CN115960812A - 一种高产l-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产L‑岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以高产2′‑岩藻糖基乳糖工程菌为宿主，通过游离表达α‑L‑岩藻糖苷酶得到分解效率更高的α‑L‑岩藻糖苷酶AcfA。针对L‑岩藻糖被竞争途径分解代谢的问题，敲除了鼠李糖异构酶基因rhaA，岩藻糖异构酶基因fucI和L‑岩藻糖激酶基因fucK。又将α‑L‑岩藻糖苷酶编码基因afcA整合至宿主基因组arsB位点，且使用强启动子P_J23119实现基因的启动表达。又通过改变IPTG和乳糖的添加量优化培养条件，最终摇瓶最高产量达到6.31g/L。分批补料培养条件下，在5L发酵罐中L‑岩藻糖的产量可达51.05g/L，是迄今报道的最高值，OD₆₀₀最高达到了144，在大规模工业应用中表现出显著的生产潜力。

Description

一种高产L-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产L-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)是一种天然的脱氧己糖，存在于多种生物中，是哺乳动物细胞产生的许多N-和O-连接的聚糖和糖脂的重要组成部分，是构成母乳寡糖(HMOs)的五种基本单糖之一，是母乳中高度丰富的非偶联聚糖。除此之外，L-岩藻糖还是植物和细菌细胞壁多糖的常见成分，是海藻多糖岩藻多糖的基本亚单位之一。L-岩藻糖具有多种生理作用，在肠道健康和疾病方面具有重要意义。此外，L-岩藻糖还能够调节脂质代谢和体重，作为抗肿瘤和免疫治疗的糖类调节剂。目前已有研究使用大鼠作为模型进行了L-岩藻糖的安全性评估，试验结果表明L-岩藻糖是非遗传毒性的，可作为食品工业中的功能性成分。

L-岩藻糖可以由廉价的单糖化学合成，但是化学合成具有耗时、不环保且产量低的缺陷。另外，可以通过从海藻中提取得到富含L-岩藻糖的岩藻多糖，岩藻多糖的酸水解和高效分离技术也可以有效地生产L-岩藻糖。利用L-岩藻多糖作为底物进行酶促反应，也可以得到L-岩藻糖，但是该方法中的底物L-岩藻多糖比产物L-岩藻糖更昂贵，因此无法投入实际的工业化生产中。目前，通过代谢工程微生物合成L-岩藻糖已受到关注，从用于2′-岩藻基乳糖合成的代谢工程大肠杆菌株的出发，使用外源添加的乳糖作为糖基受体合成2′-岩藻基乳糖，再进一步引入特异性的α-L-岩藻糖苷酶，将2′-岩藻基乳糖水解为L-岩藻糖和乳糖，但此方法目前研究报道的产量较低，经过168h的上罐发酵最高产量为16.7g/L，产率为0.1g/L/h，仍然无法实现L-岩藻糖的大规模工业化生产。

发明内容

作为极具前景的绿色合成策略，本发明利用代谢工程打造更高效的生产菌株是极有潜力的L-岩藻糖制备方式。基于目前报道的高产2′-岩藻糖基乳糖的菌株，引入了三种不同的α-L-岩藻糖苷酶，并通过基因敲除以及基因组整合的代谢工程方法构建工程菌株，以期得到高产的L-岩藻糖工程菌。

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产L-岩藻糖的重组大肠杆菌及其构建方法。

本发明选择了以一高产2′-岩藻糖基乳糖的工程菌作为改造菌株，该菌在BL21(DE3)宿主菌中进行了lacZ和wcaJ基因的敲除，利用pRSFDuet-1载体游离表达了gmd、wcaG、manB和manC，利用pETDuet-1载体游离表达了wbgL，使用来源于大肠杆菌K-12MG1655的rcsA、rcsB正转录调控因子对manA、manB、manC、gmd以及wcaG基因进行调控。且利用强启动子P_J23119启动基因组上manC-manB基因簇的表达，并在大肠杆菌的recA位点整合利用强启动子P_J23119启动表达的wbgL。从该菌株出发，利用pCDFDuet-1载体游离分别表达来源于两歧双歧杆菌的AfcA，土壤宏基因组筛选得到的Mfuc5或来源于ThermotogamaritimaMSB8的TmαFuc，即三种不同来源的α-L-岩藻糖苷酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示)，发现AfcA具有更强的2′-岩藻糖基乳糖的分解能力，且能得到更高产量的L-岩藻糖。之后又进一步敲除了在该工程菌中的L-岩藻糖分解代谢通路基因，即rhaA、fucI和fucK，并基于2′-岩藻糖基乳糖略有残留的实验现象，在arsB位点整合利用强启动子P_J23119启动表达的afcA(图1)。经过上述优化步骤后，在摇瓶培养中，工程菌株生产L-岩藻糖的产量为6.31g/L，在5L发酵罐中，L-岩藻糖的产量达到51.05g/L，产率达到0.76g/L/h，是迄今报道的最高值，表明其具有投入工业化生产的潜力。

本发明的第一个目的是提供一种生产L-岩藻糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌游离表达了α-L-岩藻糖苷酶编码基因，敲除或抑制鼠李糖异构酶编码基因rhaA、基因簇fucI-fucK，整合表达α-L-岩藻糖苷酶编码基因。

在一种实施方式中，在arsB位点整合表达α-L-岩藻糖苷酶编码基因。

在一种实施方式中，利用强启动子P_J23119启动表达α-L-岩藻糖苷酶编码基因。

在一种实施方式中，所述α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.3任一所示。

在一种实施方式中，所述α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pCDFDuet-1质粒为表达载体。

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体游离表达α-L-岩藻糖苷酶。

在一种实施方式中，所述arsB基因的GenBank号为NP_417959.4。

在一种实施方式中，所述鼠李糖异构酶RhaA的NCBI序列号为YP_026276.1。

在一种实施方式中，所述基因簇fucI-fucK编码岩藻糖异构酶FucI和L-岩藻糖激酶FucK。

在一种实施方式中，所述岩藻糖异构酶FucI的NCBI序列号为NP_417282.1，所述L-岩藻糖激酶FucK的NCBI序列号为NP_417283.2。

在一种实施方式中，所述鼠李糖异构酶编码基因rhaA的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，基因簇fucI-fucK的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述强启动子P_J23119的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为BWLWC，已公开于公开号为CN114874964A的中国专利申请文件中。

本发明的第二个目的是提供了一种生产L-岩藻糖的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌发酵生产L-岩藻糖。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/L甘油的发酵体系中，35～38℃，180～220rpm，培养至OD₆₀₀＝0.8±0.1，加入终浓度为0.05～1.0mMIPTG，同时加入终浓度为3～15g/L乳糖，25℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到含有20～40g/L甘油的发酵罐体系中，发酵体系的发酵温度35～38℃，搅拌转速100～800r/min，通气量2～8vvm，pH控制在6.8±0.2，发酵至OD₆₀₀12～16，加入终浓度为5～10g/L乳糖和终浓度为0.05～0.2mM的IPTG，在25～28℃下诱导培养不少于70h。

在一种实施方式中，在发酵罐体系反应过程中补加甘油，以维持甘油浓度不低于1g/L，且不超过10g/L。

在一种实施方式中，甘油采取一定速率的流加，在甘油不足时提高流加补料频率，在甘油过多时降低流加频率，以此来维持菌体的生长。

在一种实施方式中，在初始添加8g/L的乳糖作为2′-岩藻糖基乳糖的合成底物，2′-岩藻糖基乳糖又分解产生乳糖，因此乳糖作为运转底物，其浓度保持一定程度的稳定。

在一种实施方式中，所述发酵体系或发酵罐体系中还含有4.0g/L磷酸氢二氨，13.5g/L磷酸二氢钾，1.4g/L七水硫酸镁，1.7g/L柠檬酸和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：0.35g/L一水硫酸锰，10g/L硫酸亚铁，1.0g/L无水硫酸铜，2.25g/L七水硫酸锌，2.0g/L二水氯化钙，0.23g/L十水硼酸钠和0.11g/L钼酸铵。

本发明的第三个目的是提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一所示的α-L-岩藻糖苷酶在制备L-岩藻糖或含有L-岩藻糖的产品中的应用。

在一种实施方式中，以乳糖为底物，利用所述α-L-岩藻糖苷酶，生产L-岩藻糖。

本发明的第四个目的是提供了所述重组大肠杆菌在制备L-岩藻糖含有L-岩藻糖的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供了所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。

有益效果：

本发明以改造后的高产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌为出发菌株，通过表达三种不同来源的α-L-岩藻糖苷酶，并对L-岩藻糖的合成通路做了一系列代谢工程改造，最终得到的重组大肠杆菌在摇瓶发酵条件下L-岩藻糖产量达6.31g/L，分批补料培养条件下，发酵66.8hL-岩藻糖产量即可达51.05g/L，产率达到0.76g/L/h。

附图说明

图1为工程大肠杆菌中L-岩藻糖生物合成的代谢途径；

图2为重组大肠杆菌菌株的2′-岩藻糖基乳糖余量以及L-岩藻糖生物合成量的比较图。

具体实施方式

以下实施例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，热激转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:ALaboratoryManual(FourthEdition)进行。质粒和DNA产物的测序工作交予(苏州)金唯智完成。

(一)培养基

(1)LB液体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

(2)LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。

(3)发酵培养基：20g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

(4)发酵罐培养基：30g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。

(5)抗生素浓度：氨苄青霉素100mg/L(液体培养基)，氨苄青霉素200mg/L(固体培养基)，卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L。

(6)分批补料发酵补料液：甘油600g/L、七水硫酸镁20g/L和硫胺素0.2g/L。pH调控：14％氨水(v/v)。

(二)L-岩藻糖发酵

(1)L-岩藻糖摇瓶发酵过程：将构建的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8～1.0，加入终浓度为0.2mMIPTG，同时加入8g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。

(2)L-岩藻糖分批补料发酵过程：从平板上挑将菌株的菌落接种到含有氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素的4mLLB培养基中过夜培养，作为种子液，在经过摇瓶扩大培养后，进行5L发酵罐培养。分批补料发酵在含有1.5L培养基的5L发酵罐中进行。初始温度保持在37℃。最初培养基中的30g/L甘油完全耗尽后，开始流加补料碳源以满足细胞生长。当OD₆₀₀达到约14时，降温至25℃，并进行基因的诱导表达，同时加入乳糖作为底物。pH全程保持在6.8±0.2，并通过添加消泡剂控制泡沫。通过调节搅拌速度(100～900rpm)和通气量(2～8vvm)控制溶氧。

(三)L-岩藻糖检测：

取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

HPLC检测条件：通过高效液相色谱(HPLC)系统(Waterse2695)；色谱柱：RezexROA-OrganicacidH⁺(8％)；检测器：Waters2414RIDetector示差检测器；流动相：5Mm H₂SO₄；流速：0.6mL/min；柱温：60℃；进样量：10μL。

(四)质粒和菌株

双质粒基因编辑系统pEcCpf1/pcrEG已公开于文献：ZhuX,WuY,LvX.CombiningCRISPR–Cpf1andRecombineeringFacilitatesFastandEfficientGenomeEditinginEscherichia coli[J].ACSSyntheticBiology,2022(5):11.

表1下述实施例中涉及的菌株

(五)引物

表2下述实施例中所需引物

实施例1：重组菌株中L-岩藻糖代谢基因的敲除

利用CRISPR/Cpf1基因编辑系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)中编码鼠李糖异构酶RhaA(NCBI序列号为YP_026276.1)的基因rhaA，编码岩藻糖异构酶FucI(NCBI序列号为NP_417282.1)的基因fucI，编码岩藻糖异构酶FucK(NCBI序列号为NP_417283.2)的基因fucK，得到重组菌BHF。CRISPR/Cpf1基因编辑系统可参考文献ZhuX,WuY,LvX.CombiningCRISPR–Cpf1andRecombineeringFacilitatesFastandEfficientGenomeEditinginEscherichiacoli[J].ACSSyntheticBiology,2022(5):11.

(1)根据宿主菌中需要敲除的rhaA基因，合成含有rhaA基因的上下游同源片段的引物RhaA-F。

(2)采用PCR扩增技术将pcrEG上的N₂₃序列替换为与rhaA互补的N₂₃序列(CGCCGCCATGCTGTATGTGCCGC)，得到带有靶向rhaA的pcrEG质粒pcrEG-RhaA。PCR产物采用DpnⅠ酶去除模板DNA，使用热激转化法将其转入大肠杆菌JM109感受态中，再涂布于含壮观霉素的LB平板中37℃扩大培养提取质粒并测序。

(3)取pEcCpf1质粒转入大肠杆菌BWLWC(的化转感受态中，将转化好的菌液涂布于到含有卡那霉素的LB平板，在37℃培养箱中过夜培养，成为BWLWC-pEcCpf1。

(4)将BWLWC-pEcCpf1制备成为感受态细胞。

(5)将pcrEG-RhaA质粒和引物RhaA-F电转入大肠杆菌BWLWC-pEcCpf1的感受态细胞，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板，37℃培养24h，进行PCR菌落验证。

(6)将上述阳性克隆菌落挑至4mLLB液体试管(含有终浓度10mM的鼠李糖和2μLKan)，37℃培养12h去除pcrEG-RhaA质粒，得到重组大肠杆菌BWLWCΔrhaA用于下一轮的敲除。

(7)采用PCR扩增技术将pcrEG上的N₂₃序列进行替换为与fucI-fucK基因簇互补的N₂₃序列(CCGATGTGCGTACCTACTGGTCA)，得到带有靶向fucI-fucK基因簇的pcrEG质粒pcrEG-FucIK。

(8)将测序正确的pcrEG-FucIK质粒和含有同源片段的引物FucIK-F电转入重组大肠杆菌BWLWCΔrhaA感受态细胞，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板，37℃培养24h，进行PCR菌落验证。

(9)将步骤(8)的阳性克隆挑至4mLLB液体试管(含有终浓度10mM的鼠李糖和2μLKan)，37℃培养12h，去除pcrEG-FucIK质粒。将验证成功去除pcrEG-FucIK质粒的菌接种到含有5g/L葡萄糖的液体LB培养基中，在37℃，200rpm培养12h。之后取10μL左右的菌液划线在含5g/L葡萄糖和10g/L蔗糖的平板上37℃培养12h，由此去除pEcCpf1质粒后即得到成功敲除鼠李糖异构酶编码基因rhaA、岩藻糖异构酶编码基因基因fucI和岩藻糖异构酶编码基因fucK的重组大肠杆菌，命名为BHF。

实施例2：重组菌株α-L-岩藻糖苷酶的afcA基因的整合

利用CRISPR/Cpf1基因编辑系统在重组菌BHF基因组上arsB位点整合由强启动子P_J23119控制启动的编码α-L-岩藻糖苷酶(NCBI序列号为NP_417959.4)的afcA基因，得到重组菌BHFA，具体步骤如下：

(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用ArsB-J9-F/R，ArsB-DH-F/R引物(表2)，通过PCR分别扩增出arsB的上下游片段后使用胶回收纯化片段。

(2)再以合成的密码子优化后的afcA基因为模板，使用引物AfcA-F/R(表2)，通过PCR扩增出afcA基因片段后使用胶回收纯化片段。通过重叠PCR方式连接(1)和(2)中扩增得到的片段作为供体DNA片段。

(3)以pcrEG质粒为模板，采用PCR扩增将原始pcrEG质粒上的N₂₃序列替换为与arsB序列互补的N₂₃序列(arsB的N₂₃序列：TGCCAATGTGATTGGCTGCGATT)，得到带有靶向arsB的pcrEG质粒pcrEG-AfcA。

(4)利用电击转化法，将供体DNA片段和测序成功的pcrEG-AfcA转化到含有pEcCpf1的BHF的感受态细胞之中。

(5)阳性克隆去除pcrEG-AfcA质粒和pEcCpf1质粒后即成功得到在重组菌BHF基因组上arsB位点上整合了强启动子P_J23119控制启动的编码α-L-岩藻糖苷酶afcA基因的重组菌，命名为BHFA。

实施例3：生产L-岩藻糖的菌株的构建

合成密码子优化后的α-L-岩藻糖苷酶AfcA(来源于两歧双歧杆菌)，Mfuc5(土壤宏基因组筛选得到的)和TmαFuc(来源于ThermotogamaritimaMSB8的)的基因片段，分别连接至pCDFDuet-1的Ndel和Kpnl酶切位点之间，分别获得质粒pCD-AfcA、pCD-Mfuc5、pCD-TmαFuc。

将pCDFDuet-1原始质粒以及上述携带α-L-岩藻糖苷酶编码基因的质粒pCD-AfcA、pCD-Mfuc5、pCD-TmαFuc分别转入高产2′-岩藻糖基乳糖工程菌BWLWC中，得到工程菌BH-C、BH-A、BH-M和BH-T。

将实施例1和实施例2所构建得到的重组菌株BHF和BHFA作为宿主菌，分别导入pCDFDuet-1原始质粒和pCD-AfcA得到4个不同的工程菌株BHF-C、BHF-A、BHFA-C和BHFA-A。

实施例4：工程菌株发酵生产L-岩藻糖

(1)摇瓶发酵生产L-岩藻糖

将实施例3中构建的BH-C、BH-A、BH-M、BH-T、BHF-C、BHF-A、BHFA-C和BHFA-A工程菌株分别接种于含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.2mMIPTG，同时加入8g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。

结果如图2所示，发酵后三个α-L-岩藻糖苷酶中，AfcA显示出了对2′-岩藻糖基乳糖更强的分解能力，目标产物L-岩藻糖的产量更高。敲除了L-岩藻糖代谢途径rhaA，fucI和fucK三个基因后后产量又进一步增加。又因2′-岩藻糖基乳糖部分残留，因此将afcA基因整合到了基因组的arsB位点，与游离表达的pCD-AfcA共同作用，摇瓶培养72h可以达到6.10g/L的L-岩藻糖产量。

(2)优化IPTG浓度和乳糖浓度

使用不同浓度的IPTG对OD₆₀₀为0.8～1.0的摇瓶菌液进行诱导，分别设置为0.05、0.1、0.2、0.5、0.7和1.0mM；使用不同浓度的乳糖作为底物，分别设置为3、5、8、10和15g/L。将实施例3中构建的BHFA-A接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，取2mL种子液接入100mL发酵培养基，探究IPTG浓度和乳糖浓度对L-岩藻糖产量的影响，其他培养条件保持不变。

结果显示0.1mM的IPTG添加量和8g/L的乳糖添加量可获得更高的L-岩藻糖产量，摇瓶培养72h达到6.31g/L。

实施例5：发酵罐分批补料培养合成L-岩藻糖

选取菌株BHFA-A进行5L发酵罐的L-岩藻糖的分批补料发酵实验。

从菌株BHFA-A接种到含有氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素的4mLLB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到一级种子液，取1.5mL一级种子液接入150mL发酵培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀为0.8～1.0，得到二级种子液，取150mL二级种子液接种于含有1.5L发酵罐培养基的5L发酵罐中进行发酵培养。初始温度保持在37℃。最初培养基中的30g/L甘油完全耗尽后，开始流加补料碳源以满足细胞生长。当OD₆₀₀达到约14时，降温至25℃，并进行基因的诱导表达，同时加入终浓度8g/L的乳糖作为底物。pH全程保持在6.8±0.2，并通过添加消泡剂控制泡沫。通过调节搅拌速度(100～900rpm)和通气量(2～8vvm)控制溶氧。

在经过了66.8h的发酵后L-岩藻糖产量达到51.05g/L，OD₆₀₀最高达到了144。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种生产L-岩藻糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌游离表达了α-L-岩藻糖苷酶编码基因，敲除或抑制鼠李糖异构酶编码基因rhaA、基因簇fucI-fucK，整合表达α-L-岩藻糖苷酶编码基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在arsB位点整合利用强启动子P_J23119启动表达α-L-岩藻糖苷酶编码基因。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pCDFDuet-1质粒为表达载体。

6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BWLWC，已公开于公开号为CN114874964A的中国专利申请文件中。

7.一种生产L-岩藻糖的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌发酵生产L-岩藻糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法以甘油为碳源，以乳糖为底物。

9.核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一所示的α-L-岩藻糖苷酶在制备L-岩藻糖以及含有L-岩藻糖的产品中的应用。

10.权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。

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