CN113684163B - 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高乳酰‑N‑四糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术领域。本发明通过lgtA和wbgO的外源表达，组合调控乳酰‑N‑四糖合成途径中galE，galT和galK的表达并敲除大肠杆菌宿主乳酰‑N‑四糖合成途径中的lacZ表达，以及对发酵培养基的半乳糖和IPTG添加量进行优化，从而达到提高乳酰‑N‑四糖产量的目的，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力由0.22g/L提升至4.00g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到19.80g/L，为乳酰‑N‑四糖的工业化生产奠定了基础。

Description

一种提高乳酰-N-四糖产量的基因工程菌及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种提高乳酰-N-四糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术领域。

背景技术

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是存在于人乳中的一类天然存在的低聚糖，对婴儿消化系统的早期发育，及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥着不可替代的作用。HMOs可耐受婴儿消化道内酶的水解，进而抵御胃肠道病原微生物的感染和维持胃肠道微生态平衡。乳酰-N-四糖（LNT）是人乳寡糖中的一种重要寡糖，能够增强人体免疫力，调节肠道菌群，促进细胞成熟和加速伤口愈合等生物学功能。鉴于乳酰-N-四糖的重要生物功能和生理活性，已经允许添加进商品化婴幼儿配方奶粉中。虽然近年来对人乳寡糖各组分的研究不断深入，但其具体的生物功能还不是很明确，因此获得足够量结构均一的人乳寡糖单体来开展它们的生物学功能研究，以及开发其在医药领域的应用是现阶段研究人员迫切需要解决的问题。

目前报道的乳酰-N-四糖的合成方法主要包括三种，分别是化学合成、酶法合成和发酵法合成。化学合成法存在反应步骤复杂、原材料价格昂贵等问题，造成生产成本较高不利于工业的大规模合成，且化学合成中使用的部分有毒试剂，使产品不宜用于食品添加剂。酶合成法需要昂贵的核苷酸糖作为底物，不利于乳酰-N-四糖的大规模生产。而生物法可以利用廉价碳氮源和底物，实现乳酰N-四糖的合成，且对环境不造成影响。因此，通过生物法制备乳酰-N-四糖受到了越来越多的关注。

最近，Florian等人利用半乳糖作为碳源在大肠杆菌细胞内发酵合成LNT，产量达到12.72 g/L（Florian等人，2015），但是该方法使用的半乳糖作为唯一碳源，导致生产成本升高，且最终产量不高，因此，寻求廉价高产的LNT合成方法来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。

发明内容

[技术问题]

现有技术不能提供成本低廉且绿色高效生产乳酰-N-四糖的方法。

[技术方案]

本发明为了解决现有微生物方法合成的乳酰-N-四糖产量较低的问题，提供了一种产乳酰-N-四糖的基因工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ，并过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgm、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS、磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶glmU、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT和/或半乳糖激酶基因galK。

在一种实施方式中，β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis），β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO来源于大肠杆菌O55:H7。

在一种实施方式中，β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO来源于大肠杆菌O55:H7的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，磷酸葡萄糖变位酶基因pgm、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS、磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶glmU、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT和半乳糖激酶基因galK均来源于大肠杆菌K-12（Escherichia coli）。

在一种实施方式中，磷酸葡萄糖变位酶基因pgm的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶glmU的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，半乳糖激酶基因galK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1、pETDuet-1或pRSFDuet-1质粒表达基因pgm、pgi、glmM、glmU、glmS、galE、galT、galK、lgtA和/或wbgO。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达pgm、pgi、glmM、glmU、glmS、galE、galT和/或galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达pgm或pgi。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达glmM、glmU和/或glmS。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达galE、galT和galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pRSFDuet-1表达galE、galT和galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pCDFDuet-1表达galE、galT和galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pRSFDuet-1表达galE、galT和galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pCDFDuet-1表达galE、galT和galK。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达galE、galT和galK。

本发明提供了一种构建所述重组大肠杆菌的方法，先在大肠杆菌基因组中敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ，再利用表达载体，过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA、β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO和UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT和半乳糖激酶基因galK。

在本发明的一种实施方式中，利用pTargetF质粒敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ。

在本发明的一种实施方式中，表达载体为pCDFDuet-1和/或pETDuet-1，所述重组大肠杆菌以pETDuet-1质粒表达基因galE、galT、galK，以pCDFDuet-1质粒表达基因lgtA和wbgO。

本发明还提供了上述基因工程菌在生产乳酰-N-四糖及含有乳酰-N-四糖的产品中的应用。

本发明还提供了一种生产乳酰-N-四糖的方法，所述方法为，以乳糖和甘油为碳源，利用上述基因工程菌为发酵菌株发酵生产乳酰-N-四糖。

在一种实施方式中，将上述基因工程菌接种于发酵培养基中，培养至OD₆₀₀为10~13，加入终浓度为15~25 g/L乳糖、0~20 g/L半乳糖和0.2~1.0 mM的IPTG。

在一种实施方式中，待初始碳源消耗完后，流加750~850 g/L甘油和15~25 g/LMgSO₄·7H₂O，待初始乳糖消耗完后，流加乳糖使其浓度维持在3~10 g/L。

在一种实施方式中，发酵条件为，培养温度为24~38℃，搅拌转速250~850 r/min，通气量0.8~1.2 vvm，pH 6.5~7.0，发酵时间为55~65 h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：10~20 g/L甘油，10~15 g/L磷酸二氢钾，2~6 g/L磷酸氢二氨，1~2 g/L柠檬酸，1~2 g/L七水硫酸镁和7.5~12.5 mL/L微量金属元素，余量为水。

在一种实施方式中，所述微量金属元素的组成为：8~12 g/L硫酸亚铁，2~2.5 g/L七水硫酸锌，0.5~1.5 g/L无水硫酸铜和1.5~2.5 g/L二水氯化钙。

本发明的有益效果：

本发明通过β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO的外源表达，组合调控乳酰-N-四糖合成途径中UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT和半乳糖激酶基因galK的表达并敲除大肠杆菌宿主乳酰-N-四糖合成途径中的lacZ表达，以及对发酵培养基的半乳糖和IPTG添加量进行优化，从而达到提高乳酰-N-四糖产量的目的，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰-N-四糖的能力由0.22 g/L提升至4.00 g/L，在3 L发酵罐中，乳酰-N-四糖的产量达到19.8 g/L，为乳酰-N-四糖的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为乳酰-N-四糖代谢通路图；

图2为乳酰-N-四糖标样和乳酰-N-四糖产物样品的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

质粒和DNA产物的测序工作交予天霖生物科技（上海）有限公司完成。

大肠杆菌感受态的制备：上海生工生物工程公司试剂盒。

LB液体培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠。

LB固体培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠，17 g/L琼脂粉。

本发明实施例中所述的乳酰-N-四糖的测定方法使用HPLC，具体为：

1 mL发酵液于100°C煮沸10 min，13400 rpm离心10 min，上清液经0.22 μm膜过滤处理，利用HPLC检测乳酰-N-四糖的生成量。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Rezex ROA-organic acid（Phenomenex，USA），柱温为50ºC；流动相为5 mM的H₂SO₄水溶液，流速为0.6 mL/min；进样量为10 μL。

实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)染色体组基因lacZ的敲除

利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)中lacZ，具体步骤如下（所涉及到的引物序列见表1）：

（1）以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，使用lacZ-up-F/R和lacZ-down-F/R通过PCR分别扩增出lacZ的上下游片段，胶回收。再分别以lacZ上下游片段为模板，采用lacZ-up-F/lacZ-down-R引物通过重叠PCR得到完整的lacZ模板，胶回收DNA片段。

（2）以原始pTargetF质粒为模板，lacZ-sg-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与lacZ序列互补的N20序列，得到带有靶向lacZ的pTargetF质粒（即带有lacZ特异性N20序列的靶向质粒pTargetF）。转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布LB平板（含壮观霉素），37℃扩大培养提取质粒并测序。

（3）取pCas质粒及大肠杆菌BL21(DE3)感受态，冰上放置5 min至感受态融化，取5μL质粒加入100 μL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴30 min，42℃热激90 s，立即置于冰上5min。加入1 mL LB培养基，30℃，180 rpm培养1 h。取200 μL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜至长出大肠杆菌BL21(DE3)/pCas的单菌落。

（4）挑取大肠杆菌BL21(DE3)/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0 h，加入终浓度为30 mM的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21(DE3)/pCas感受态。

（5）将200 ng步骤（2）构建的带有lacZ特异性N20序列的靶向质粒pTargetF和1000ng的供体DNA片段（即步骤（1）得到的完整的lacZ模板），电转至步骤（4）制备的大肠杆菌BL21(DE3)/pCas感受态，涂布于LB平板（卡那霉素和壮观霉素），30℃培养24 h，挑取平板上的阳性菌落于LB中培养10 h，送天霖生物科技（上海）有限公司测序验证。

（6）将步骤（5）测序验证成功的阳性克隆菌落挑至4 mL LB液体试管，加入终浓度为1 mM的IPTG和30 mg/L卡那霉素，30℃培养8-16 h，以去除pTargetF质粒，再在42℃培养12 h，去除pCas质粒，得到基因组敲除lacZ基因的大肠杆菌BL21(DE3) ΔlacZ。

表1.lacZ敲除的引物序列

实施例2：重组质粒的构建及高产乳酰-N-四糖重组菌的筛选

重组菌的构建具体步骤如下（所涉及到的引物序列见表2）：

（1）pgm，pgi，glmM，glmU，glmS，glmU-glmS，galE，galE-galT和galE-galT-galK基因片段的获得：以大肠杆菌K-12（Escherichia coli）的基因组为模板，以pgm-F/pgm-R、pgi-F/pgi-R、glmM-F/glmM-R、glmU-F/glmU-R、glmS-F/glmS-R、glmUS-F/glmUS -R、galE-F/galE-R、galT-F/galT-R、galK-F/galK-R、galET-F/galET-R和galETK-F/galETK-R为引物，分别PCR扩增出pgm，pgi，glmM，glmU，glmS，glmU-glmS，galE，galT，galK，galE-galT和galE-galT-galK基因片段，胶回收DNA片段，将回收的pgm，pgi，glmM，glmU，glmS，glmU- glmS，galE，galT，galK，galE-galT和galE-galT-galK基因片段通过无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞生命科技有限公司）分别连接到载体pETDuet-1的BamHI和SaiI酶切位点之间，获得质粒pET-pgm、pET-pgi、pET-glmM、pET- glmU、pET-glmS、pET-glmUS、pET-galE、pET-galT、pET-galK、pET-galET和pET-galETK。将glmU-glmS基因片段连接到载体质粒pET-glmM的BgiII和XhoI酶切位点之间，获得的质粒pET-glmM-glmUS；

（2）lgtA和wbgO基因片段的获得：委托天霖生物科技（上海）有限公司合成来源于脑膜炎奈瑟球菌的lgtA基因序列和来源于大肠杆菌O55:H7（Escherichia coli O55:H7）的wbgO基因序列，将合成后的lgtA基因片段通过无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞生命科技有限公司）连接到载体pCDFDuet-1的BamHI和SaiI酶切位点之间，获得质粒pCDF-lgtA，再将wbgO基因片段连接到载体质粒pCDF-lgtA的BgiII和XhoI酶切位点之间，最终获得的质粒为pCDF-lgtA-wbgO。

表2. 质粒构建引物

（3）根据乳酰-N-四糖合成通路中的关键基因将步骤（1）获得的质粒pET-pgm、pET-pgi、pET-glmM、pET- glmU、pET-glmS、pET-glmUS、pET-glmM-glmUS、pET-galE、pET-galT、pET-galK、pET-galET、pET-galETK和pCDF-lgtA-wbgO进行组合并分别转入实施例1获得大肠杆菌BL21(DE3) ΔlacZ，共得到了13个不同的工程菌，分别表示为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12和B13，具体每个菌株携带的乳酰-N-四糖合成通路中的关键基因见表3，13个不同的工程菌株发酵培养后经HPLC鉴定确认产乳酰-N-四糖（图2），其产量分别为0.22 g/L、0.85 g/L、0.62 g/L、1.09 g/L、0.62 g/L、0.80 g/L、0.22 g/L、0.55 g/L、1.00g/L、0.56 g/L、0.67 g/L、2.30 g/L和3.14 g/L（见表3）。菌株B13相对于菌株B1，乳酰-N-四糖的产量增加了13.3倍。因此，过表达与UDP-半乳糖合成相关的大肠杆菌内源性基因galE- galT-galK，能够增加乳酰-N-四糖产量。菌株B13的乳酰-N-四糖代谢通路图如图1所示。

表3. 各工程菌详细信息

发酵培养方法如下：

将构建的工程菌接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养12 h，得到种子液；再将种子液以2 mL/100 mL的接种量接入50 mL发酵培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养至OD₆₀₀为0.6；加入终浓度为0.4 mM的IPTG，同时加入乳糖至乳糖浓度为10 g/L，25℃，200rpm的条件下诱导培养48 h。

发酵培养基：20 g/L甘油，13.5 g/L磷酸二氢钾，4.0 g/L磷酸氢二氨，1.7 g/L柠檬酸，1.4 g/L七水硫酸镁和微量金属元素（10 mg/L硫酸亚铁，2.25 mg/L七水硫酸锌，1.0mg/L无水硫酸铜，2.0 mg/L二水氯化钙），pH 6.8。

实施例3：三种不同拷贝数重组质粒的筛选

不同拷贝数重组质粒菌的构建具体步骤如下（所涉及到的引物序列见表4）：

（1）galE-galT-galK基因片段的获得：以大肠杆菌K-12（Escherichia coli）的基因组为模板，以galETK-F/galETK-R为引物，用PCR扩增出galE-galT-galK基因片段，胶回收DNA片段，将回收的DNA基因片段通过无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞生命科技有限公司）分别连接到载体pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1的BamHI和SaiI酶切位点之间，最终获得质粒pCDF-galETK、pET-galETK和pRSF-galETK；

（2）lgtA和wbgO基因片段的获得：委托天霖生物科技(上海)有限公司合成来源于脑膜炎奈瑟球菌的lgtA基因序列和来源于大肠杆菌O55:H7（Escherichia coli O55:H7）的wbgO基因序列，将合成后的lgtA基因片段通过无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞生命科技有限公司）连接到载体pETDuet-1/pRSFDuet-1的BamHI和SaiI酶切位点之间，获得质粒pET-lgtA/pRSF-lgtA，再将wbgO基因片段连接到载体质粒pET-lgtA/pRSF-lgtA的BgiII和XhoI酶切位点之间，最终获得质粒pET-lgtA-wbgO/pRSF-lgtA-wbgO。

表4. 质粒构建引物

（3）质粒pRSFDuet-1具有较高的拷贝数，质粒pETDuet-1有中等的拷贝数，而质粒pCDFDuet-1具有较低的拷贝数。其中pRSF，pET和pCDF分别是表达质粒pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1的复制子，代表不同的拷贝数，三者的拷贝数分别为100，40和20。

将表达galE-galT-galK基因片段的质粒pCDF-galETK、pET-galETK和pRSF-galETK，和，表达lgtA和wbgO基因片段的质粒pCDF-lgtA-wbgO、pET- lgtA-wbgO和pRSF-lgtA-wbgO进行组合，得到了6个不同的工程菌，分别表示为B13～18（表5）。6个不同的工程菌株发酵后的乳酰-N-四糖的产量分别为3.14 g/L、0.95 g/L、1.71 g/L、0.77 g/L、2.81g/L和2.51 g/L。其中含有重组质粒pCDF-lgtA-wbgO和pET-galE-galT-galK的工程菌(即菌株B13)获得了3.140 g/L的最高产量（见表5）。因此，表达相对较低的基因剂量的大肠杆菌内源性基因galE-galT-galK同时低水平基因剂量的外源基因lgtA和wbgO可以有更高的乳酰-N-四糖产量。

表5. 各工程菌详细信息

发酵培养方法如下：

将构建的工程菌接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养12 h，得到种子液；再将种子液以2 mL/100 mL的接种量接入50 mL发酵培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养至OD₆₀₀为0.6；加入终浓度为0.4 mM的IPTG，同时加入乳糖至乳糖浓度为10 g/L，25℃，200rpm的条件下诱导培养48 h。

发酵培养基：20 g/L甘油，13.5 g/L磷酸二氢钾，4.0 g/L磷酸氢二氨，1.7 g/L柠檬酸，1.4 g/L七水硫酸镁和微量金属元素（10 mg/L硫酸亚铁，2.25 mg/L七水硫酸锌，1.0mg/L无水硫酸铜，2.0 mg/L二水氯化钙），pH 6.8。

实施例4：不同半乳糖添加量对产乳酰-N-四糖的筛选

采用不同半乳糖添加量的发酵培养基对实施例3获得的高产乳酰-N-四糖的工程菌B13进行发酵，具体发酵方法如下：

将基因工程菌B13接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养12 h，得到种子液；再将种子液以2 mL/100 mL的接种量接入50 mL发酵培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养至OD₆₀₀为0.6；加入终浓度为0.4 mM的IPTG，同时加入乳糖至乳糖浓度为10 g/L，且同时加入不同浓度的半乳糖（见表6），25℃，200 rpm的条件下诱导培养48 h。

上述发酵培养基的组成为，20 g/L甘油，13.5 g/L磷酸二氢钾，4.0 g/L磷酸氢二氨，1.7 g/L柠檬酸，1.4 g/L七水硫酸镁和10 mL/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25 g/L七水硫酸锌，1.0 g/L无水硫酸铜，2.0 g/L二水氯化钙，pH 6.8。

菌株B13在不同半乳糖添加量的发酵培养基中乳酰-N-四糖的产量检测的结果如表6所示，由该表可以看出，当培养基半乳糖添加量为5 g/L时，相对于半乳糖添加量为0 g/L时的发酵生产乳酰-N-四糖产量提高了20.3%。

表6. 各不同半乳糖添加量详细信息

实施例5：不同IPTG添加量对产乳酰-N-四糖的筛选

采用不同IPTG添加量的发酵培养基对实施例3获得的高产乳酰-N-四糖的工程菌B13进行发酵，具体发酵方法如下：

将构建的基因工程菌B13接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养12 h，得到种子液；再将种子液以2 mL/100 mL的接种量接入50 mL发酵培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养至OD₆₀₀为0.6；加入不同终浓度的IPTG（见表7），同时加入乳糖至乳糖浓度为10 g/L，且同时加入半乳糖至半乳糖浓度为5 g/L，25℃，200 rpm的条件下诱导培养48 h。

上述发酵培养基的组成为，20 g/L甘油，13.5 g/L磷酸二氢钾，4.0 g/L磷酸氢二氨，1.7 g/L柠檬酸，1.4 g/L七水硫酸镁和微量金属元素（10 mg/L硫酸亚铁，2.25 mg/L七水硫酸锌，1.0 mg/L无水硫酸铜，2.0 mg/L二水氯化钙），pH 6.8。

诱导剂的浓度是影响酶表达的关键因素，在发酵培养基添加5 g/L的半乳糖前提下，对菌株B13进行不同IPTG添加量的发酵培养基中诱导培养，乳酰-N-四糖的产量检测的结果如表7所示，由该表可以看出，随着IPTG的升高乳酰-N-四糖产量保持增长，当达到0.5mM最高，之后随着IPTG的升高乳酰-N-四糖产量降低。因此，相对较高的诱导剂浓度可能对生产乳酰-N-四糖没有帮助。当培养基IPTG添加量为0.5 mM时，相对于实施例4的IPTG添加量0.4 mM时的发酵生产乳酰-N-四糖产量提高了5.9%。

表7. 各不同IPTG添加量详细信息

实施例6：高效生产工程菌发酵罐生产乳酰-N-四糖

为了进一步验证乳酰-N-四糖合成方法的有效性，提高乳酰-N-四糖的产量。

将实施例3获得的基因工程菌B13接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，摇瓶培养12 h，得到种子液；将种子液以体积比10％的接种量接种到工作体积为1 L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800 r/min，通气量1 vvm，pH 6.8 (补加氨水自动控制)。发酵12 h（OD₆₀₀约为12），加入终浓度为20 g/L乳糖、5 g/L半乳糖和0.5 mM的IPTG。为了维持菌体的生长以及乳酰-N-四糖的合成，待初始碳源消耗完后流加800 g/L的甘油（含20 g/L的MgSO₄·7H₂O）以补充碳源，待初始乳糖消耗完后流加200 g/L的乳糖并使其在体系中的浓度维持在5 g/L左右至发酵结束。培养整个过程达到59 h后，菌体OD₆₀₀达到69.1，乳酰-N-四糖的产量最高达到19.79 g/L。表8为发酵过程中菌的乳酰-N-四糖合成量动态变化表。

表8. 发酵过程中乳酰-N-四糖合成量动态变化表

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高乳酰-N-四糖产量的基因工程菌及其生产方法

<130> BAA210937A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 脑膜炎奈瑟球菌

<400> 1

atgggccagc cgctggttag cgttctgatc tgcgcgtaca acgttgaaaa atatttcgcg 60

cagagcctgg cagctgttgt taaccagacc tggcgtaacc tggacattct gatcgttgat 120

gatggctcta ccgatggcac cctggcgatc gcgcagcgtt tccaggaaca ggacggtcgt 180

atccgtattc tggcgcagcc gcgtaactct ggtctgattc caagcctgaa catcggcctg 240

gatgaactgg cgaaaagcgg cggtggtggt gaatacatcg cgcgtaccga tgcggatgat 300

atcgcagctc cggattggat tgaaaaaatc gttggtgaaa tggaaaaaga tcgtagcatc 360

atcgcaatgg gcgcttggct ggaagtgctg tccgaagaaa aagatggcaa ccgtctggca 420

cgtcaccacg aacacggtaa aatctggaaa aaaccgaccc gtcacgaaga catcgcggat 480

ttcttcccat tcggcaaccc gattcacaac aacaccatga tcatgcgtcg ttccgtgatc 540

gatggcggcc tgcgttacaa caccgaacgt gattgggcag aagactatca gttctggtat 600

gatgtttcta aactgggtcg tctggcgtac tacccggaag cgctggttaa ataccgtctg 660

cacgctaacc aggttagctc caaatatagc atccgccagc acgaaatcgc tcagggtatc 720

cagaaaaccg cacgtaacga tttcctgcag tctatgggtt tcaaaacccg tttcgatagc 780

ctggaatacc gtcagattaa agcggttgcg tatgaactgc tggaaaaaca cctgccggaa 840

gaagattttg aactggcgcg tcgtttcctg taccagtgct tcaaacgtac cgataccctg 900

ccggcgggcg cttggctgga tttcgcggcg gatggccgta tgcgtcgtct gttcaccctg 960

cgtcagtact tcggtatcct gcaccgtctg ctgaaaaacc gttaa 1005

<210> 2

<211> 798

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 2

atgataatcg atgaagctga atctgccgaa tcaactcatc ctgttgtttc tgttattctg 60

ccagttaata aaaaaaaccc ttttcttgat gaggcaataa atagtatttt atcgcaaaca 120

ttttcgtcat tcgagataat aatagttgca aattgttgta cggatgattt ttataatgag 180

ttgaaacaca aagttaatga caaaattaag ttgattcgta caaatattgc ttatttaccg 240

tactcattaa ataaagccat cgatttgtcc aatggtgagt ttattgcaag gatggattcc 300

gatgatattt ctcatcctga tagattcacg aaacaagttg attttttaaa aaataatcct 360

tatgtggatg tcgtcggtac taatgcaata tttattgatg ataaaggtcg agaaataaac 420

aaaacaaagc tacctgaaga aaatttggat attgtaaaaa acttaccgta taaatgttgc 480

attgttcatc catctgtaat gtttaggaag aaagtaatcg cttcaattgg cggttatatg 540

ttttcaaact attctgagga ttatgagtta tggaatagat taagtttagc aaaaataaaa 600

tttcaaaatt taccggaata tttattctat tacaggttgc atgaaggtca gtcaactgct 660

aaaaaaaact tgtatatggt tatggtaaat gatttggtaa taaagatgaa atgctttttt 720

ttgacaggta atatcaacta tctcttcgga gggattagaa ctattgcttc ttttatatac 780

tgtaaataca taaagtga 798

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgagtaatc gtaaatattt cggtaccgat gggattcgtg gtcgtgtagg ggatgcgccg 60

atcacacctg attttgtgct taagctgggt tgggccgcgg gtaaagtgct ggcgcgccac 120

ggctcccgta agattattat tggtaaagac acgcgtattt ctggctatat gctggagtca 180

gcactggaag cgggtctggc ggcagcgggc ctttccgcac tcttcactgg cccgatgcca 240

acaccggccg tggcttatct gacgcgtacc ttccgcgcag aggccggaat tgtgatatct 300

gcatcgcata acccgttcta cgataatggc attaaattct tctctatcga cggcaccaaa 360

ctgccggatg cggtagaaga ggccatcgaa gcggaaatgg aaaaggagat cagctgcgtt 420

gattcggcag aactgggtaa agccagccgt atcgttgatg ccgcgggtcg ctatatcgag 480

ttttgcaaag ccacgttccc gaacgaactt agcctcagtg aactgaagat tgtggtggat 540

tgtgcaaacg gtgcgactta tcacatcgcg ccgaacgtgc tgcgcgaact gggggcgaac 600

gttatcgcta tcggttgtga gccaaacggt gtaaacatca atgccgaagt gggggctacc 660

gacgttcgcg cgctccaggc tcgtgtgctg gctgaaaaag cggatctcgg tattgccttc 720

gacggcgatg gcgatcgcgt gattatggtt gaccatgaag gcaataaagt cgatggcgat 780

cagatcatgt atatcatcgc gcgtgaaggt cttcgtcagg gccagctgcg tggtggcgct 840

gtgggtacat tgatgagcaa catggggctt gaactggcgc tgaaacagtt aggaattcca 900

tttgcgcgcg cgaaagtggg tgaccgctac gtactggaaa aaatgcagga gaaaggctgg 960

cgtatcggtg cagagaattc cggtcatgtg atcctgctgg ataaaactac taccggtgac 1020

ggcatcgttg ctggcttgca ggtgctggcg gcgatggcac gtaaccatat gagcctgcac 1080

gacctttgca gcggcatgaa aatgttcccg cagattctgg ttaacgtacg ttacaccgca 1140

ggtagcggcg atccacttga gcatgagtca gttaaagccg tgaccgcaga ggttgaagct 1200

gcgctgggca accgtggacg cgtgttgctg cgtaaatccg gcaccgaacc gttaattcgc 1260

gtgatggtgg aaggcgaaga cgaagcgcag gtgactgaat ttgcacaccg catcgccgat 1320

gcagtaaaag ccgtttaa 1338

<210> 4

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 4

atgttgaata atgctatgag cgtagtgatc cttgccgcag gcaaaggcac gcgcatgtat 60

tccgatcttc cgaaagtgct gcataccctt gccgggaaag cgatggttca gcatgtcatt 120

gatgctgcga atgaattagg cgcagcgcac gttcacctgg tgtacggtca cggcggcgat 180

ctgctaaaac aggcgctgaa agacgacaac cttaactggg tgcttcaggc agagcagctg 240

ggtacgggtc atgcaatgca gcaggccgca cctttctttg ccgatgatga agacatttta 300

atgctctacg gcgacgtgcc gctgatctct gtcgaaacac tccagcgtct gcgtgatgct 360

aaaccgcagg gtggcattgg tctgctgacg gtgaaactgg atgatccgac cggttatgga 420

cgtatcaccc gtgaaaacgg caaagttacc ggcattgttg agcacaaaga tgccaccgac 480

gagcagcgtc agattcagga gatcaacacc ggcattctga ttgccaacgg cgcagatatg 540

aaacgctggc tggcgaagct gaccaacaat aatgctcagg gcgaatacta catcaccgac 600

attattgcgc tggcgtatca ggaagggcgt gaaatcgtcg ccgttcatcc gcaacgttta 660

agcgaagtag aaggcgtgaa taaccgcctg caactctccc gtctggagcg tgtttatcag 720

tccgaacagg ctgaaaaact gctgttagca ggcgttatgc tgcgcgatcc agcgcgtttt 780

gatctgcgtg gtacgctaac tcacgggcgc gatgttgaaa ttgatactaa cgttatcatc 840

gagggcaacg tgactctcgg tcatcgcgtg aaaattggca ccggttgcgt gattaaaaac 900

agcgtgattg gcgatgattg cgaaatcagt ccgtataccg ttgtggaaga tgcgaatctg 960

gcagcggcct gtaccattgg cccgtttgcc cgtttgcgtc ctggtgctga gttgctggaa 1020

ggtgctcacg tcggtaactt cgttgagatg aaaaaagcgc gtctgggtaa aggctcgaaa 1080

gctggtcatc tgacttacct gggcgatgcg gaaattggcg ataacgttaa catcggcgcg 1140

ggaaccatta cctgcaacta cgatggtgcg aataaattta agaccattat cggcgacgat 1200

gtgtttgttg gttccgacac tcagctggtg gccccggtaa cagtaggcaa aggcgcgacc 1260

attgctgcgg gtacaactgt gacgcgtaat gtcggcgaaa atgcattagc tatcagccgt 1320

gtgccgcaga ctcagaaaga aggctggcgt cgtccggtaa agaaaaagtg a 1371

<210> 5

<211> 1830

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 6

<211> 1017

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 6

atgagagttc tggttaccgg tggtagcggt tacattggaa gtcatacctg tgtgcaatta 60

ctgcaaaacg gtcatgatgt catcattctt gataacctct gtaacagtaa gcgcagcgta 120

ctgcctgtta tcgagcgttt aggcggcaaa catccaacgt ttgttgaagg cgatattcgt 180

aacgaagcgt tgatgaccga gatcctgcac gatcacgcta tcgacaccgt gatccacttc 240

gccgggctga aagccgtggg cgaatcggta caaaaaccgc tggaatatta cgacaacaat 300

gtcaacggca ctctgcgcct gattagcgcc atgcgcgccg ctaacgtcaa aaactttatt 360

tttagctcct ccgccaccgt ttatggcgat cagcccaaaa ttccatacgt tgaaagcttc 420

ccgaccggca caccgcaaag cccttacggc aaaagcaagc tgatggtgga acagatcctc 480

accgatctgc aaaaagccca gccggactgg agcattgccc tgctgcgcta cttcaacccg 540

gttggcgcgc atccgtcggg cgatatgggc gaagatccgc aaggcattcc gaataacctg 600

atgccataca tcgcccaggt tgctgtaggc cgtcgcgact cgctggcgat ttttggtaac 660

gattatccga ccgaagatgg tactggcgta cgcgattaca tccacgtaat ggatctggcg 720

gacggtcacg tcgtggcgat ggaaaaactg gcgaacaagc caggcgtaca catctacaac 780

ctcggcgctg gcgtaggcaa cagcgtgctg gacgtggtta atgccttcag caaagcctgc 840

ggcaaaccgg ttaattatca ttttgcaccg cgtcgcgagg gcgaccttcc ggcctactgg 900

gcggacgcca gcaaagccga ccgtgaactg aactggcgcg taacgcgcac actcgatgaa 960

atggcgcagg acacctggca ctggcagtca cgccatccac agggatatcc cgattaa 1017

<210> 7

<211> 1047

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 7

atgacgcaat ttaatcccgt tgatcatcca catcgccgct acaacccgct caccgggcaa 60

tggattctgg tttcaccgca ccgcgctaag cgcccctggc agggggcgca ggaaacgcca 120

gccaaacagg tgttacctgc gcacgatcca gattgcttcc tctgcgcagg taatgtgcgg 180

gtgacaggcg ataaaaaccc cgattacacc gggacttacg ttttcactaa tgactttgcg 240

gctttgatgt ctgacacgcc agatgcgcca gaaagtcacg atccgctgat gcgttgccag 300

agcgcgcgcg gcaccagccg ggtgatctgc ttttcaccgg atcacagtaa aacgctgcca 360

gagctcagcg ttgcagcatt gacggaaatc gtcaaaacct ggcaggagca aaccgcagaa 420

ctggggaaaa cgtacccatg ggtgcaggtt tttgaaaaca aaggcgcggc gatgggctgc 480

tctaacccgc atccgcacgg tcagatttgg gcaaatagct tcctgcctaa cgaagctgag 540

cgcgaagacc gcctgcaaaa agaatatttt gccgaacaga aatcaccaat gctggtggat 600

tatgttcagc gcgagctggc agacggtagc cgtaccgttg tcgaaaccga acactggtta 660

gccgtcgtgc cttactgggc tgcctggccg ttcgaaacgc tactgctgcc caaagcccac 720

gttttacgga tcaccgattt gaccgacgcc cagcgcagcg atctggcgct ggcgttgaaa 780

aagctgacca gtcgttatga caacctcttc cagtgctcct tcccctactc tatgggctgg 840

cacggcgcgc catttaatgg cgaagagaat caacactggc agctgcacgc gcacttttat 900

ccgcctctgc tgcgctccgc caccgtacgt aaatttatgg ttggttatga aatgctggca 960

gagacccagc gagacctgac cgcagaacag gcagcagagc gtttgcgcgc agtcagcgat 1020

atccattttc gcgaatccgg agtgtaa 1047

<210> 8

<211> 1149

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 8

atgagtctga aagaaaaaac acaatctctg tttgccaacg catttggcta ccctgccact 60

cacaccattc aggcgcctgg ccgcgtgaat ttgattggtg aacacaccga ctacaacgac 120

ggtttcgttc tgccctgcgc gattgattat caaaccgtga tcagttgtgc accacgcgat 180

gaccgtaaag ttcgcgtgat ggcagccgat tatgaaaatc agctcgacga gttttccctc 240

gatgcgccca ttgtcgcaca tgaaaactat caatgggcta actacgttcg tggcgtggtg 300

aaacatctgc aactgcgtaa caacagcttc ggcggcgtgg acatggtgat cagcggcaat 360

gtgccgcagg gtgccgggtt aagttcttcc gcttcactgg aagtcgcggt cggaaccgta 420

ttgcagcagc tttatcatct gccgctggac ggcgcacaaa tcgcgcttaa cggtcaggaa 480

gcagaaaacc agtttgtagg ctgtaactgc gggatcatgg atcagctaat ttccgcgctc 540

ggcaagaaag atcatgcctt gctgatcgat tgccgctcac tggggaccaa agcagtttcc 600

atgcccaaag gtgtggctgt cgtcatcatc aacagtaact tcaaacgtac cctggttggc 660

agcgaataca acacccgtcg tgaacagtgc gaaaccggtg cgcgtttctt ccagcagcca 720

gccctgcgtg atgtcaccat tgaagagttc aacgctgttg cgcatgaact ggacccgatc 780

gtggcaaaac gcgtgcgtca tatactgact gaaaacgccc gcaccgttga agctgccagc 840

gcgctggagc aaggcgacct gaaacgtatg ggcgagttga tggcggagtc tcatgcctct 900

atgcgcgatg atttcgaaat caccgtgccg caaattgaca ctctggtaga aatcgtcaaa 960

gctgtgattg gcgacaaagg tggcgtacgc atgaccggcg gcggatttgg cggctgtatc 1020

gtcgcgctga tcccggaaga gctggtgcct gccgtacagc aagctgtcgc tgaacaatat 1080

gaagcaaaaa caggtattaa agagactttt tacgtttgta aaccatcaca aggagcagga 1140

cagtgctga 1149

<210> 9

<211> 1641

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 9

atggcaatcc acaatcgtgc aggccaacct gcacaacaga gtgatttgat taacgtcgcc 60

caactgacgg cgcaatatta tgtactgaaa ccagaagcag ggaatgcgga gcacgcggtg 120

aaattcggta cttccggtca ccgtggcagt gcagcgcgcc acagctttaa cgagccgcac 180

attctggcga tcgctcaggc aattgctgaa gaacgtgcga aaaacggcat cactggccct 240

tgctatgtgg gtaaagatac tcacgccctg tccgaacctg cattcatttc cgttctggaa 300

gtgctggcag cgaacggcgt tgatgtcatt gtgcaggaaa acaatggctt caccccgacg 360

cctgccgttt ccaatgccat cctggttcac aataaaaaag gtggcccgct ggcagacggt 420

atcgtgatta caccgtccca taacccgccg gaagatggtg gaatcaaata caatccgcca 480

aatggtggcc cggctgatac caacgtcact aaagtggtgg aagacagggc caacgcactg 540

ctggccgatg gcctgaaagg cgtgaagcgt atctccctcg acgaagcgat ggcatccggt 600

catgtgaaag agcaggatct ggtgcagccg ttcgtggaag gtctggccga tatcgttgat 660

atggccgcga ttcagaaagc gggcctgacg ctgggcgttg atccgctggg cggttccggt 720

atcgaatact ggaagcgtat tggcgagtat tacaacctca acctgactat cgttaacgat 780

caggtcgatc aaaccttccg ctttatgcac cttgataaag acggcgcgat ccgtatggac 840

tgctcctccg agtgtgcgat ggcgggcctg ctggcactgc gtgataagtt cgatctggcg 900

tttgctaacg acccggatta tgaccgtcac ggtatcgtca ctccggcagg tttgatgaat 960

ccgaaccact acctggcggt ggcaatcaat tacctgttcc agcatcgtcc gcagtggggc 1020

aaagatgttg ccgtcggtaa aacgctggtt tcatctgcga tgatcgaccg tgtggtcaac 1080

gacttgggcc gtaaactggt agaagtcccg gtaggtttca aatggtttgt cgatggtctg 1140

ttcgacggca gcttcggctt tggcggcgaa gagagtgcag gggcttcctt cctgcgtttc 1200

gacggcacgc cgtggtccac cgacaaagac ggcatcatca tgtgtctgct ggcggcggaa 1260

atcaccgctg tcaccggtaa gaacccgcag gaacactaca acgaactggc aaaacgcttt 1320

ggtgcgccga gctacaaccg tttgcaggca gctgcgactt ccgcacaaaa agcggcgctg 1380

tctaagctgt ctccggaaat ggtgagcgcc agcaccctgg caggtgaccc gatcaccgcg 1440

cgcctgactg ctgctccggg caacggtgct tctattggcg gtctgaaagt gatgactgac 1500

aacggctggt tcgccgcgcg tccgtcaggc acggaagacg catataagat ctactgcgaa 1560

agcttcctcg gtgaagaaca tcgcaagcag attgagaaag aagcggttga gattgttagc 1620

gaagttctga aaaacgcgta a 1641

<210> 10

<211> 1650

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 10

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttct tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720

gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140

ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

Claims (6)

1.一种产乳酰-N-四糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ，并过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA、β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT和半乳糖激酶基因galK；所述基因工程菌利用pCDFDuet-1表达lgtA和wbgO，利用pETDuet-1表达galE、galT和galK；

所述lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述wbgO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述galE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述galT的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述galK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌在生产乳酰-N-四糖中的应用。

4.一种生产乳酰-N-四糖的方法，其特征在于，以乳糖和甘油为碳源，利用权利要求1或2所述的基因工程菌发酵生产乳酰-N-四糖。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养至OD₆₀₀为10~13，加入终浓度为15~25g/L乳糖、0~20 g/L半乳糖和0.2~1.0 mM的IPTG。

6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵条件为，培养温度为24~38℃，搅拌转速250~850 r/min，通气量0.8~1.2 vvm，pH 6.5~7.0。