CN115948402A - 产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及代谢工程和微生物发酵领域,具体涉及产5‑氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用。本发明公开了一种新的5‑氨基乙酰丙酸生产菌株,所述5‑氨基乙酰丙酸生产菌株通过协同表达来源于希瓦氏菌的5‑氨基乙酰丙酸生产模块基因(hemA、hemL和gltX)、来源于大肠杆菌的抗氧化模块基因(katE、sodB),并导入抑制模块(所述抑制基因为hemB2和sucA)对希瓦氏菌进行模块化改造,使其能够高效生产5‑氨基乙酰丙酸,最高能使5‑氨基乙酰丙酸产量较原菌株提升134.0倍。
Description
技术领域
本发明涉及代谢工程和微生物发酵领域,具体涉及产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称5-ALA)是一种功能性非蛋白质类氨基酸,广泛存在于细菌、动植物的细胞中,是合成四吡咯化合物如血红素、微生物B12等的必要前体。由于其在癌症诊断和治疗、促进作物生长以及提高牲畜免疫力等方面都发挥着重要作用,因此被广泛应用于医药、农业、水产养殖、化工等领域,市场需求规模极大且呈现逐年急速增加的趋势。
目前,5-ALA主要通过化学合成法生产,然而化学反应合成步骤繁杂、副产物多、分离提纯困难、原材料价格高昂且毒性较高等问题限制了化学合成法工业化生产的规模,阻碍了5-ALA在各领域中的推广应用。生物法由于其简单、绿色环保的生产工艺以及低廉的生产成本备受人们青睐。目前5-ALA生物合成途径主要有C4途径和C5途径,分别以琥珀酰辅酶A、甘氨酸及谷氨酸为底物,通过一步酶促(5-ALA合成酶,ALAS)或三步酶促反应(谷氨酰-tRNA合成酶GluRS、谷氨酰-tRNA还原酶GluTR和谷氨醛氨基转移酶GSA-AM)催化合成5-ALA。C4途径虽然合成途径更短,但依赖甘氨酸的外源添加,生产产本较高,而C5途径有着更为明显的底物优势。利用C5途径进行5-ALA生物合成有望建立廉价的原料路线,从而降低生产成本。
5-ALA的高效生产依赖底盘微生物、关键酶的选择以及微生物代谢流的调控。但目前使用C5途径进行5-ALA生物合成的底盘微生物和关键酶基因选择有限,现有的研究中底盘微生物主要为大肠杆菌(CN114381416A、CN104004701A),而关键酶基因GluTR则主要来源于大肠杆菌和伤寒沙门氏菌。并且调控方式主要是通过增强5-ALA合成路径基因表达或是增强5-ALA外排能力等,缺乏多模块化改造。
因此,本领域需要开发新的5-氨基乙酰丙酸的高产菌株以及关键酶基因,从而能够拓宽底盘微生物和关键酶选择范围,并且需要对所述底盘微生物代谢流进行多维模块化改造,从而更好的进行5-氨基乙酰丙酸的高效生产。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用。
本发明提供了干扰5-ALA脱水酶基因和/或α-酮戊二酸脱氢酶基因表达的核酸,其具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
本发明所述的编码重组抗原的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中,所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列,如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分,或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得,或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
进一步的,本发明提供了重组载体,其包括载体骨架和本发明所述的核酸。
本发明所述载体骨架的来源包括但不限于原核载体,所述的原核载体包括p15a、pET28a、pUC18或pUC19等。在本发明的一些具体实施例中,本发明以p15a和pYYDT为载体骨架与本发明所述的核酸进行重组,构成本发明所述的重组载体。
进一步的,本发明所述重组载体,是指重组的核酸载体,是一种重组DNA分子,其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式动物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子,核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子,增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主,载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用,或者,在一些情况下,自己整合进入基因组。在本说明书中,“质粒”和“载体”有时可以交换通用,因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。
本发明提供了所述的核酸或所述的重组载体在降低菌株5-ALA脱水酶基因和α-酮戊二酸脱氢酶基因表达中的应用。
本发明提供了生产5-氨基乙酰丙酸的菌株,其5-ALA脱水酶基因和α-酮戊二酸脱氢酶基因低表达,所述低表达由本发明所述的重组载体造成。
本发明中,所述菌株过表达协同生产模块相关基因,所述协同生产模块相关基因包括:谷氨酰-tRNA合成酶编码基因、谷氨酰-tRNA还原酶GluTR编码基因和谷氨醛氨基转移酶GSAM编码基因。
更进一步的,本发明所述的菌株还过表达抗氧化模块相关基因,所述抗氧化模块相关基因包括:过氧化氢酶编码基因和超氧化物歧化酶编码基因。
本发明所述的菌株中,
所述谷氨酰-tRNA合成酶编码基因来源于希瓦氏菌,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述谷氨酰-tRNA还原酶GluTR编码基因来源于希瓦氏菌,其核苷酸序列SEQIDNO:1所示;
所述谷氨醛氨基转移酶GSAM编码基因来源于希瓦氏菌,其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示;
所述过氧化氢酶编码基因来源于大肠杆菌,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;
所述超氧化物歧化酶编码基因来源于大肠杆菌,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明利用CRISPRi系统对5-ALA脱水酶基因hemB2和α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的表达进行了不同程度的抑制,所述不同抑制程度由干扰序列决定;实验结果表明,不同序列对所述基因抑制程度不同,且单独对hemB2进行抑制时的菌株的5-氨基乙酰丙酸产量显著低于同时对hemB2和sucA进行抑制的菌株;与原始菌株相比,利用如SEQ ID NO:9所示的序列同时对hemB2和sucA进行抑制并协同表达生产系统和抗氧化系统,5-ALA产量增加了134.0倍。
本发明中,所述的基因组合是经过筛选后得到的最优组合。本发明的一些实施例中,利用其它来源协同生长模块基因组合的菌株5-氨基乙酰丙酸的产量显著低于本发明所述来源的生产模块的基因组合。在本发明的一些具体实施例中,利用来源于亚利桑那沙门氏菌的谷氨酰-tRNA还原酶编码基因hemAsa与来源于希瓦氏菌的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因和谷氨醛氨基转移酶GSAM编码基因进行组合后的菌株的产量显著低于三者均来源于希瓦氏菌的菌株。
进一步的,本发明中,所述菌株的底盘菌株为希瓦氏菌MR-1。
本发明中,协同表达生产模块的谷氨酰-tRNA还原酶的编码基因hemA是5-ALA生物合成的第一个关键酶,因此,该酶的活性与稳定性对于5-ALA生物合成起到至关重要的作用。然而目前的专利或者文献中该酶主要来源于亚利桑那沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌,限制了酶优化的可选择范围,因此,本发明提供了新的关键酶基因可供选择。同时本发明采用了来源于希瓦氏菌的协同生长模块相关基因:谷氨酰-tRNA合成酶编码基因和谷氨醛氨基转移酶GSAM编码基因,和来源于大肠杆菌的抗氧化模块相关基因:过氧化氢酶编码基因和超氧化物歧化酶编码基因,与传统这些基因的来源均不相同,进一步扩展了基因的选择范围,且本发明所使用的底盘菌也不相同。本发明所述的重组菌株用于5-ALA的合成。与原始菌株相比,只整合生产模块,5-ALA产量产量增加了66.8倍;只整合协同生产模块和抗氧化模块,5-ALA产量增加了87.4倍;同时整合协同表达生产系统、抗氧化系统和抑制系统(抑制5-ALA脱水酶基因和α-酮戊二酸脱氢酶基因表达),5-ALA产量增加了134.0倍,比单独表达生产系统和协同表达生产、抗氧化系统分别提升了99.0%和52.6%。
本发明提供了5-氨基乙酰丙酸的制备方法,其为发酵如本发明所述的菌株,获得含有5-氨基乙酰丙酸的培养物。
进一步的,所述发酵的条件包括:以0.6vol%接种量取种子液加入含有卡那霉素和氯霉素的发酵液体培养基中培养2h后,再加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导。
本发明公开了一种新的5-氨基乙酰丙酸生产菌株,所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株通过协同表达来源于希瓦氏菌的5-氨基乙酰丙酸生产模块基因(hemA、hemL和gltX)、来源于大肠杆菌的抗氧化模块基因(katE、sodB),并导入抑制模块(所述抑制基因为hemB2和sucA)对希瓦氏菌进行模块化改造,使其能够高效生产5-氨基乙酰丙酸,最高能使5-氨基乙酰丙酸产量较原菌株提升134.0倍。
附图说明
图1示5-ALA生产路线示意图;
图2示表达质粒pYYDT-LAG、pYYDT-LAGKS构建流程;
图3示表达质粒p15a-ddcpf1(hemB2)构建流程;
图4示表达质粒p15a-ddcpf1(hemB2-sucA)构建流程;
图5示5-ALA产量结果。
具体实施方式
本发明提供了产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
hemA的核苷酸序列为:atgagccttgtagcaatcggtattaaccataaaacagccacggtagacctgcgtgagaaagtcgccttctctccggacaaaattcatgatgccatgaagagtctggccagtcgtacacgctcgggtgaagccgttatcgtctcgacctgcaatcgcactgaattgtattgtaacaatggcgatgagaccgatatcattgaatggcttgaagaatatcatggcctagaacatcaagatgtcgcgccttgcctctacaattatcacgggcaagaggcggtaaggcatttgatgcgcgtcgcttcaggtcttgactcgttgatccttggtgagccgcagattcttggtcaagttaaacaagcctttgtcaaagccaaagaagccggcacagttgccttaaccattgaccgcttgttccaaaataccttctcagttgctaaaaaagtgcgtaccgaaaccgaaatcggtgccgctgctgtatcggtcgcctttgcggctgtcagcatggcaaaacatatcttctcttcactgtcgacaaccaaggtgctgttaattggtgctggtgaaacgattgagctagtggcaaagcatctaaaagataacggcgtcgcctcaatggtggtggcaaaccgtactttagagcgtgcccaaagcatgtgtgaggaatttaatgccacggcaattacactggcacagataccagattttctccctaaagccgatatcgtgatatcctctaccgccagcccgctgccaatccttggtaaaggcatggtagaaaaagcgctaaagcagcgtcgccatcaacctatgttattggttgatatagcagttcctcgggatattgagccagaagtcgccgatttggacgatgcgtttctgtatacagtggacgacctgcatagcattattgaacagaataaggcttcccgtaaggaggccgccgagcaagctgaattaattactgaagaacaatctcatctatttatggagtgggtgcgttctttagagtcggtcgatagtattcgcgagtatcgcagccagagcatggcgataaaggatgagttggtggaacgcgccctgaataaattagcgcaggggggcgacactgagcaggtattggttgaattagccaatcgtctgaccaatagactcattcacgcacctacccaagccctcacggtggccagccgtcagggggatttgaatacattaggtcagttaagaacagcgctcggattagataaaaactaa(如SEQ ID NO:1所示)。
hemAsa的核苷酸序列为:atgaccaagaagcttttagcgctcggtattaaccataaaacggcacctgtatcgctgcgagaacgcgtaacgttttcgccggacacgcttgatcaggcgctggacagcctgcttgcgcagccaatggtgcagggcggggtcgtgctgtcaacctgtaaccgtacagagctgtatctgagcgtggaagagcaggataacctgcaggaagcgctgatccgctggttatgcgattaccataacctgaacgaggacgatctgcgcaacagtctgtactggcatcaggacaatgacgccgtcagccacctgatgcgcgtcgccagcggtctggattcactggtgctgggcgaaccgcaaatcctcggtcaggtgaaaaaagcgtttgcggattcgcaaaaaggccaccttaacgccagcgcgctggagcgaatgtttcagaagtctttttccgtcgccaagcgagtgcggactgaaaccgatatcggcgccagcgccgtctccgtcgcgtttgccgcctgtacgctcgcccgccaaatctttgaatcgctgtcgacggtcactgtactgttagttggcgcgggcgaaaccattgaactggtggcgcgtcacctgcgcgagcataaagtacaaaagatgattatcgccaaccgaacccgcgagcgcgcgcaagccctggcggatgaggtaggcgctgaggttatctcgctcagcgatatcgacgcccgtttgcaggatgccgatattatcatcagttcgaccgccagcccgctgccgattatcggtaaaggcatggtggagcgcgcattaaaaagccgtcgtaatcagccgatgctgctggtggatatcgccgtaccacgtgacgttgagccggaagtcggcaaactggcgaacgcttatctttatagcgtcgatgatttacagagcattatttcgcataatctggcgcagcgtcaggctgctgcagtagaagcggaaacgattgttgagcaggaagccagcgagtttatggcctggctacgcgcccagggggccagcgagaccattcgggaataccgtagtcagtcggagcagattcgtgacgaactgactaccaaagcgctgtcagcccttcaacagggcggcgatgcgcaagccatcttgcaggatctggcatggaaactgaccaaccgcctgattcatgcgccaacgaaatcacttcaacaggctgcccgtgacggggatgacgaacgcctgaatattctgcgcgacagcctcgggctggagtag(如SEQ ID NO:2所示)。
hemL的核苷酸序列为:atgacccgttccgaagcgctatttgaacaggctaaaaaaaccatccccggcggtgttaactctccggttcgtgcttttaatggtgtaggtggttcccccctgtttattgaaaaagccgatggcgcttatatctacgatgccgatggcaaagcctatatcgactatgtcggttcttggggcccgatgatcctcggccacaatcatccgaagatccgtgaagcagtgctggctgcagtacacaatggcctgtcttttggcgcgccaactgagcttgaagtgcaaatggccgaaaaagtgattgcgatggtgccctcgattgagcaagtccgtatggtcagctctggtactgaagcgaccatgagtgcgattcgcttagcgcgcggttttactaatcgtgacaagatcttaaagtttgaaggttgctaccatggccacgctgactgcctattagttaaggcggggtctggtgcattaaccttaggccaacccagctcacccggcatccctgaagatttcgcaaagcacaccttaactgccgtgtataacgatctggattctgttcgtagcctattcgagcaatatccaactgagatttcttgcatcatcatcgagcccgttgctggcaacatgaactgcatcccacctattccaggcttcctcgaaggtctgcgtagcctgtgtgatgagtttggtgcgctgctgattatcgacgaagtgatgacagggttccgagtttcaaaaagcggtgctcaaggtcactatggcgttacgccagacttaaccactctcggtaaagtcatcggtggcggtatgccagtaggtgcatttggtggtcgtaaagatgtgatgcagtttatcgcaccaacaggtcctgtataccaagcaggtacgctttcaggtaacccaattgcgatgtcagcgggtctagcgcaaatggaagcattgtgtgaagaaggactgtacgaagccctaagcgctaaaaccaagcgcatcgccgaaggctttaaagcggcggcggataagcacggcatcccaatggcaatcaactatgttggcggtatgttcggcttcttttttaccgagcaagagcacatcacacgcttcgaccaagtgactaagtgcaatattgagcacttccgtactttctaccatggcatgttagatgaaggcgtttacttagcaccaagtgcctatgaagcaggcttcctgtcgatggcccatggtgaagaagagctgcgcctcacacttgaagctgccgaccgtgtcttagctcgcatgaaagcggcaaactaa(如SEQ ID NO:3所示)。
gltX的核苷酸序列为:atgacaactaagacgcgttttgccccaagcccaacaggctttttgcacgtgggcggtgcccgtactgcactttattcttggttacaagcccgtgccaataatggtgagtttgttttacgtattgaagatacagatattgagcgttctactcaggccgcttgtgatgccattttagagggcatgaactggttaggattaacttgggatgagggtccgtactatcaaactaagcgttttgatcgttataacgagatcatcgcgcaaatgttagagcagggcacagcttataaatgttactgctcgcgtgaacgtatcgatgctttaagagaagcacaagcggcaaatggcgaagcgcaaaaatacgatggttgctgccgtaacttgcccgcgcgtgacactgatgaaccttttgtggtgcgttttaaaaaccctatcggtggttcagtggtatttgatgatcacgtccgtggccgtatcgaattctcaaacgatgcactagatgacctgatcatcgcccgtaccgacggcgtgcatacctataacttctgtgtagttgtagacgattgggatatggggattacctgtgtggtgcgtggtgaagaccatattaacaacacgccacgtcaaatcaacattcttaaagcattgggcgcaccaattcctgaatatgctcatgtgtcgatgattttaggggatgatggtgccaagctgtctaagcgtcacggtgcagtcagtgttatgcagtaccgtgatgatggttatttacccgaagcgttactcaactatttagtgcgtttaggttggtcacacggtgatcaagaggttttctctttagaggaaatgaagcagtactttaagttagatgacattaacaaagcaccttctgcctttaataccgaaaaactggtttggttaaaccaacactatattaagacgctcgatcctgaatatgtggcttcccacctacagtggcatatggacgatcaaaagattgatacctcaaatggtccagccttatctgcggttgtcactgcattagctgagcgcgcgaagactttaaaagagttagctgcttctagccgctacttctatgaagattttgccgagtttgatgctgagcaggcgaaaaagcatttgcgcggtgttgcgcttgagccattacaattagtgcaacaaaagttagcggcattacctgagtggacggttgaggctattcatcaggcgattgaagctactgctgcagaattagaagtcggtatgggcaaagtcggtatgccattgcgtgtcgctgtgaccggagcagggcagtctccaggccttgatatcacgttatttttaatcggaagagcccgttctgagcaaagaatatccaaagcgattgaatttgtagcagatagaataaattcctaa(如SEQID NO:4所示)。
katE的核苷酸序列为:atgtcgcaacataacgaaaagaacccacatcagcaccagtcaccactacacgattccagcgaagcgaaaccggggatggactcactggcacctgaggacggctctcatcgtccagcggctgaaccaacaccgccaggtgcacaacctaccgccccagggagcctgaaagcccctgatacgcgtaacgaaaaacttaattctctggaagacgtacgcaaaggcagtgaaaattatgcgctgaccactaatcagggcgtgcgcatcgccgacgatcaaaactcactgcgtgccggtagccgtggtccaacgctgctggaagattttattctgcgcgagaaaatcacccactttgaccatgagcgcattccggaacgtattgttcatgcacgcggatcagccgctcacggttatttccagccatataaaagcttaagcgatattaccaaagcggatttcctctcagatccgaacaaaatcaccccagtatttgtacgtttctctaccgttcagggtggtgctggctctgctgataccgtgcgtgatatccgtggctttgccaccaagttctataccgaagagggtatttttgacctcgttggcaataacacgccaatcttctttatccaggatgcgcataaattccccgattttgttcatgcggtaaaaccagaaccgcactgggcaattccacaagggcaaagtgcccacgatactttctgggattatgtttctctgcaacctgaaactctgcacaacgtgatgtgggcgatgtcggatcgcggcatcccccgcagttaccgcaccatggaaggcttcggtattcacaccttccgcctgattaatgccgaagggaaggcaacgtttgtacgtttccactggaaaccactggcaggtaaagcctcactcgtttgggatgaagcacaaaaactcaccggacgtgacccggacttccaccgccgcgagttgtgggaagccattgaagcaggcgattttccggaatacgaactgggcttccagttgattcctgaagaagatgaattcaagttcgacttcgatcttctcgatccaaccaaacttatcccggaagaactggtgcccgttcagcgtgtcggcaaaatggtgctcaatcgcaacccggataacttctttgctgaaaacgaacaggcggctttccatcctgggcatatcgtgccgggactggacttcaccaacgatccgctgttgcagggacgtttgttctcctataccgatacacaaatcagtcgtcttggtgggccgaatttccatgagattccgattaaccgtccgacctgcccttaccataatttccagcgtgacggcatgcatcgcatggggatcgacactaacccggcgaattacgaaccgaactcgattaacgataactggccgcgcgaaacaccgccggggccgaaacgcggcggttttgaatcataccaggagcgcgtggaaggcaataaagttcgcgagcgcagcccatcgtttggcgaatattattcccatccgcgtctgttctggctaagtcagacgccatttgagcagcgccatattgtcgatggtttcagttttgagttaagcaaagtcgttcgtccgtatattcgtgagcgcgttgttgaccagctggcgcatattgatctcactctggcccaggcggtggcgaaaaatctcggtatcgaactgactgacgaccagctgaatatcaccccacctccggacgtcaacggtctgaaaaaggatccatccttaagtttgtacgccattcctgacggtgatgtgaaaggtcgcgtggtagcgattttacttaatgatgaagtgagatcggcagaccttctggccattctcaaggcgctgaaggccaaaggcgttcatgccaaactgctctactcccgaatgggtgaagtgactgcggatgacggtacggtgttgcctatagccgctacctttgccggtgcaccttcgctgacggtcgatgcggtcattgtcccttgcggcaatatcgcggatatcgctgacaacggcgatgccaactactacctgatggaagcctacaaacaccttaaaccgattgcgctggcgggtgacgcgcgcaagtttaaagcaacaatcaagatcgctgaccagggtgaagaagggattgtggaagctgacagcgctgacggtagttttatggatgaactgctaacgctgatggcagcacaccgcgtgtggtcacgcattcctaagattgacaaaattcctgcctga(如SEQ ID NO:5所示)。
sodB的核苷酸序列为:atgtcattcgaattacctgcactaccatatgctaaagatgctctggcaccgcacatttctgcggaaaccatcgagtatcactacggcaagcaccatcagacttatgtcactaacctgaacaacctgattaaaggtaccgcgtttgaaggtaaatcactggaagagattattcgcagctctgaaggtggcgtattcaacaacgcagctcaggtctggaaccatactttctactggaactgcctggcaccgaacgccggtggcgaaccgactggaaaagtcgctgaagctatcgccgcatcttttggcagctttgccgatttcaaagcgcagtttactgatgcagcgatcaaaaactttggttctggctggacctggctggtgaaaaacagcgatggcaaactggctatcgtttcaacctctaacgcgggtactccgctgaccaccgatgcgactccgctgctgaccgttgatgtctgggaacacgcttattacatcgactatcgcaatgcacgtcctggctatctggagcacttctgggcgctggtgaactgggaattcgtagcgaaaaatctcgctgcataa(如SEQ ID NO:6所示)。
合成靶向序列hemB2(4)-sucA(1)的核苷酸序列为:acttcgctcaattagaacgtatacgtcctataagaaggggcgtatacaggtgctttttcaccccaatttctactcttgtagatgcagagtaggcc atgatttgagtaatttctactcttgtagatgccatttgggaagcgcaatttgggagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaaga ctgggcctttcgttttatctgttgtttgtcg(如SEQ ID NO:7所示)。
合成靶向序列hemB2(4)-sucA(2)的核苷酸序列为:acttcgctcaattagaacgtatacgtcctataagaaggggcgtatacaggtgctttttcaccccaatttctactcttgtagatgcagagtaggcc atgatttgagtaatttctactcttgtagataacccgtctcaccttgaaatcgtgagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac tgggcctttcgttttatctgttgtttgtcg(如SEQ ID NO:8所示)。
合成靶向序列hemB2(4)-sucA(3)的核苷酸序列为:acttcgctcaattagaacgtatacgtcctataagaaggggcgtatacaggtgctttttcaccccaatttctactcttgtagatgcagagtaggcc atgatttgagtaatttctactcttgtagatctgcgatcagtttgtcagcgtaagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac tgggcctttcgttttatctgttgtttgtcg(如SEQ ID NO:9所示)。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1构建表达生产模块、抗氧化模块以及抑制模块的重组质粒
一、构建表达含生产模块的重组质粒pYYDT-LAsaG和pYYDT-LAG
1、希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)基因组DNA的提取和hemL、hemA、gltX基因的PCR扩增;所述hemL基因编码产物为来源于希瓦氏菌的谷氨酸-1-半醛氨基转移酶GSAM;所述hemA基因编码产物为来源于希瓦氏菌的谷氨酰-tRNA还原酶GluTR;所述gltX基因编码产物为来源于希瓦氏菌的谷氨酰-tRNA合成酶GluTS;
使用细菌基因组提取试剂盒提取希瓦氏菌MR-1基因组DNA。并以所提取的基因组作为模板,以hemL-F和hemL-R、hemA-F和hemA-R、gltX-F和gltX-R作为引物,利用高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出基因片段hemL、hemA和gltX(其中基因序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示),并进行琼脂糖凝胶电泳,通过胶回收试剂盒对目的片段进行回收。
2、构建含有hemL、hemA和gltX基因的重组质粒
以pYYDT空质粒作为模板,使用pYYDT-F、pYYDT-R引物和高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出载体片段pYYDT,进行琼脂糖凝胶电泳,回收质粒骨架。使用无缝克隆方法将上述hemL、hemA和gltX基因与pYYDT载体片段进行连接反应。利用热激转化的方法将其转化至大肠杆菌Turbo感受态细胞中。经过37℃、220rpm培养1.5h后,将200μL细菌悬液均匀涂布于含卡那青霉素的LB平板中,于37℃恒温培养箱中培养过夜。待平板上长出明显单克隆后,对其进行验证并测序,获得阳性质粒命名为pYYDT-LAG(图2)。
3、构建含有hemL、hemAsa和gltX基因的重组质粒
使用hemAsa-F和hemAsa-R引物和利用高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出来源于亚利桑那沙门氏菌的谷氨酰-tRNA还原酶GluTR基因hemAsa(其中基因序列如SEQ IDNO:2所示),并使用无缝克隆方法与上述操作过程中获得的来源于希瓦氏菌的hemL、gltX基因以及pYYDT载体片段进行连接反应。利用热激转化的方法将其转化至大肠杆菌Turbo感受态细胞中。经过37℃、220rpm培养1.5h后,将200μL细菌悬液均匀涂布于含卡那青霉素的LB平板中,于37℃恒温培养箱中培养过夜。待平板上长出明显单克隆后,对其进行验证并测序,获得阳性质粒命名为pYYDT-LAsaG(图2)。
二、构建协同表达生产模块、抗氧化模块的重组质粒pYYDT-LAGKS
1、大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA的提取和过氧化氢酶编码基因katE、超氧化物歧化酶编码基因sodB的PCR扩增
使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌MG1655基因组DNA。并以所提取的基因组作为模板,以katE-F和katE-R、sodB-F和sodB-R作为引物,利用高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出基因片段katE和sodB(其中基因序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6),并进行琼脂糖凝胶电泳,通过胶回收试剂盒对目的片段进行回收。
2、构建含有hemL、hemA、gltX、katE、sodB基因的重组质粒
以pYYDT-LAG质粒作为模板,使用pYYDT-LAG-F、pYYDT-LAG-R引物和高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出载体片段pYYDT-LAG,进行琼脂糖凝胶电泳,回收质粒骨架。使用无缝克隆方法将上述katE和sodB基因与pYYDT-LAG载体片段进行连接反应。利用热激转化的方法将其转化至大肠杆菌Turbo感受态细胞中。经过37℃、220rpm培养1.5h后,将200μL细菌悬液均匀涂布于含卡那霉素的LB平板中,于37℃恒温培养箱中培养过夜。待平板上长出明显单克隆后,对其进行验证并测序,获得阳性质粒命名为pYYDT-LAGKS(图3)。
三、构建表达抑制模块的重组质粒p15a-ddcpf1-hemB2
以p15a-ddcpf1质粒作为模板,使用含有不同靶向序列的引物ddcpf1-hemB2(N)-F、ddcpf1-hemB2(N)-R(N为不同的gRNA序列序号,其靶向hemB2基因的位置不同,抑制程度不同)和高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出基因片段p15a-ddcpf1-hemB2(N),进行琼脂糖凝胶电泳,回收基因片段。使用无缝克隆方法将上述片段进行连接反应。利用热激转化的方法将其转化至大肠杆菌Turbo感受态细胞中。经过37℃、220rpm培养1.5h后,将200μL细菌悬液均匀涂布于含氯霉素的LB平板中,于37℃恒温培养箱中培养过夜。待平板上长出明显单克隆后,对其进行验证并测序,获得含有不同靶向序列的阳性质粒并命名为p15a-ddcpf1-hemB2(N)(图3)。
四、构建表达抑制模块的重组质粒p15a-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N)
设计并合成靶向序列hemB2(4)-sucA(N)(其中基因序列如SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9所示,N为不同的gRNA序列序号,其靶向sucA基因的位置不同,抑制程度不同)、并使用hemB2(4)-sucA(N)-F和hemB2(4)-sucA(N)-R和高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出对应的靶向序列片段hemB2(4)-sucA(N),进行琼脂糖凝胶电泳,回收基因片段。随后以p15a-ddcpf1质粒作为模板,使用引物(p15a-ddcpf1-F、p15a-ddcpf1-R)和高保真Primestar HS DNA酶PCR扩增出基因片段p15a-ddcpf1,进行琼脂糖凝胶电泳,回收基因片段。使用无缝克隆方法将上述片段进行连接反应。利用热激转化的方法将其转化至大肠杆菌Turbo感受态细胞中。经过37℃、220rpm培养1.5h后,将200μL细菌悬液均匀涂布于含氯霉素的LB平板中,于37℃恒温培养箱中培养过夜。待平板上长出明显单克隆后,对其进行验证并测序,获得含有不同靶向序列的阳性质粒并命名为p15a-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N)(图4)。
表1:用于质粒构建的引物
引物名称 | 引物序列 | 序列号 |
hemL-F | atgacccgttccgaagcgctattt | SEQ ID NO:10 |
hemL-R | ttagtttgccgctttcatgcgagc | SEQ ID NO:11 |
hemA-F | atgagccttgtagcaatcggtatt | SEQ ID NO:12 |
hemA-R | ttagtttttatctaatccgagcgc | SEQ ID NO:13 |
hemAsa-F | atgaccaagaagcttttagcgctc | SEQ ID NO:14 |
hemAsa-R | ctactccagcccgaggctgtcgcg | SEQ ID NO:15 |
gltX-F | atgacaactaagacgcgttttgcc | SEQ ID NO:16 |
gltX-R | ttaggaatttattctatctgctac | SEQ ID NO:17 |
pYYDT-F | gaggccaggcatcaaataaaacgaa | SEQ ID NO:18 |
pYYDT-R | ctagtatttctcctcttttatgctatggtccttgt | SEQ ID NO:19 |
katE-F | atgtcgcaacataacgaaaagaac | SEQ ID NO:20 |
katE-R | tcaggcaggaattttgtcaatctt | SEQ ID NO:21 |
sodB-F | atgtcattcgaattacctgcacta | SEQ ID NO:22 |
sodB-R | ttatgcagcgagatttttcgctac | SEQ ID NO:23 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(1)-F | ccatcaccatatctgcgccctctgagccaggcatcaaataaaacgaaagg | SEQ ID NO:24 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(1)-R | agagggcgcagatatggtgatggatctacaagagtagaaattggggtgaaaaagca | SEQ ID NO:25 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(2)-F | acgacccatggtcaagacggcatgagccaggcatcaaataaaacgaaagg | SEQ ID NO:26 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(2)-R | atgccgtcttgaccatgggtcgtatctacaagagtagaaattggggtgaaaaagca | SEQ ID NO:27 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(3)-F | ggattgcagccatgtgcatggcagagccaggcatcaaataaaacgaaagg | SEQ ID NO:28 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(3)-R | tgccatgcacatggctgcaatccatctacaagagtagaaattggggtgaaaaagca | SEQ ID NO:29 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(4)-F | gcagagtaggccatgatttgagtgagccaggcatcaaataaaacgaaagg | SEQ ID NO:30 |
ddcpf1-hemB<sub>2</sub>(4)-R | actcaaatcatggcctactctgcatctacaagagtagaaattggggtgaaaaagca | SEQ ID NO:31 |
p15a-ddcpf1-F | ggcctttcgttttatctgttgtttgtcg | SEQ ID NO:32 |
p15a-ddcpf1-R | ggacgtatacgttctaattgagcgaagt | SEQ ID NO:33 |
hemB<sub>2</sub>(4)-sucA(N)-F | acttcgctcaattagaacgtatacgtcc | SEQ ID NO:34 |
hemB<sub>2</sub>(4)-sucA(N)-R | cgacaaacaacagataaaacgaaaggcc | SEQ ID NO:35 |
实施例二构建表达生产系统、抗氧化系统以及抑制系统的发酵菌株
一、菌株SO-LAG构建
将测序正确的质粒pYYDT-LAG导入希瓦氏菌中,得到表达生产模块的希瓦氏菌菌株SO-LAG,操作步骤如下:
(1)电转感受态制备:从LB平板中挑取希瓦氏菌MR-1单克隆于5mL LB液体培养基的试管中,在30℃,220rpm摇床中过夜培养16~18h;取3mL上述菌液于1.5mL无菌离心管中,5000rpm离心3~5min;在无菌条件下将上清液弃去,加入1mL 300mM无菌蔗糖溶液并用移液枪吹打混匀,5000rpm离心3~5min;重复上一步操作后,加入100μL 300mM无菌蔗糖溶液重悬菌体,获得电转感受态;
(2)目的质粒电转:向制备的电转感受态中加入1000ng pYYDT-LAG质粒,吹打混匀后将其全部加入到电击杯中,电击杯需要提前放置在冰上预冷;擦干电极杯杯壁,将其放置于电转仪中,将电转仪的电压调到2.47kV,然后点击开始按钮;待电击结束后,吸取1000μLLB液体培养基加入到电击杯中,上下颠倒混匀后将液体转移到无菌EP管中,置于30℃,220rpm的摇床中培养1~2h;培养结束后,转移100μL到含有卡那霉素的LB固体培养基平板上,涂布均匀;将平板置于30℃培养箱中过夜培养。
工程菌株验证:待细菌长出后,利用菌落PCR的方式对其进行验证,从而获得质粒正确导入的工程菌株,并命名为SO-LAG。
二、菌株SO-LAsaG构建
将测序正确的质粒pYYDT-LAsaG导入希瓦氏菌中,得到表达生产模块的希瓦氏菌菌株SO-LAsaG,操作步骤如下:
使用与上述步骤(1)(2)相同的方法,将导入质粒更换为pYYDT-LAsaG,将培养结束后的菌液转移100μL到含有卡那霉素的LB固体培养基平板上,涂布均匀,将平板置于30℃培养箱中过夜培养。待细菌长出后,利用菌落PCR的方式对其进行验证,从而获得质粒正确导入的工程菌株,并命名为SO-LAsaG。
三、菌株SO-LAGKS构建
将测序正确的质粒pYYDT-LAGKS导入希瓦氏菌中,获得系统表达生产模块、抗氧化模块希瓦氏菌工程菌株SO-LAGKS,操作流程如下:
使用与上述步骤(1)(2)相同的方法,将导入质粒更换为pYYDT-LAGKS,将培养结束后的菌液转移100μL到含有卡那霉素的LB固体培养基平板上,涂布均匀,将平板置于30℃培养箱中过夜培养。待细菌长出后,利用菌落PCR的方式对其进行验证,从而获得质粒正确导入的工程菌株,并命名为SO-LAGKS。
四、菌株M1-ddcpf1-hemB2构建
将测序正确的质粒p15a-ddcpf1-hemB2(N)导入工程菌株SO-LAGKS中,获得系统表达生产模块、抗氧化模块和抑制模块的希瓦氏菌工程菌株M1-ddcpf1-hemB2(N),操作流程如下:
使用与上述步骤(1)(2)相同的方法,将受体细菌更换为SO-LAGKS,导入质粒更换为p15a-ddcpf1-hemB2(N),将培养结束后的菌液转移100μL到含有氯霉素、卡那霉素的LB固体培养基平板上,涂布均匀,将平板置于30℃培养箱中过夜培养。待细菌长出后,利用菌落PCR的方式对其进行验证,从而获得质粒正确导入的工程菌株,并命名为M1-ddcpf1-hemB2(N)。
五、菌株M1-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N)构建
将测序正确的质粒p15a-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N)导入工程菌株SO-LAGKS中,获得系统表达生产模块、抗氧化模块和抑制模块的希瓦氏菌工程菌株M1-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N),操作流程如下:
使用与上述步骤(1)(2)相同的方法,将受体细菌更换为SO-LAGKS,导入质粒更换为p15a-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N),将培养结束后的菌液转移100μL到含有氯霉素、卡那霉素的LB固体培养基平板上,涂布均匀,将平板置于30℃培养箱中过夜培养。待细菌长出后,利用菌落PCR的方式对其进行验证,从而获得质粒正确导入的工程菌株,并命名为M1-ddcpf1-hemB2(4)-sucA(N)。
实施例三利用重组希瓦氏菌工程菌株生产5-ALA
1、5-ALA生产菌株的诱导
将-80℃保存的阳性单克隆菌液在相应抗性LB平板上进行划线,并于30℃恒温培养箱中过夜培养。从抗性平板中挑取新鲜单克隆菌株于4mL含有相应抗性的2×YT液体培养基中,并置于30℃摇床(220rpm)中培养12~16h。按照0.6%的接种量取种子液加入100mL含抗生素的发酵液体培养基中,30℃,220rpm,震荡培养2h后加入终浓度0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),于30℃,220rpm进行发酵培养,并定时收集发酵液,用于检测5-氨基乙酰丙酸的浓度。
2、5-氨基乙酰丙酸浓度测定
(1)试剂准备:乙酸盐缓冲液:称取8.2g无水乙酸钠于50mL去离子水中,再加入5.7mL冰乙酸,搅拌均匀后用去离子水定容至100mL。
对二甲氨基苯甲醛(DMAB)显色剂:称取1.0g对二甲氨基苯甲醛于20mL冰乙酸中,随后加入8.0mL的70%高氯酸。溶解完全后利用冰乙酸定容至50mL,混匀后置于棕色瓶中,4℃储存。
(2)显色反应:将发酵液的菌液12000g离心5min后,取上清液稀释到合适的倍数。随后取150μL稀释后的样品加入到200μL的乙酸钠缓冲液中,吹打混匀后加入25μL的乙酰丙酮溶液,置于100℃中反应15min。冷却至室温后,加入230μL DMAB显色剂并反应30min。使用酶标仪在554nm处测定反应液吸光值,根据5-ALA标准曲线计算样品中5-ALA的浓度,实验设置三次重复,结果取平均值。
5-ALA产量的结果如图5所示。结果表明:
(1)与原始菌株相比,单独表达生产系统的工程菌株SO-LAsaG(来源于希瓦氏菌的谷氨酸-1-半醛氨基转移酶基因hemL、谷氨酰-tRNA合成酶基因gltX和来源于亚利桑那沙门氏菌的谷氨酰-tRNA还原酶基因hemAsa)5-ALA产量增加效果并不明显,当将hemAsa基因替换为来源于希瓦氏菌的谷氨酰-tRNA还原酶基因hemA时,5-ALA的产量显著提升,与原始菌株相比增加了66.8倍。
(2)在生产系统的基础上协同表达抗氧化系统基因的工程菌株(SO-LAGKS),与仅表达生产系统相比(SO-LAG),5-ALA产量增加了30.4%;
(3)在协同表达生产系统、抗氧化系统的基础上,通过CRISPRi系统对5-ALA脱水酶基因hemB2的表达进行了不同程度的抑制,有效提升了5-ALA的产量,与工程菌株SO-LAGKS相比,最高可提升13.2%;
(4)在协同表达生产系统、抗氧化系统的基础上,通过CRISPRi系统同时对5-ALA脱水酶基因hemB2和α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的表达进行了不同程度的抑制,有效提升了5-ALA的产量,比单独表达生产系统和协同表达生产、抗氧化系统分别提升了99.0%和52.6%。与原始菌株相比,5-ALA产量增加了134.0倍。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.干扰5-ALA脱水酶基因和/或α-酮戊二酸脱氢酶基因表达的核酸,其具有如SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
2.重组载体,其特征在于,其包括载体骨架和权利要求1所述的核酸。
3.权利要求1所述的核酸或权利要求2所述的重组载体在降低菌株5-ALA脱水酶基因和/或α-酮戊二酸脱氢酶基因表达中的应用。
4.生产5-氨基乙酰丙酸的菌株,其特征在于,其5-ALA脱水酶基因和α-酮戊二酸脱氢酶基因低表达,所述低表达由权利要求2所述的重组载体造成。
5.根据权利要求4所述的菌株,其特征在于,所述菌株过表达协同生产模块相关基因,所述协同生产模块相关基因包括:谷氨酰-tRNA合成酶编码基因、谷氨酰-tRNA还原酶编码基因和谷氨醛氨基转移酶编码基因。
6.根据权利要求4或5所述的菌株,其特征在于,所述菌株还过表达抗氧化模块相关基因,所述抗氧化模块相关基因包括:过氧化氢酶编码基因和超氧化物歧化酶编码基因。
7.根据权利要求5或6所述的菌株,其特征在于,
所述谷氨酰-tRNA合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述谷氨酰-tRNA还原酶编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示;
所述谷氨醛氨基转移酶GSAM编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述过氧化氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;
所述超氧化物歧化酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
8.根据权利要求4~7任一项所述的菌株,其特征在于,所述菌株的底盘菌株为希瓦氏菌MR-1。
9.5-氨基乙酰丙酸的制备方法,其为发酵如权利要求4~8任一项所述的菌株,获得含有5-氨基乙酰丙酸的培养物。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述发酵的条件包括:以0.6vol%接种量取种子液加入含有卡那霉素和氯霉素的发酵液体培养基中培养2h后,再加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导。
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