CN112625995B

CN112625995B - 一种全细胞催化生产paps的方法

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Publication number: CN112625995B
Application number: CN202110039525.6A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 刘开放; 梁光杰; 高聪; 刘佳; 陈修来; 宋伟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN112625995A

Abstract

本发明公开了一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程技术领域。本发明在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。本发明将源于酿酒酵母的ATP硫化酶基因atps、源于产黄青霉菌的5’‑磷酸腺苷硫酸激酶基因apsk、源于大肠杆菌的无机焦磷酸水解酶酶基因ppa、源于谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶基因ppk，通过不同的载体表达不同的基因，在微生物细胞内的同时合成，得到重组菌。所述重组菌以ATP二钠盐为底物，利用重组菌进行全细胞催化生产PAPS，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。

Description

一种全细胞催化生产PAPS的方法

技术领域

本发明涉及一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是GAG硫酸转移酶催化肝素、硫酸软骨素等合成过程中直接的硫酸基供体。PAPS的生产方法包括发酵法和生物催化法。发酵法以细胞自身代谢途径为基础，通过引入外源基因实现从ATP到PAPS的合成。然而，在正常条件下，细胞内的ATP浓度较低，且其中绝大部分的ATP用于细胞自身的能量代谢，导致最终产量极低。而且发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。

目前，研究人员一般采用体外酶法制备PAPS。体外酶法催化制备PAPS主要包括两种方法：酰基磺酸转移酶催化3,5-二磷酸腺苷(PAP)合成PAPS、ATP硫酸化酶和APS激酶催化ATP制备PAPS。然而，3,5-二磷酸腺苷价格昂贵，酰基磺酸转移酶催化合成PAPS仅在实验室进行小规模试验，不适合工业化生产。ATP硫酸化酶和APS激酶催化存在酶纯化过程复杂，产物抑制等问题，导致PAPS规模化生产受限。目前商品化试剂PAPS采用酶法合成，价格非常昂贵(20559.40元/25mg，纯度仅60％)，远高于硫酸软骨素和肝素。因此，而还缺乏高效、简便、价格低廉的制备PAPS的方法。

发明内容

目前制备PAPS的方法还是局限于利用纯化后的酶进行转化，过程复杂、转化成本高，不利于PAPS的工业化制备。

为实现PAPS的高效合成，本发明在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。这不仅消除了反应副产物抑制，而且提高了底物利用效率。其次，通过提高细胞膜的通透性，实现全细胞转化生产PAPS。这种生产方式，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶(ATPS)、5’-磷酸腺苷硫酸激酶(APSK)、无机焦磷酸水解酶(PPA)、多聚磷酸激酶(PPK)同时在宿主菌中表达。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶来源于酿酒酵母；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶来源于产黄青霉菌；所述无机焦磷酸水解酶来源于大肠杆菌；所述多聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒状杆菌。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，利用pETDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pRSFDuet-1载体表达PPA和PPK

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pET Duet-1载体表达PPA和PPK。

在一种实施方式中，利用pRSFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pACYCDuet-1载体表达PPA和PPK。

在一种实施方式中，pACYCDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pET Duet-1载体表达PPA和PPK。

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pRSFDuet-1载体表达PPA和PPK。

在一种实施方式中，利用pETDuet-1载体表达ATPS和APSK，利用pACYCDuet-1载体表达PPA和PPK。

本发明提供了一种生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，以ATP为底物，利用所述重组菌全细胞转化生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸。

在一种实施方式中，底物ATP优选为ATP二钠盐。

在一种实施方式中，将重组菌培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，利用IPTG诱导10-15h后，收集菌体，在利用曲拉通对菌体处理20-40min。

在一种实施方式中，将曲拉通处理过后的菌体加入转化体系中，使其在转化体系中的浓度为15-30g/L。

在一种实施方式中，转化体系中底物浓度为40-80mM，或初始底物浓度为10-20mM。

在一种实施方式中，当底物浓度为10-20mM时，在反应过程中需进行补料50-60mM。

在一种实施方式中，底物浓度为10mM时，在反应第1～3h，每1h一次性补料浓度为10mM，后每2～3h一次性补料浓度为10mM，反应共消耗底物70mM。

在一种实施方式中，转化温度为30-45℃。

在一种实施方式中，转化体系中还含有10-20mM(NaPO₃)₆，100-150mM LiCl，50-100mM MgSO₄。

在一种实施方式中，转化体系初始pH为7.5。

在一种实施方式中，反应时间为13-16h。

本发明还提供了所述重组菌，或所述方法在制备3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸中的应用。

有益效果：本发明引入催化模块和辅酶模块，实现了四种酶在大肠杆菌中的同时表达，并且以此重组菌株实现了全细胞转化ATP生产PAPS。利用重组菌进行全细胞催化生产PAPS，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。与现有的技术相比，本发明产量高，且采用的方法反应条件温和，过程简单，便于后期的提取分离，适合工业化生产。

附图说明

图1为全细胞催化合成PAPS的合成路径示意图；

图2为12种重组菌株转化生产PAPS结果；

图3为菌体量对转化效率响图；

图4为底物浓度对转化效率响图；

图5为转化温度对转化效率响图；

图6为补料转化生产PAPS图。

具体实施方式

种子培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉3g，NaCl10g，蒸馏水定容。

发酵培养基：葡萄糖4g/L，胰蛋白胨24g/L，酵母膏12g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾16.4g/L。

实施例1：密码子优化与载体的构建

本发明所用的ATP硫化酶atps来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的、5’-磷酸腺苷硫酸激酶apsk源于产黄青霉菌(Penicillium Chrysogenum)的、无机焦磷酸水解酶酶ppa源于大肠杆菌(Escherichia coli)、多聚磷酸激酶基因ppk源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，分别进行密码子优化和人工合成，序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

构建催化模块表达载体：将atps和apsk的编码基因，分别连接至载体pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFDuet-1上，使得atps和apsk由T7启动子分别启动，构建四种双酶表达载体pACYCDuet-ATPS-APSK、pETDuet-ATPS-APSK、pRSFDuet-ATPS-APSK、pCDFDuet-ATPS-APSK。

构建辅酶模块表达载体：将ppa和ppk的编码基因，分别连接至载体pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFDuet-1上，使得ppa和ppk由T7启动子分别启动，构建四种双酶表达菌株pACYCDuet-PPA-PPK、pET Duet-PPA-PPK、pRSFDuet-PPA-PPK、pCDFDuet-PPA-PPK。

实施例2：重组大肠杆菌的构建

将实施例1中的4种主要催化模块和4种辅酶模块进行组合，组合结果如表1所示。将12种组合的双质粒组合转化到E.coli BL21(DE3)，挑取在LB抗性平板上生长的单菌落，进行菌落PCR验证，验证正确后送去测序，获得序列正确的转化表达宿主共12株，标号为1～12，具体菌株如表1所示。

表1双载体表达菌株的组合优化

实施例3：重组大肠杆菌诱导表达酶与菌体处理

将实施例2中的12种重组大肠杆菌从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，过夜培养，以5％(v/v)的接种量转接到50mL发酵培养基，37℃、200rpm/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.6mM的IPTG进行诱导，30℃下诱导12h后收集菌体，利用0.3mM曲拉通对活性细胞处理30min用于全细胞转化。

全细胞转化：以pH＝7.5的Tris-HCl溶液作为全细胞转化的介质，加入10mM(NaPO₃)₆，100mM LiCl，50mM MgSO₄，底物ATP二钠盐浓度为40mM，加入菌体15g/L，30℃转化10h，转化结束后测定转化效率。

如图2所示，菌株编号为5E-R(pETDuet-ATPS-APSK&pRSFDuet-PPA-PPK)的转化效率可达75.3％。

实施例4：全细胞转化生产PAPS条件的优化

以pH＝7.5的Tris-HCl溶液作为全细胞转化的介质，优化转化条件：

底物ATP二钠盐浓度为40mM时，加入不同浓度的菌体(10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L)，30℃转化10h，研究细胞浓度对转化的影响，最优细胞浓度为20g/L，PAPS产量达到16.78，转化率为83.93％，结果如图3所示。

当细胞浓度为20g/L时，分别在不同浓度ATP二钠盐(20mM、30mM、40mM、50mM、60Mm、70Mm、80Mm)条件下，30℃转化10h，考察底物浓度对产量的影响，最优的ATP二钠盐浓度为60mM，产量最大达到27.08M，转化率为90.27％，结果如图4所示。在最优菌体浓度和最优的底物浓度条件下，考察不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)对转化的影响，最优转化温度为35℃，发现此时最佳的转化时间为15h，产量最大可以达到28.83mM，转化率为96.12％，结果如图5所示随后产量不在增加，因此从经济的角度出发，设定最佳转化时间为15h。

实施例5：分批流加补料生产PAPS

为进一步提高产量，通过流加补料的方式优化催化过程。根据实施例3得到的优化后的转化条件进行全细胞催化，总反应体系1L。在反应过程中，发现保持投料总量不变的情况下，初始底物浓度与催化所用总时间成正比：底物10mM时，进行补料，需11.5h可将60mM的底物催化完成；底物20mM时，进行补料，需11.8h可将60mM的底物催化完成；底物30mM时，进行补料，需12.3h可将60mM的底物催化完成；底物40mM时，进行补料，需13.6h可将60mM的底物催化完成；底物50mM时，进行补料，需14.2h可将60mM的底物催化完成；底物60Mm时需15h将底物催化完成。

因此，为加快反应进行，控制初始底物浓度为10mM。在此基础上进行补料催化：第1～3h底物消耗速率较快，每1h一次性补料10mmol。随着催化的进行底物消耗速率降低，每2～3h一次性补料10mmol。整个反应周期共16h，反应总过程共消耗ATP 70mmol，转化率为97.8％，PAPS产量为34.23mM，结果如图6所示。

对比例1

具体实施方式参见实施例2，在E.coli BL21(DE3)中仅导入pETDuet-ATPS-APSK质粒，仅表达ATPS和APSK两个酶，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产PAPS，转化效率仅为62.78％。

在E.coli BL21(DE3)中仅导入pACYCDuet-ATPS-APSK质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产PAPS，转化率为47.23％。

在E.coli BL21(DE3)中仅导入pRSFDuet-ATPS-APSK质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产PAPS，转化率为52.61％。

在E.coli BL21(DE3)中仅导入pETDuet-ATPS-APSK质粒，得到阳性转化子，按照实施例3中的全细胞转化法，转化生产PAPS，转化率为61.03％。

对比例2

将所述的ATP硫化酶atps、5’-磷酸腺苷硫酸激酶apsk、无机焦磷酸水解酶ppa、多聚磷酸激酶基因ppk，分别连接至pACYCDuet、pETDuet、pRSFDuet、pCDFDuet，得到同时表达四种酶的重组质粒，将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，得到含有不同重组质粒的重组菌。按照实施例3中的方式，全细胞转化生产PAPS，结果由于导入质粒过多，菌体负载过重影响酶的表达，转化效率仅为9.7％～21.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种全细胞催化生产PAPS的方法

<130> BAA201594A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgccggcgc cgcacggtgg tatcctgcag gacctgatcg cgcgtgacgc gctgaaaaaa 60

aacgaactgc tgtctgaagc gcagtcttct gacatcctgg tttggaacct gaccccgcgt 120

cagctgtgcg acatcgaact gatcctgaac ggtggtttct ctccgctgac cggtttcctg 180

aacgaaaacg actactcttc tgttgttacc gactctcgtc tggcggacgg taccctgtgg 240

accatcccga tcaccctgga cgttgacgaa gcgttcgcga accagatcaa accggacacc 300

cgtatcgcgc tgttccagga cgacgaaatc ccgatcgcga tcctgaccgt tcaggacgtt 360

tacaaaccga acaaaaccat cgaagcggaa aaagttttcc gtggtgaccc ggaacacccg 420

gcgatctctt acctgttcaa cgttgcgggt gactactacg ttggtggttc tctggaagcg 480

atccagctgc cgcagcacta cgactacccg ggtctgcgta aaaccccggc gcagctgcgt 540

ctggaattcc agtctcgtca gtgggaccgt gttgttgcgt tccagacccg taacccgatg 600

caccgtgcgc accgtgaact gaccgttcgt gcggcgcgtg aagcgaacgc gaaagttctg 660

atccacccgg ttgttggtct gaccaaaccg ggtgacatcg accaccacac ccgtgttcgt 720

gtttaccagg aaatcatcaa acgttacccg aacggtatcg cgttcctgtc tctgctgccg 780

ctggcgatgc gtatgtctgg tgaccgtgaa gcggtttggc acgcgatcat ccgtaaaaac 840

tacggtgcgt ctcacttcat cgttggtcgt gaccacgcgg gtccgggtaa aaactctaaa 900

ggtgttgact tctacggtcc gtacgacgcg caggaactgg ttgaatctta caaacacgaa 960

ctggacatcg aagttgttcc gttccgtatg gttacctacc tgccggacga agaccgttac 1020

gcgccgatcg accagatcga caccaccaaa acccgtaccc tgaacatctc tggtaccgaa 1080

ctgcgtcgtc gtctgcgtgt tggtggtgaa atcccggaat ggttctctta cccggaagtt 1140

gttaaaatcc tgcgtgaatc taacccgccg cgtccgaaac agggtttctc tatcgttctg 1200

ggtaactctc tgaccgtttc tcgtgaacag ctgtctatcg cgctgctgtc taccttcctg 1260

cagttcggtg gtggtcgtta ctacaaaatc ttcgaacaca acaacaaaac cgaactgctg 1320

tctctgatcc aggacttcat cggttctggt tctggtctga tcatcccgaa ccagtgggaa 1380

gacgacaaag actctgttgt tggtaaacag aacgtttacc tgctggacac ctcttcttct 1440

gcggacatcc agctggaatc tgcggacgaa ccgatctctc acatcgttca gaaagttgtt 1500

ctgttcctgg aagacaacgg tttcttcgtt ttctaa 1536

<210> 2

<211> 636

<212> DNA

<213> Penicillium Chrysogenum

<400> 2

atgtctacca acatcacctt ccacgcgtct gcgctgaccc gttctgaacg taccgaactg 60

cgtaaccagc gtggtctgac catctggctg accggtctgt ctgcgtctgg taaatctacc 120

ctggcggttg aactggaaca ccagctggtt cgtgaccgtg gtgttcacgc gtaccgtctg 180

gacggtgaca acatccgttt cggtctgaac aaagacctgg gtttctctga agcggaccgt 240

aacgaaaaca tccgtcgtat cgcggaagtt gcgaaactgt tcgcggactc taactctatc 300

gcgatcacct ctttcatctc tccgtaccgt aaagaccgtg acaccgcgcg tcagctgcac 360

gaagttgcga ccccgggtga agaaaccggt ctgccgttcg ttgaagttta cgttgacgtt 420

ccggttgaag ttgcggaaca gcgtgacccg aaaggtctgt acaaaaaagc gcgtgaaggt 480

gttatcaaag aattcaccgg tatctctgcg ccgtacgaag cgccggcgaa cccggaagtt 540

cacgttaaaa actacgaact gccggttcag gacgcggtta aacagatcat cgactacctg 600

gactctaaag gttacctgcc ggcgaaaaaa gaataa 636

<210> 3

<211> 531

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgagcttac tcaacgtccc tgcgggtaaa gatctgccgg aagacatcta cgttgttatt 60

gagatcccgg ctaacgcaga tccgatcaaa tacgaaatcg acaaagagag cggcgcactg 120

ttcgttgacc gcttcatgtc caccgcgatg ttctatccat gcaactacgg ttacatcaac 180

cacaccctgt ctctggacgg tgacccggtt gacgtactgg tcccaactcc gtacccgctg 240

cagccgggtt ctgtgatccg ttgccgtccg gttggcgttc tgaaaatgac cgacgaagcc 300

ggtgaagatg cgaaactggt tgcggttccg cacagcaagc tgagcaaaga atacgatcac 360

attaaagacg ttaacgatct gcctgaactg ctgaaagcgc aaatcgctca cttcttcgag 420

cactacaaag acctcgaaaa aggcaagtgg gtgaaagttg aaggttggga aaacgcagaa 480

gccgctaaag ctgaaatcgt tgcctccttc gagcgcgcaa agaataaata a 531

<210> 4

<211> 921

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

atggttggta aactgccgat catggcggaa accaacgaaa acgacctgcc ggttatcgac 60

ctggcgcaga tcgaaggtta cgttgttgac gactctgacg aagacgaccc ggttctgctg 120

cgtccggacg gtaccccgat cgaaacctgg cgtgaagact tcccgtacga agaacgtgtt 180

acccgtgaag actacgaaaa agttaaacgt tctctgcaga tcgaactgct gaaatggcag 240

aactggacca aagaaaccgg tcagcgtcac atcatcctgt tcgaaggtcg tgacgcggcg 300

ggtaaaggtg gtaccatcaa acgtttcaac gaacacctga acccgcgtgg tgcgcgtacc 360

gttgcgctgg aaaaaccgtc tccgcgtgaa tctacctctt ggtacttcca gcgttacatc 420

cagcacttcc cggcggcggg tgaaatcgtt ttcttcgacc gttcttggta caaccgttct 480

ggtgttgaac gtgttatggg tttctgcacc gaatctcagc acgcggaatt cctgcgtgaa 540

gttccgatgc tggaaaacat gatcctgggt tctggtatct ctctgaccaa attctggttc 600

tctgttaccc gtaaagaaca gcgtacccgt ttcgcgatcc gtcaggttga cccggttcgt 660

cagtggaaac tgtctccgat ggacctggcg tctctggacc gttgggacga ctacacccgt 720

gcgaaagaag aacagttccg ttacaccgac accgacgaat ctccgtggat caccatcaaa 780

tctaacgaca aaaaacgtgc gcgtatcaac gcgatgcgtt acgttctgtc taaattcgac 840

tacaccgaca aagactacga actggttggt gaaccggacc cgaaagttgt tctgcgtggt 900

cgtgaccaga tcggtgacta a 921

Claims

1. 一种重组菌，其特征在于，在大肠杆菌利用pETDuet-1载体表达腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶和5’-磷酸腺苷硫酸激酶，并利用pRSFDuet-1载体表达无机焦磷酸水解酶、多聚磷酸激酶；所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因ATPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因APSK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因PPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因PPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，其特征在于，以ATP为底物，利用权利要求1所述的重组菌全细胞转化生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸；底物浓度为40-80 mM，温度为30-45℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组菌以15-30g/L的量加入转化体系中。

4. 一种生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，其特征在于，以ATP为底物，利用权利要求1所述的重组菌全细胞在30℃~45℃转化生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸；底物浓度为10-20 mM。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在反应过程中补料ATP 50-60mM。

6.权利要求1所述重组菌，或权利要求2-5任一所述方法在制备3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸中的应用。