-Red重组酶充分表达，OD600为0.5～0.7时停止培养。
④在超净台内将培养液转移到50mL无菌离心管中，在冰中放置10min；将离心管中的菌液4℃、4000r/min离心10min；弃上清，加入少量预冷的10％甘油温柔重悬菌体，继续添加10％甘油至离心管体积的三分之二处，4℃、4000r/min离心10min。重复一次上述操作。
⑤将菌体悬浮于1mL预冷的10％甘油中，按每管80μL感受态细胞分装于1.5mL离心管中，冰上放置备用。
(2)T7 RNA聚合酶基因的donor DNA和PTargetF-tnaA-N20的电转化
①将待转化的PTargetF-tnaA-N20 100ng，donor DNA 100ng加入到W3110-pCas-lac电转化感受态细胞中，温柔混合均匀，冰上放置30min。
②将混合物转入预冷的2mm电转杯中，放置冰上待电转。电转参数设定为2.5kv。
③电击后立即加入常温LB培养基悬浮细胞，30℃复苏2h，涂布50ug/mL卡那霉素+50ug/ml壮观霉素(pTarget质粒上的抗性筛选)LB平板，30℃培养过夜。挑取板长出的阳性克隆子。
(3)敲除质粒的消除
①pTarget质粒的消除：将验证正确的基因编辑克隆子接种至5ml LB培养基(含卡那霉素终浓度为50ug/ml)加入终浓度为0.5mM IPTG诱导质粒pCas-lac质粒上gRNA的转录，30℃培养12-16小时，稀释涂布终浓度为50ug/mL卡那霉素LB平板；分离的单菌落依次在含终浓度为50ug/mL卡那霉素平板、含终浓度为50ug/mL壮观霉素及卡那霉素双抗平板上影印筛选，平板于30℃培养。其中不在壮观霉素及卡那霉素双抗平板生长，而在卡那霉素平板生长的单菌落为消除Target质粒但保留了pCAS-lac质粒的菌株命名为Trp119-pCas-lac，将该菌株接种至LB培养基，不加任何抗生素37℃过夜培养，稀释后涂布于LB平板，37℃培养。分离的单菌落依次在不含任何抗生素的LB平板(37℃培养)、含终浓度为50ug/mL卡那霉素LB平板(30℃培养)影印筛选。挑取不在卡那霉素LB平板生长而对应在LB平板生长的单菌落，此单菌落为消除基础质粒pCas-lac的菌株，命名为Trp119。
实施例2T7启动子驱动trpEDBCA、aroF、serA、tktA、ppsA的表达
(1)T7启动子驱动trpEDBCA基因簇的表达
在实施例1构建的菌株Trp119中，色氨酸合成途径为天然合成途径，该途径在转录和翻译水平受到trpE上游调控区由启动子、操纵基因和长度为162bp的前导序列的调控，trpE在酶活水平受到色氨酸的反馈抑制。
本发明通过T7启动子驱动抗反馈抑制的trpEfbr(SEQ ID NO.4所示)进行表达，以替换基因组上原衰减子、启动子及trpE基因，达到trpEDBCA高效表达的目的。其中原启动子衰减子区域trpE基因的起始密码子上游162bp用以下含有T7启动子及RBS的序列替代：TAATACGACTCACTATAGGTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC(SEQ ID NO.1所示)。其中trpE的改变在于在其第40位ser氨基酸突变为Arg氨基酸(参考文献：《Identification of Amino AcidResidues Involved in Feedback Inhibition of the Anthranilate Synthase inEscherichia coli》)，突变后的trpE为trpEfbr具有抵抗色氨酸抑制的特性。
pT7-trpEfbrdonor DNA的PCR扩增：采用如表3所示Primer 9和Primer 10，Primer11和Primer 12，Primer 13和Primer 14分别扩增出相应的DNA片段，分别进行电泳切胶回收，对回收的PCR产物分别取1μL进行混合作为混合模板，采用Primer 9和Primer 14进行融合PCR扩增，得到1381bp大小的donor DNA。
PTargetF-trpE-N20载体的构建：以pTargetF质粒为模板，Primer 15和Primer 16为引物对进行扩增，引物中含有靶向trpE的N20序列gtatctgattgctttacgca；然后PCR产物采用上海生工的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit对PCR产物进行环化，将环化产物转化大肠杆菌E.coli Top10感受态，采用含有50ug/mL壮观霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽取质粒获得pTargetF-trpE-N20。
表3引物及序列信息
按照实施例1的基因编辑方法，对构建的Trp119-pCas-lac菌株中的trpE基因区域进行基因编辑，得到含有pCas-lac的菌株Trp322-pCas-lac及不含质粒的菌株Trp322。
(2)T7启动子驱动下的aroFfbr-serA的共表达，插入到trpR位置
为进一步前体供应，本发明设计了pT7-aroFfbr-serA表达盒以增加莽草酸途径和丝氨酸途径。其中aroFfbr为W3110来源，其第148位Pro突变为Leu，具有抵抗酪氨酸反抗抑制能力。aroFfbr和serA共表达，两基因中间加入带RBS的间隔序列ATAAAGGAGGATTACACT(SEQID NO.2)。插入位置选择trpR，整合aroFfbr-serA时同时可破坏trpR基因，解除其对色氨酸合成途径的抑制。
pT7-aroFfbr-serA donor DNA的PCR扩增：采用如下表4中Primer 17到Primer 28的6对引物，及所对应的模板DNA，分别扩增出对应DNA片段，并分别切胶回收纯化，对获得的6个DNA片段各取0.5μL进行混合作为混合模板，采用Primer 17和Primer 28进行融合PCR扩增，得到3333bp大小的donor DNA。
pTargetF-trpR-N20载体的构建：以pTargetF质粒为模板，Primer 29和Primer 30为引物对进行扩增，引物中含有靶向trpR的N20序列attgtcgaagagctgttgcg；然后PCR产物采用上海生工的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit对PCR产物进行环化，将环化产物转化大肠杆菌E.coli Top10感受态，采用含有50ug/mL壮观霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽取质粒获得pTargetF-trpR-N20。
表4引物及序列信息
按照实施例1的基因编辑方法，对Trp322-pCas-lac菌株中的trpR基因区域进行基因编辑，得到含有pCas-lac的菌株Trp412-pCas-lac及不含质粒的菌株Trp412。
(3)T7启动子驱动下的tktA-PPSA的共表达，插入到tnaB位置。
为进一步优化代谢通路，设计pT7-tktA-ppsA表达盒以增加4-磷酸赤藓糖的供应。其中tktA和ppsA基因都来源于W3110，两基因中间加入带RBS的间隔序列ATAAAGGAGGATTACACT(SEQ ID NO.3)。将pT7-tktA-ppsA插入tnaB所在位置，使整合表达盒的同时破坏tnaB基因，减少细胞对胞外色氨酸的运输和降解。具体步骤如下：
pT7-tktA-ppsA donor DNA的PCR扩增：采用如表5中Primer 19到Primer 38的5对引物，及所对应的模板DNA，分别扩增出对应DNA片段，并分别切胶回收纯化，对获得的5个DNA片段各取0.5μL进行混合作为混合模板，采用Primer 31和Primer 38进行融合PCR扩增，得到5496bp大小的donor DNA。
pTargetF-tnaB-N20载体的构建：以pTargetF质粒为模板，Primer 39和Primer 40为引物对进行扩增，引物中含有靶向tnaB的N20序列tgcttctaataacaataacc；然后PCR产物采用上海生工的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit对PCR产物进行环化，将环化产物转化大肠杆菌E.coli Top10感受态，采用含有50ug/mL壮观霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽取质粒获得pTargetF-tnaB-N20。
表5引物及序列信息
按照实施例1的基因编辑方法，对Trp412-pCas-lac菌株中的tnaB基因区域进行基因编辑，得到含有pCas-lac的菌株Trp429-pCas-lac及不含质粒的菌株Trp429。
实施例3：菌株摇瓶发酵生产色氨酸
为了考察T7RNA聚合酶对细胞生长的影响，以及改造后工程菌的效果，对原始菌W3110，工程菌Trp119、Trp322、Trp412、Trp429进行考察，测定上述菌株在相同条件下的色氨酸产量，生物量OD600和乙酸产量。
摇瓶发酵培养基(按终浓度计)：磷酸氢二钾24g/L、磷酸二氢钾10.0g/L、酵母提取物8g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖40g/L、硫酸镁10g/L。
发酵条件：从-80℃甘油管取100μL菌液接种到LB培养基中35℃培养过夜，获得种子液；将种子液按1ml转接到250ml三角瓶装50ml培养基中，使接种后的OD达2.0～2.5，于200-220rpm，35℃培养24小时，测色氨酸产量、生物量和乙酸含量。
表6不同菌株摇瓶发酵效果
菌株 Trp产量g/L 生物量OD600 乙酸含量g/L
W3110 0 12.03 10
Trp119 0 11.25 10.45
Trp322 0.23 12.53 11.32
Trp412 1.41 12.11 10.10
Trp429 3.22 12.32 10.66
从表6的色氨酸产量上看，T7表达系统能很好地在W3110中发挥作用。菌种改造可以有效提高摇瓶发酵的产量。但由于发酵摇瓶中葡萄糖含量较高，菌株在发酵过程中极容易产生乙酸，且改造未改造的菌株在产乙酸方面无明显区别，乙酸的积累导致细胞在发酵过程中生长受到抑制，改造和未改造菌株的生物量都较低。
实施例4：耐高糖低产乙酸的大肠杆菌的诱变筛选
基于实施例3改造过后的菌株在较高糖含量下出现了产乙酸严重的现象，以Trp429为出发菌，经过常压室温等离子(atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP)诱变处理，再经过高糖培养基在自适应进化设备中进行连续培养，获得低乙酸生成的菌株。
摇瓶发酵培养基(按终浓度计)：磷酸氢二钾24g/L、磷酸二氢钾10.0g/L、酵母提取物8g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖40g/L、硫酸镁10g/L。
ARTP诱变处理方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于LB培养基中，220r/min、35℃摇床培养6h，取4mL种子液于5mL EP管，4000rpm离心，去除上清液，加入1mL生理盐水，混匀，将菌悬液稀释，使菌悬液OD600为0.5-0.8；取10uL涂布诱变处理载样片，采用40s ARTP诱变处理，处理完立即用生理盐水将载样片上的菌体洗脱制成诱变菌株母液。
筛选条件：将诱变后的母液转接到LB培养基中进行活化培养2h，然后采用全自动高通量微生物液滴培养仪(Microbial Microdroplet Culture system,MMC，无锡源清天木生物科技有限公司)进行耐糖的自适应进化。理论上而言，低产乙酸的突变株在高糖下将会有更高的生物量。
正突变的筛选：将MMC中长势较好的液滴导出并进行适当的稀释，涂布于LB平板进行单菌落的筛选。挑选288个单克隆到含有摇瓶发酵培养基的96孔板中进行复筛，筛选出OD600较高的10个克隆，分别命名为Trp429A、Trp429B、Trp429C、Trp429D、Trp429E、Trp429F、Trp429G、Trp429H、Trp429I、Trp429J。对复筛选出来的10个菌株进行摇瓶发酵的进一步确认。摇瓶发酵培养基和摇瓶发酵条件与实施例3相同，以Trp429作为ck对照，培养24小时后结果如表7所示。
表7不同诱变菌株的摇瓶发酵效果
菌株 Trp产量(g/L) OD600 乙酸含量(g/L)
Trp429A 3.54 30.3 0
Trp429B 1.04 30.6 0
Trp429C 6.16 27.8 0
Trp429D 5.54 27.9 0
Trp429E 6.51 26.8 0
Trp429F 1.44 25.7 1.23
Trp429G 6.22 25.3 0
Trp429H 5.91 28.8 0
Trp429I 3.22 25.4 0
Trp429J 6.38 27.7 0
Trp429(ck) 3.12 11.3 10.66
从摇瓶复筛结果看，筛选得到的菌株生物量都大幅提高，乙酸产量明显下降，多数不再积累乙酸。多数菌株的色氨酸产量大幅度提升，说明葡萄糖转向了产品合成和生物量的积累。
对筛选到的最优菌株Trp429E进行摇瓶发酵过程的跟踪，以出发菌trp429作为对照，每4h进行一次取样测定残糖，OD600，色氨酸产量及乙酸含量，发现在开始阶段Trp429E相对于trp429菌株生长速度较慢，但整个过程不会持续积累乙酸，最终生物量及效价都较高，Trp429E在摇瓶中的效价达到了6.7g/L，糖酸转化率达到了16.75％。
表8菌株Trp429和Trp429E发酵效果对比
注：“N.D.”表示未检测到。
为考察Trp429E的传代稳定性，按照实施例3的摇瓶方式进行传代考察。从-80℃甘油管取100μL菌液接种到LB培养基中35℃培养过夜，获得种子液；将1mL种子液转接到250ml装液量50mL的三角瓶中，200-220rpm，35℃培养12h后，再取100μL转接，连续传代5次后，将细胞采用本实施例的摇瓶配方进行摇瓶发酵实验。结果经过24h的培养，其OD600为25.68，色氨酸产量6.81g/L，无乙酸积累，说明该菌株遗传稳定性较好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌W3110的基因组上tnaA位点整合了T7 RNA聚合酶基因，并通过T7启动子调控trpEfbrDBCA、aroF、serA、tktA、ppsA中的一个或多个基因表达。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，还进行了如下改进：
(1)在trpE位点整合基因trpEfbr；
(2)在trpR位点整合DAHP合酶基因aroFfbr和磷酸甘油脱氢酶基因serA；
(3)在tnaB位点整合转酮酶A基因tktA和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，在trpE位点整合基因trpEfbr，并用SEQID NO.1所示的调控元件替换trpE基因原有的衰减子和启动子。
4.根据权利要求1～3任一所述的大肠杆菌，其特征在于，所述基因aroFfbr和基因serA之间具有SEQ ID NO.2所示的间隔序列。
5.根据权利要求1～4任一所述大肠杆菌，其特征在于，所述基因tktA和基因ppsA之间具有SEQ ID NO.3所示的间隔序列。
6.一株不积累乙酸的大肠杆菌，已于2023年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023039。
7.一种发酵生产色氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～6任一所述的大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的培养基中发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基中葡萄糖的浓度≥30g/L。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵是在30～37℃发酵至少24h。
10.权利要求1～6任一所述的大肠杆菌或权利要求7～9任一所述方法在生产色氨酸或含色氨酸的产品中的应用。
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