CN111979168B - 一种提高乳酰-n-三糖ii产量的基因工程菌及生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高乳酰‑N‑三糖II产量的基因工程菌及生产方法，属于微生物基因工程领域。本发明通过组合调控乳酰‑N‑三糖II合成途径中glmM，glmU，glmS以及lgtA的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，敲除大肠杆菌宿主乳酰‑N‑三糖II合成途径中wecB，nagB和lacZ的表达，进一步提高乳酰‑N‑三糖II的产量，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑三糖II的能力由0.53g/L提升至4.82g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑三糖II的产量达到46.2g/L，具备工业应用的前景。

Description

一种提高乳酰-N-三糖II产量的基因工程菌及生产方法

技术领域

本发明涉及一种提高乳酰-N-三糖II产量的基因工程菌及生产方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中含量第三的固体组分，对于婴幼儿有益肠道菌群的生长以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，母乳寡糖的合成发挥着重要的作用。已经报道的母乳寡糖的种类有两百多种，主要分为三大类，唾液酸化，岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，并分别占比12％-14％，35％-50％和42-55％。其中占比最高的非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，主要包括乳酰-N-四糖(LNT)和乳酰-N-新四糖(LNnT)。大量文献集中报道这两种中性四糖对婴幼儿的健康具有明显的促进作用，因此受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。其中乳酰-N-新四糖已经允许添加进商品化婴幼儿配方奶粉中。但是目前四糖和新四糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。乳酰-N-三糖II(LNT II)，作为母乳寡糖普遍的核心骨架之一，也是乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖的直接前体物质，在合成两种四糖以及其他复杂母乳寡糖上具有重要意义。因此乳酰-N-三糖II的高效生产的方法急需开发，为生成更多有价值的母乳寡糖的合成奠定重要基础。

目前研究乳酰-N-三糖II合成的主要为化学合成，酶法和微生物合成方法均较少。酶法合成是较早尝试合成乳酰-N-三糖II的方法，并已有数十年的报道。初期，人源β-1,3-N-乙酰葡萄氨转移酶(β-1,3-GnT)被用来催化合成乳酰-N-三糖II使用乳糖作为受体，UDP-乙酰葡糖胺作为供体。随后，使用粗牛血清β-1,3-GnT为催化剂，市售UDP-乙酰葡糖胺和乳糖为底物，乳酰-N-三糖II的产量达到mmol规模。二十年前，发现脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的细菌β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)在合成含LNT的脂寡糖中发挥了作用。LgtA被广泛用在体内乳酰-N-三糖II的合成，一般利用内源性的UDP-乙酰葡糖胺和外源供给的乳糖分别作为供体和受体。最开始，Samain团队使用β-半乳糖苷酶阴性(lacZ-)大肠杆菌JM109菌株作为宿主，并增强了乳糖通透酶(LacY)的表达以在细胞内积累乳糖。外源引入脑膜炎奈瑟氏球菌LgtA以产生乳酰-N-三糖II，分批补料发酵的滴度为6g/L(Priem等，2002)。Albermann团队通过染色体整合构建了携带脑膜炎双球菌gtA基因的无质粒lacZ^-lacY⁺大肠杆菌菌株，以产生乳酰-N-三糖II，在培养瓶中的滴度为2.465g/L(

等人，2014和2015)。最近，通过对两个关键基因lgtA和lgtB(编码β-1,4-半乳糖基转移酶)进行染色体整合，改造了枯草芽孢杆菌以产生乳酰-N-新四糖(LNnT)，经过优化步骤后，工程菌株同时生产了乳酰-N-新四糖(LNnT)和乳酰-N-三糖II，在分批分批培养中的滴度分别为4.52-5.41和2.64-2.98g/L(Dong等人，2019年和2020年)。

相比于酶法合成，以微生物发酵法合成乳酰-N-三糖II更加高效和安全。但目前使用的微生物方法合成的乳酰-N-三糖II产量均较低，并不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产乳酰-N-三糖II的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为(a)或(b)或(c)：

(a)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；

(b)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；

(c)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB和β-半乳糖苷酶LacZ的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1。

在本发明的一种实施方式中，葡萄糖胺合成酶(GlmM)的编码基因为glmM，UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)的编码基因为glmU，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)的编码基因为glmS。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有载体pRSFDuet-1和/或pETDuet-1，所述载体上含有葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和/或β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有强调控的RBS，所述RBS用于调控目的基因的过表达。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pRSFDuet-1表达glmM和glmU-glmS基因，以pETDuet-1表达lgtA基因。

在本发明的一种实施方式中，将载体pRSFDuet-1上的核糖体结合位点替换为RBS29。

在本发明的一种实施方式中，核糖体结合位点RBS 29，RBS T7和RBS 31的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.5～7。

在本发明的一种实施方式中，所述glmM、glmU和glmS来源于大肠杆菌K-12(Escherichia coli k-12)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。

在本发明的一种实施方式中，β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因为lgtA。

在本发明的一种实施方式中，所述lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

本发明提供了一种构建所述重组大肠杆菌的方法，先在大肠杆菌基因组中敲除UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶、和/或β-半乳糖苷酶的编码基因，再利用表达载体，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因。

在本发明的一种实施方式中，利用pTargetF质粒敲除目的基因。

在本发明的一种实施方式中，将pTargetF质粒上的N20替换为与目的基因互补的N20序列。

在本发明的一种实施方式中，表达载体为pRSFDuet-1和/或pETDuet-1，所述重组大肠杆菌以pRSFDuet-1表达glmM和glmU-glmS基因，以pETDuet-1表达lgtA基因。

在本发明的一种实施方式中，将载体pRSFDuet-1上的核糖体结合位点替换为RBS29。

在本发明的一种实施方式中，核糖体结合位点RBS 29，RBS T7和RBS 31的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.5～7。

本发明提供了一种高效生产乳酰-N-三糖II的基方法，利用所述重组大肠杆菌发酵生产乳酰-N-三糖II。

在本发明的一种实施方式中，以乳糖为底物，以甘油作为碳源合成乳酰-N-三糖II。

在本发明的一种实施方式中，发酵40～60h。

本发明还要求保护所述重组大肠杆菌，或所述方法在制备乳酰-N-三糖II及其衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过组合调控乳酰-N-三糖II合成途径中glmM，glmU，glmS以及lgtA的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，敲除大肠杆菌宿主乳酰-N-三糖II合成途径中wecB，nagB和lacZ的表达，进一步提高乳酰-N-三糖II的产量，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰-N-三糖II的能力由0.53g/L提升至4.82g/L，在3L发酵罐中，乳酰-N-三糖II的产量达到46.2g/L，具备工业应用的前景。

附图说明

图1为乳酰-N-三糖II代谢通路图；

图2为产物乳酰-N-三糖II标样和产物样品液相图和质谱图；

图3为代谢通路在不同拷贝数质粒调节下的乳酰-N-三糖II的产量图；

图4为代谢通路在不同强度RBS调节下的乳酰-N-三糖II的产量图；

图5为不同敲除菌株发酵生产乳酰-N-三糖II的产量比较图；

图6为3L发酵罐中乳酰-N-三糖II的发酵产量结果图。

具体实施方式

以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。

菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，热击转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。

质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。

大肠杆菌感受态的制备：TAKARA试剂盒。

乳酰-N-三糖II发酵过程及检测：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。

发酵培养基：20g/L葡萄糖，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

(1)乳酰-N-三糖II发酵过程：将构建的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，将种子液以2mL/100mL的接种量接入25ml发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.2mM IPTG，同时加入10g/L乳糖，25℃，200rpm诱导培养48h。取1mL发酵液，10000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定；将菌体沉淀用1mL去离子水悬浮，10000rpm，离心10min，去上清。再用1mL超纯水悬浮菌体沉淀，煮沸10min，10000rpm，离心10min，取上清用于HPLC测定。

(2)HPLC检测条件：HPLC(Waters e2695)；色谱柱：Carbohydrate Analysiscolumn(Rezex ROA-organic acid H⁺(8％)300×7.8mm)；流动相：5mM H₂SO₄；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温60℃；进样量：10μL。

实施例1：构建重组载体

重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：

(1)glmM，glmU-glmS基因片段的获得：以大肠杆菌K-12(Escherichia coli)的基因组为模板，以glmM-F/glmM-R为引物，PCR扩增出glmM基因片段，胶回收DNA片段，通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1的第一个多克隆位点(MCS1)；再以glmUS-F/glmUS-R为引物，PCR扩增出glmU-glmS基因簇片段，胶回收DNA片段，通过kpnI单酶切，使基因连接到载体pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1的第二个多克隆位点(MSC2)，最终获得的质粒是pRSF-glmM-glmU-glmS，pCDF-glmM-glmU-glmS和pET-glmM-glmU-glmS；

(2)lgtA基因片段的获得：找出脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)lgtA基因序列，并委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，将合成后的基因片段通过酶切位点NcoI和EcoRI，分别连接在载体pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1上，最终获得的质粒为pRSF-lgtA，pET-lgtA和pCDF-lgtA。

表1质粒构建引物

实施例2：替换表达质粒上原始的核糖体结合位点

本发明除了表达质粒本身的核糖体结合位点(RBS T7)以外，另外选取了两个文献报道的不同强度的RBS(RBS 29和RBS 31)(不同RBS序列见表2)，本实施例中选择RBS 29(代表强调控)，RBS T7(代表中等调控)，和RBS 31(代表弱调控)来调控各个目的基因的蛋白翻译强度。

表2 RBS序列

以构建好的质粒pRSF-glmM-glmU-glmS和pET-lgtA作为模板，用引物29lgtA-F/R，31lgtA-F/R，29M-F/R，31M-F/R，29US-F/R，31US-F/R，获得相应的片段(引物序列见表3)，采用One Step Cloning Kit(Vazyme)试剂盒对片段进行组装，获得相应的重组质粒(质粒信息见表4)。再转化至大肠杆菌DH5α，涂板过夜培养，转接至4mL LB培养基过夜培养后抽取收取质粒并对其进行测序。

表3引物序列

表4质粒信息

实施例3：大肠杆菌BL21(DE3)染色体组基因的敲除

利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21中wecB，nagB，和lacZ，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表5)：

(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用wecB-up-F/R和wecB-down-F/R，nagB-up-F/R，nagB-down-F/R，lacZ-up-F/R和lacZ-down-F/R通过PCR分别扩增出wecB，nagB和lacZ的上下游片段，胶回收。再分别以wecB，nagB和lacZ上下游片段为模板，采用wecB-up-F/wecB-down-R，nagB-up-F/nagB-down-R和lacZ-up-F/lacZ-down-R引物通过重叠PCR得到完整的wecB，nagB和lacZ模板，胶回收DNA片段。

(2)以原始pTargetF质粒为模板，wecB-sg-F/R，nagB-sg-F/R和lacZ-sg-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与wecB，nagB和lacZ序列互补的N20序列，得到带有靶向wecB，nagB和lacZ的pTargetF质粒(构建的质粒见表6)。PCR产物采用DpnI去除模板DNA，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。

(3)取pCas质粒及大肠杆菌BL21感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5uL质粒加入100uL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴20min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mLLB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200uL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜至长出大肠杆菌BL21/pCas的单菌落。

(4)挑取大肠杆菌BL21/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为10mM/L的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21/pCas感受态。

(5)将100ng pTargetF质粒和400ng的供体DNA片段(即步骤1得到的wecB，nagB和lacZ的模板片段)，电转至步骤(4)的大肠杆菌BL21/pCas感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，PCR验证wecB、nagB和lacZ敲除效果，wecB、nagB和lacZ敲除的即为阳性克隆菌落。

(6)将步骤(5)得到的阳性克隆菌落挑至4ml LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和30mg/L卡那霉素，30℃培养8-16h，以去除pTargetF质粒，再在42℃培养12h，去除pCas质粒。利用相同的方法，将菌株中的nagB和lacZ敲除，得到相应的EW(ΔwecB)、EWN(ΔwecBΔnagB)、EWNL(ΔwecBΔnagBΔlacZ)三种大肠杆菌BL21敲除菌株。

表5引物序列

表6基因靶向质粒信息

实施例4：高效生产乳酰-N-三糖II宿主工程菌的筛选

(1)三种不同拷贝数重组质粒的筛选

质粒pRSFDuet-1具有较高的拷贝数，质粒pETDuet-1有中等的拷贝数，而质粒pCDFDuet-1具有较低的拷贝数。其中RSF，CDF和ColE1分别是表达质粒pRSFDuet-1，pETDuet-1和pCDFDuet-1的复制子，代表不同的拷贝数，三者的拷贝数分别为100，40和20。

通过实施例1所述步骤组合表达乳酰-N-三糖II合成通路中的四个关键的基因，得到了9个不同的工程菌，分别表示为E1～9。发酵后不同工程菌株乳酰-N-三糖II的产量分别为0.59g/L，2.06g/L，0.15g/L，1.64g/L，1.10g/L，1.22g/L，0.03g/L，2.64g/L和0.08g/L。其中含有重组质粒pRSF-glmM-glmU-glmS和pET-lgtA的工程菌(即菌株E8)获得了2.64g/L的最高产量(各工程菌株乳酰-N-三糖II产量参见图4)。因此，表达相对较高的基因剂量的大肠杆菌内源性基因glmM，glmU-glmS同时相对较低基因剂量的外源基因lgtA可以有更高的乳酰-N-三糖II产量。

(2)不同质粒的核糖体结合位点的选择

本发明在不同拷贝数质粒调控代谢通路的基础上进一步通过RBS强度的调控来调整蛋白质的翻译强度，从而发掘代谢通路的乳酰-N-三糖II的生产潜力。首先，选取RBS 29，RBS T7和RBS 31分别作为高中低表达强度的核糖体结合位点序列对目的基因进行微调。通过实施例2所述步骤将RBS 29，RBS T7和RBS 31分别替换到三组基因(glmM，glmU-glmS和lgtA)的核糖体结合位点上，最终得到了27种不同RBS控制下的菌株：E10-35(见表7)。乳酰-N-三糖II的产量检测的结果显示，上述菌株乳酰-N-三糖II的产量分别为3.2g/L，2.69g/L，2.63g/L，2.07g/L，2.04g/L，1.93g/L，1.91g/L，1.81g/L，1.66g/L，0.69g/L，0.63g/L，0.51g/L，0.45g/L，0.49g/L，0.37g/L，0.37g/L，0.32g/L，0.26g/L，0.23g/L，0.15g/L，0.15g/L，0.14g/L，0.12g/L，0.11g/L，0.09g/L，0.09g/L和0.07g/L。

可见由翻译强度相对较高的RBS 29调控大肠杆菌内源性的基因glmM和glmU-glmS，由翻译强度相对中等的的RBS T7控制外源基因lgtA获得最高的乳酰-N-三糖II胞外积累量。也即，含有重组质粒pRSF-[RBS 29]glmM-[RBS 29]glmU-glmS和pET-[RBS T7]lgtA的大肠杆菌宿主拥有最高产物积累量，达到3.2g/L(各工程菌株乳酰-N-三糖II产量参见图4)。

(3)敲除乳酰-N-三糖II合成途径中分解代谢基因为了增加乳酰-N-三糖II的合成效率，我们通过实施例3所述步骤采用CRISPR/Cas9系统敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wecB，从而阻断前体物质UDP-N-乙酰葡萄糖胺的无效转化，得到敲除菌株EW。进而敲除编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因nagB，阻断果糖-6磷酸的反向转化，得到敲除菌株EWN。在以上菌株基础上敲除编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ，使外源底物乳糖有效利用率增加，得到敲除菌株EWNL。转化最优质粒组合的基因进入以上敲除菌株中，产生菌株E10-W，E10-WN和E10-WNL。摇瓶发酵结果显示三种菌株产生的乳酰-N-三糖II分别为4.04，4.18和4.82g/L。从产量增加的比例来看，敲除lacZ增强乳糖的有效利用对乳酰-N-三糖II产量增加效果更显著。敲除以上三个基因共同促进乳酰-N-三糖II的生物合成。(各工程菌株乳酰-N-三糖II产量参见图5)。

表7各工程菌详细信息

实施例5：高效生产工程菌发酵罐生产乳酰-N-三糖II

为了进一步验证乳酰-N-三糖II合成方法的有效性，提高乳酰-N-三糖II的产量。将重组大肠杆菌E10-WNL种子液以10％的接种量接种到工作体积为2L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速800r/min，通气量1vvm，pH 7.0(补加氨水自动控制)。发酵14h(OD₆₀₀约为10)，加入终浓度为20g/L乳糖和终浓度为0.2mM的IPTG。期间自动补料甘油和乳糖，维持菌体的生长以及乳酰-N-三糖II的合成。培养整个过程达到60h后，菌体OD₆₀₀达到139，乳酰-N-三糖II的产量达到最高，达到46.2g/L。

表8发酵过程中菌浓和乳酰-N-三糖II合成量动态变化表

对比例

pfkA基因(NCBI登录号为NP_418351)的敲除，具体实施方式同实施例3，上下游扩增的引物为：pfkA-up-F/R和pfkA-down-F/R，再将上下游片段通过引物pfkA-up-F/pfkA-down-R，进行PCR，得到pfkA模板，并以原始pTargetF质粒为模板，利用引物pfkA-sg-F/R进行PCR，将原始质粒上的N20序列分别替换为与pfkA序列互补的N20序列，得到带有靶向pfkA的pTargetF质粒，测序验证后，转化至菌株EWN的感受态中，进行基因敲除，最终得到EWNP菌株(即菌种中敲除wecB，nagB和pfkA基因)。并将其应用于乳酰-N-三糖II的发酵过程。结果显示，敲除了pfkA基因之后，目标产物并没有提高，并且影响了菌株正常生长。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高乳酰-N-三糖II产量的基因工程菌及生产方法

<130> BAA200774A

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> Escherichia coli k-12

<400> 1

atgagtaatc gtaaatattt cggtaccgat gggattcgtg gtcgtgtagg ggatgcgccg 60

atcacacctg attttgtgct taagctgggt tgggccgcgg gtaaagtgct ggcgcgccac 120

ggctcccgta agattattat tggtaaagac acgcgtattt ctggctatat gctggagtca 180

gcactggaag cgggtctggc ggcagcgggc ctttccgcac tcttcactgg cccgatgcca 240

acaccggccg tggcttatct gacgcgtacc ttccgcgcag aggccggaat tgtgatatct 300

gcatcgcata acccgttcta cgataatggc attaaattct tctctatcga cggcaccaaa 360

ctgccggatg cggtagaaga ggccatcgaa gcggaaatgg aaaaggagat cagctgcgtt 420

gattcggcag aactgggtaa agccagccgt atcgttgatg ccgcgggtcg ctatatcgag 480

ttttgcaaag ccacgttccc gaacgaactt agcctcagtg aactgaagat tgtggtggat 540

tgtgcaaacg gtgcgactta tcacatcgcg ccgaacgtgc tgcgcgaact gggggcgaac 600

gttatcgcta tcggttgtga gccaaacggt gtaaacatca atgccgaagt gggggctacc 660

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gacggcgatg gcgatcgcgt gattatggtt gaccatgaag gcaataaagt cgatggcgat 780

cagatcatgt atatcatcgc gcgtgaaggt cttcgtcagg gccagctgcg tggtggcgct 840

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ggtagcggcg atccacttga gcatgagtca gttaaagccg tgaccgcaga ggttgaagct 1200

gcgctgggca accgtggacg cgtgttgctg cgtaaatccg gcaccgaacc gttaattcgc 1260

gtgatggtgg aaggcgaaga cgaagcgcag gtgactgaat ttgcacaccg catcgccgat 1320

gcagtaaaag ccgtttaa 1338

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> Escherichia coli k-12

<400> 2

atgttgaata atgctatgag cgtagtgatc cttgccgcag gcaaaggcac gcgcatgtat 60

tccgatcttc cgaaagtgct gcataccctt gccgggaaag cgatggttca gcatgtcatt 120

gatgctgcga atgaattagg cgcagcgcac gttcacctgg tgtacggtca cggcggcgat 180

ctgctaaaac aggcgctgaa agacgacaac cttaactggg tgcttcaggc agagcagctg 240

ggtacgggtc atgcaatgca gcaggccgca cctttctttg ccgatgatga agacatttta 300

atgctctacg gcgacgtgcc gctgatctct gtcgaaacac tccagcgtct gcgtgatgct 360

aaaccgcagg gtggcattgg tctgctgacg gtgaaactgg atgatccgac cggttatgga 420

cgtatcaccc gtgaaaacgg caaagttacc ggcattgttg agcacaaaga tgccaccgac 480

gagcagcgtc agattcagga gatcaacacc ggcattctga ttgccaacgg cgcagatatg 540

aaacgctggc tggcgaagct gaccaacaat aatgctcagg gcgaatacta catcaccgac 600

attattgcgc tggcgtatca ggaagggcgt gaaatcgtcg ccgttcatcc gcaacgttta 660

agcgaagtag aaggcgtgaa taaccgcctg caactctccc gtctggagcg tgtttatcag 720

tccgaacagg ctgaaaaact gctgttagca ggcgttatgc tgcgcgatcc agcgcgtttt 780

gatctgcgtg gtacgctaac tcacgggcgc gatgttgaaa ttgatactaa cgttatcatc 840

gagggcaacg tgactctcgg tcatcgcgtg aaaattggca ccggttgcgt gattaaaaac 900

agcgtgattg gcgatgattg cgaaatcagt ccgtataccg ttgtggaaga tgcgaatctg 960

gcagcggcct gtaccattgg cccgtttgcc cgtttgcgtc ctggtgctga gttgctggaa 1020

ggtgctcacg tcggtaactt cgttgagatg aaaaaagcgc gtctgggtaa aggctcgaaa 1080

gctggtcatc tgacttacct gggcgatgcg gaaattggcg ataacgttaa catcggcgcg 1140

ggaaccatta cctgcaacta cgatggtgcg aataaattta agaccattat cggcgacgat 1200

gtgtttgttg gttccgacac tcagctggtg gccccggtaa cagtaggcaa aggcgcgacc 1260

attgctgcgg gtacaactgt gacgcgtaat gtcggcgaaa atgcattagc tatcagccgt 1320

gtgccgcaga ctcagaaaga aggctggcgt cgtccggtaa agaaaaagtg a 1371

<210> 3

<211> 1830

<212> DNA

<213> Escherichia coli k-12

<400> 3

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 4

<211> 1005

<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis

<400> 4

atgggccagc cgctggttag cgttctgatc tgcgcgtaca acgttgaaaa atatttcgcg 60

cagagcctgg cagctgttgt taaccagacc tggcgtaacc tggacattct gatcgttgat 120

gatggctcta ccgatggcac cctggcgatc gcgcagcgtt tccaggaaca ggacggtcgt 180

atccgtattc tggcgcagcc gcgtaactct ggtctgattc caagcctgaa catcggcctg 240

gatgaactgg cgaaaagcgg cggtggtggt gaatacatcg cgcgtaccga tgcggatgat 300

atcgcagctc cggattggat tgaaaaaatc gttggtgaaa tggaaaaaga tcgtagcatc 360

atcgcaatgg gcgcttggct ggaagtgctg tccgaagaaa aagatggcaa ccgtctggca 420

cgtcaccacg aacacggtaa aatctggaaa aaaccgaccc gtcacgaaga catcgcggat 480

ttcttcccat tcggcaaccc gattcacaac aacaccatga tcatgcgtcg ttccgtgatc 540

gatggcggcc tgcgttacaa caccgaacgt gattgggcag aagactatca gttctggtat 600

gatgtttcta aactgggtcg tctggcgtac tacccggaag cgctggttaa ataccgtctg 660

cacgctaacc aggttagctc caaatatagc atccgccagc acgaaatcgc tcagggtatc 720

cagaaaaccg cacgtaacga tttcctgcag tctatgggtt tcaaaacccg tttcgatagc 780

ctggaatacc gtcagattaa agcggttgcg tatgaactgc tggaaaaaca cctgccggaa 840

gaagattttg aactggcgcg tcgtttcctg taccagtgct tcaaacgtac cgataccctg 900

ccggcgggcg cttggctgga tttcgcggcg gatggccgta tgcgtcgtct gttcaccctg 960

cgtcagtact tcggtatcct gcaccgtctg ctgaaaaacc gttaa 1005

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattcgt tcacacagga aacctataat g 31

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggaattcaa gaaggagata taatg 25

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggaattcgt cacacaggaa acctataatg 30

Claims (6)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，为(a)或(b)或(c)：

(a)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；

(b)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；

(c)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶和β-半乳糖苷酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；

以pRSFDuet-1表达葡萄糖胺合成酶的编码基因、以及UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因，以pETDuet-1表达β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因；所述葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因来源于大肠杆菌K-12；β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因来源于脑膜炎奈瑟球菌；将载体pRSFDuet-1上的核糖体结合位点替换为RBS 29。

2.构建权利要求1所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，先在大肠杆菌基因组中敲除UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶、和/或β-半乳糖苷酶的编码基因，再利用表达载体，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因，并表达β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因。

3.一种高效生产乳酰-N-三糖II的方法，其特征在于，利用权利要求1所述重组大肠杆菌发酵生产乳酰-N-三糖II。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以乳糖为底物，以甘油作为碳源，转化生产乳酰-N-三糖II。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵40～60h。

6.权利要求1所述重组大肠杆菌，或权利要求3～5任一所述方法在制备乳酰-N-三糖II中的应用。

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