CN117645985B - 一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体及其应用 - Google Patents
一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种乙酰氨基葡萄糖‑6磷酸磷酸酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明以来源于多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron VPI‑5482的乙酰氨基葡萄糖‑6磷酸磷酸酶为出发序列，通过突变位点的筛选及验证，发现了一种能够提高此酶的底物专一性和催化活力的突变体，将该突变体引入基因工程大肠杆菌中后进行发酵验证，发现N‑乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量最高可达224g/L，与转化突变前pET28a‑BT4131的对照菌株相比，发酵液中乙酰氨基葡萄糖浓度提高了49.3％，在工业生产上具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。
现如今微生物发酵法是国内外生产GlcNAc的主要方法。所使用的基因工程菌主要为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)。通过在这些菌株中引入氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)和氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶(GNA1)编码基因，以葡萄糖为原料，进行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。其中合成反应的最后一步为乙酰氨基葡萄糖-6磷酸的去磷酸化反应，由乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶将乙酰氨基葡萄糖-6磷酸转化为乙酰氨基葡萄糖。对乙酰氨基葡萄糖的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由于细胞自身的磷酸酶反应速度低于乙酰氨基葡萄糖-6磷酸的合成速度，乙酰氨基葡萄糖-6磷酸积累对细胞有毒性，会引起细胞生长抑制现象，造成了生产速率降低，不利于生产经济性。由此提出本发明。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过对来源于多形拟杆菌Bacteroidesthetaiotaomicron VPI-5482的乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶进行定点突变，得到其突变体，从而提高了此酶的底物专一性和催化活力，提高了大肠杆菌生产乙酰氨基葡萄糖的能力，同时提高了原料的转化率，具有重要的经济价值和社会意义。
本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体，以SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列为出发序列，筛选出三个突变位点：I49、L129、G172，并对其进行组合突变及发酵验证，淘汰负向结果，最终得到三个能提高产量及转化率的正向突变，所述突变为：
将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺(L129Q)；或
将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺(I49Q/L129Q)；或
将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第172位甘氨酸突变为亮氨酸(I49Q/L129Q/G172L)。
本发明的第二个目的是提供编码上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的核酸。
进一步地，最优突变体I49Q/L129Q/G172L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供携带上述核酸的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供表达上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
本发明的第五个目的是提供上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在制备乙酰氨基葡萄糖或含乙酰氨基葡萄糖的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种生产乙酰氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌异源表达了上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体。
进一步地，所述重组大肠杆菌还包括但不限于以下改造：敲除了甘露糖特异性EIIAB组分相关基因manXYZ、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagB、N-乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE、L-岩藻糖异构酶基因fucI、L-岩藻糖激酶基因fucK、乳酸脱氢酶基因ldhA和丙酮酸氧化酶基因poxB，强化表达了氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶基因GNA1和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS。
进一步地，以E.coli BL21(DE3)为出发菌株。
进一步地，以pET系列质粒为表达载体。
本发明的第七个目的是提供一种生产上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的方法，包括以下步骤：以含有野生型BT4131编码基因的质粒为模版，通过定点突变将野生型BT4131的基因进行突变，获得含有编码突变体基因的质粒，将该质粒转入大肠杆菌(如E.coli BL21(DE3))中，培养重组菌得到乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体。
本发明的第八个目的是提供一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：以乙酰氨基葡萄糖生产菌株为宿主，重组表达编码所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的基因，得到重组菌，采用所述重组菌进行发酵生产；或采用上述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体催化乙酰氨基葡萄糖-6磷酸生产乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，以葡萄糖为原料进行发酵生产。
进一步地，所述发酵为，将菌种接入种子培养基中培养，得到种子液，将种子液接入发酵培养基中，在温度30-37℃、pH6.0-8.0、溶氧量30％-40％下进行发酵，初始葡萄糖耗尽后流加葡萄糖，控制葡萄糖浓度在1g/L以下，培养至OD为20-30后进行诱导表达。
进一步地，流加的葡萄糖浓度为50％-90％(w/v)。
进一步地，在种子培养基中培养时的条件为：温度30-37℃、转速180-260rpm下培养6-10h。
进一步地，种子培养基的组分包括：胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉1-10g/L，NaCl 5-15g/L。
进一步地，发酵培养基的接种量为1％-10％。
进一步地，发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨10-15g/L，酵母粉20-30g/L，磷酸氢二钾10-15g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，甘油2-8g/L，葡萄糖1-10g/L。
本发明的有益效果：
本发明为了解决目前磷酸酶催化活力弱和底物专一性差，限制大肠杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的问题，提供了一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体。乙酰氨基葡萄糖-6磷酸去磷酸化反应是大肠杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的代谢途径中最后一步反应，通过在宿主中引入该突变体实现了基因工程菌中N-乙酰氨基葡萄糖的产量提高，N-乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量最高可达224g/L，与转化突变前pET28a-BT4131的对照菌株相比，发酵液中乙酰氨基葡萄糖浓度提高了49.3％。为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为含突变体的工程菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖的产量结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明所涉及的材料和方法：
(1)培养基
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖5。
灭菌条件：115℃，20min。
(2)N-乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相:5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。
(3)酶活测定：
对磷酸化底物的稳态动力学参数(Km和kcat)通过测量不同底物浓度(从1mM到80mM)下的初始反应速度来确定。蛋白质浓度采用A280法测定，吸光度测量使用Perkin-Elmerλ25UV-可见分光光度计进行。这些初始速度在50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中进行，其中包括有1μM酶，5mM MgCl2。80μL反应混合物加入96孔板，孔板在37℃、750rpm下震动孵育10分钟。使用SIGMA-ALDRICH的Malachite Green Phosphate Assay Kit(目录号MAK307)进行磷酸盐浓度检测，以混合液中磷酸盐浓度表示发生去磷酸化反应的底物的量。通过拟合Michaelis-Menten得到动力学参数Km和kcat。
实施例1定点突变
利用快速PCR技术，以表达有野生型BT4131的基因(氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2)的质粒pET28a-BT4131为模板，进行定点突变。
第129位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物：5’-AAAAAATTTTTTATGATTTTCAGCATGTGAACGTGATTCCGACCG-3’
反向引物：5’-AAAATCATAAAAAATTTTTTTCACCATTTCGTTCGGC-3’
PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max(购自Takara公司)25μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，加入双蒸水22μL。
PCR反应扩增条件为：98℃预变性5min；随后98℃10s，55℃15s，72℃3min进行30个循环，最后72℃保温5min。
将PCR产物加入Dpn I消化2h后，取6μL消化产物转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中。
大肠杆菌感受态细胞通过Competent Cell Preparation Kit(感受态细胞制备试剂盒，购自Takara公司)制作，制作方法参见试剂盒说明书。
质粒转化大肠杆菌感受态细胞方法如下：超低温冰箱保存的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化；加入6μL消化后的PCR产物轻轻混合，冰浴45min：将装有感受态细胞的离心管置于42℃的水浴中热激90s：将离心管转移至冰浴中使细胞冷却2min；加入800μL LB培养基于37℃培养1h；离心去除少量上请，再悬浮菌体，将培养液涂布在含有相应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养10～12h，观察菌落。挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。
得到的L129Q突变体质粒测序验证正确无误后以此质粒为模板，引入第49位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物：5’-TTTTTATTGCGACCGGCCGCCCGAAAGCGCAAATTAACAACCTGAGCGA ACTGCA-3’
反向引物：5’-GCGGCCGGTCGCAATAAAAA-3’
消化、转化后提取质粒测序验证。将验证正确的I49Q/L129Q突变体质粒作为模板，使用第172位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物：5’-CGCTGGTATCCGGCGTTTGC-3’
反向引物：5’-GCAAACGCCGGATACCAGCGCAGAATTTCGCAGGTCGGAATGCTC-3’
根据上述步骤，分别获得含有单突变体L129Q、双突变体I49Q/L129Q以及三突变体I49Q/L129Q/G172L的重组质粒。
实施例2酶活测定
将实施例1制备的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。重组菌在37℃的LB培养基中培养(包含10g/L的酵母膏、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)，并添加卡纳霉素(50μg/mL)。当OD600达到0.8-1.0时，加入终浓度为0.4mM的IPTG以诱导蛋白表达。在16℃孵育16小时后，收集细胞，进行两次洗涤，重悬于50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲液(pH7.0)中。细胞通过超声波破碎，并在4℃下以9000g的速度离心30分钟。
为了进一步纯化，粗酶溶液被加载到Ni-NTA(镍离子亲和层析)Superflow柱上，流速为1ml/min。未结合的蛋白质用洗涤缓冲液(50mM HEPES，50mM NaCl，50mM咪唑，pH 7.0)洗脱，目标蛋白质用洗脱缓冲液(50mM HEPES，50mM NaCl，200mM咪唑，pH 7.0)洗脱。
酶活数据如下表所示：
实施例3发酵验证
将实施例1制备的重组质粒分别转化入菌株E.coli BL21(DE3)-ΔmanXYZ-ΔnagABE-ΔfucIK-ΔldhA-ΔpoxB-GNA1-glmS中(已敲除manXYZ基因，nagABE基因，fucIK基因，ldhA基因和poxB基因，并且整合外源GNA1基因和强化glmS基因表达的E.coli BL21(DE3))中(宿主菌的具体构建方法参见专利CN202210116458.8)，进行发酵验证。
挑取转入突变后pET28a-BT4131质粒的目的菌株的单菌落于装有1.5L种子培养基的10L锥形瓶中培养，37℃、220rpm下培养8-9小时，按照10％接种量将培养好的种子液接入装有15L发酵培养基的30L发酵罐中，37℃、pH＝7下发酵，葡萄糖耗尽后开始流加800g/L的葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度在1g/L以下，维持DO值在30％-40％之间，DO值通过适当调整葡萄糖流加速度进行调节。培养至OD为26.6时加入0.4mmol/L IPTG诱导目的基因表达。诱导后继续培养72小时。
最终乙酰氨基葡萄糖产量最高达到224g/L，对葡萄糖转化率最高达到61％。与转化前的对照菌株相比，发酵液中乙酰氨基葡萄糖浓度提高了49.3％。(pET28a-BT4131转化前后菌株发酵过程中GlcNAc产量对比如图1所示)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体，其特征在于，通过对氨基酸序列如SEQID NO.1所示的乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶进行突变得到，所述突变为：
将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺；或
将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺；或
将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第172位甘氨酸突变为亮氨酸。
2.编码权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的核酸。
3.携带权利要求2所述核酸的重组质粒。
4.表达权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的宿主细胞。
5.权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体、权利要求2所述核酸、权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在制备乙酰氨基葡萄糖或含乙酰氨基葡萄糖的产品中的应用。
6.一种生产乙酰氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌异源表达了权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还包括以下改造：敲除甘露糖特异性EIIAB组分相关基因manXYZ、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagB、N-乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE、L-岩藻糖异构酶基因fucI、L-岩藻糖激酶基因fucK、乳酸脱氢酶基因ldhA和丙酮酸氧化酶基因poxB，强化表达氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶基因GNA1和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS。
8.一种生产权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：以含有野生型乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶编码基因的质粒为模版，通过定点突变将野生型的基因进行突变，获得含有突变体编码基因的质粒，将该质粒转入宿主细胞中，培养重组细胞得到乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体。
9.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：以乙酰氨基葡萄糖生产菌株为宿主，重组表达编码权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体的基因，得到重组菌，采用所述重组菌进行发酵生产；或采用权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶突变体催化乙酰氨基葡萄糖-6磷酸生产乙酰氨基葡萄糖。
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|---|---|
| CN (1) | CN117645985B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434585A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体 |
| CN107604025A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-01-19 | 江南大学 | 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 |
| CN110669708A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
| CN111893129A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-06 | 江南大学 | 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 |
| CN112760305A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-05-07 | 浙江工业大学 | 一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用 |
| CN112779278A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-11 | 江南大学 | 6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器及其在菌株筛选中的应用 |
| CN114250188A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-03-29 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
| WO2023000243A1 (zh) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | 深圳先进技术研究院 | 重组酵母生物转化生产葡萄糖的方法 |
| CN116710559A (zh) * | 2020-12-18 | 2023-09-05 | 因比奥斯公司 | 变体蔗糖渗透酶多肽 |
-
2023
- 2023-11-27 CN CN202311593867.8A patent/CN117645985B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434585A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体 |
| CN107604025A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-01-19 | 江南大学 | 一种提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 |
| CN110669708A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
| CN111893129A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-06 | 江南大学 | 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 |
| CN116710559A (zh) * | 2020-12-18 | 2023-09-05 | 因比奥斯公司 | 变体蔗糖渗透酶多肽 |
| CN112779278A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-11 | 江南大学 | 6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器及其在菌株筛选中的应用 |
| CN112760305A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-05-07 | 浙江工业大学 | 一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用 |
| WO2023000243A1 (zh) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | 深圳先进技术研究院 | 重组酵母生物转化生产葡萄糖的方法 |
| CN114250188A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-03-29 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cof-type HAD-IIB family hydrolase [Bacteroides thetaiotaomicron];NCBI;GenBank;20220831;WP_258894566.1 * |
| 吴涛 ; 冯歌林 ; 曾珍 ; 陈俊辉 ; 徐秋芳 ; 梁辰飞 ; .生物质炭对盆栽黑麦草生长的影响及机理.土壤学报.(02),全文. * |
| 生物质炭对设施连作土壤性质及黄瓜生长和产量的影响;张功臣;陈建美;赵征宇;李磊;秦玉红;王波;张守才;;土壤通报;20180606(03);全文 * |
| 调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成;马文龙;刘延峰;吕雪芹;李江华;刘龙;堵国成;;食品与生物技术学报;20200515(05);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117645985A (zh) | 2024-03-05 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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