CN113278655A - 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用 - Google Patents

生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113278655A
CN113278655A CN202010401422.5A CN202010401422A CN113278655A CN 113278655 A CN113278655 A CN 113278655A CN 202010401422 A CN202010401422 A CN 202010401422A CN 113278655 A CN113278655 A CN 113278655A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
microorganism
valine
dna fragment
homologous recombination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010401422.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113278655B (zh
Inventor
张学礼
郭恒华
刘萍萍
张冬竹
唐金磊
韩成秀
唐思青
刘树蓬
马延和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS, Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN202210084710.1A priority Critical patent/CN114457123B/zh
Priority to CN202010401422.5A priority patent/CN113278655B/zh
Priority to CN202210084699.9A priority patent/CN114457122B/zh
Priority to PCT/CN2020/137780 priority patent/WO2021227500A1/zh
Priority to EP20925003.4A priority patent/EP3929297A4/en
Priority to US17/603,008 priority patent/US20230072835A1/en
Publication of CN113278655A publication Critical patent/CN113278655A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113278655B publication Critical patent/CN113278655B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01009—Leucine dehydrogenase (1.4.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/01—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.6.1)
    • C12Y106/01002—NAD(P)+ Transhydrogenase (AB-specific) (1.6.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01023—NAD+ kinase (2.7.1.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生产L‑缬氨酸的重组微生物的构建方法，通过向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢酶基因，同时增强乙酰羟基还原异构酶和氨基酸脱氢酶的活性，能够提高大肠杆菌生产L‑缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧发酵L‑缬氨酸。

Description

生产L-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，所述构建方法 获得的重组微生物，具体是重组大肠杆菌，以及通过发酵法生产L-缬氨 酸的方法。
背景技术
L-缬氨酸作为三大支链氨基酸(Branched-chain amino acid，BCAA) 的一种，属于必需氨基酸，在人和动物中不能合成，只能通过从外界补 充获得。目前，L-缬氨酸被广泛用于食品和医药领域，主要包括食品添 加剂、营养增补液及风味剂等；广泛用于化妆品制备、以及用作抗生素 或者除草剂前体等；另外，随着对饲料质量和配比需求的提高，在未来L-缬氨酸在饲料添加剂行业中的作用将越来越重要，需求量会越来越大， 未来市场具有极大的潜力。微生物细胞可以直接合成L-缬氨酸，但胞内 大量反馈抑制等调控网络极大地限制了野生细胞的生产能力。要想获得 能够高效生产L-缬氨酸的发酵菌株，必须有效解除微生物细胞这些自我 调节机制。目前，世界范围内L-缬氨酸主要通过发酵法生产获得。用于发酵的生产菌株多通过诱变而来，出发菌株主要包括谷氨酸棒杆菌、黄 色短杆菌、黄色短杆菌等。陈宁等以黄色短杆菌为出发菌株，使用原生 质体紫外诱变并结合DES化学诱变的策略，筛选获得了一株L-缬氨酸 高产菌TV2564。但是，传统诱变获得的菌株具有很强的随机性，并且 遗传背景不清晰，副产物多，并且不容易进一步通过改造获得更加高产 的菌株。
近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过遗传改造获 得能够高效生产L-缬氨酸、遗传背景清晰、且易于培养的重组工程菌株 应运而生并取得了很好的效果。SangYup Lee课题组2007年从大肠杆菌 W3110出发，结合理性代谢工程、转录组分析和遗传改造、以及基因敲 除等手段获得了一株能够生产L-缬氨酸的工程菌。该菌株在好氧条件下批式培养(batch culture)可以生产缬氨酸但其培养过程中需要持续通氧， 且需添加L-异亮氨酸方能保证细胞正常生长。
谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了 L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制，同时整合大肠杆菌ppGpp3’-焦磷酸水 解酶的突变基因spo TM，增强了丙酮酸供应，增强了出发菌株VHY03 的摇瓶发酵生产L-缬氨酸的水平。
目前公开报道的L-缬氨酸发酵生产多是通过好氧或者两步法发酵 实现的。但是好氧工艺在生产过程中需要用空气，能耗很大；更关键的 是，有相当一部分碳源进入三羧酸循环(TCA)从而被用于细胞生长， 导致转化率比理论最大值要低很多。厌氧工艺和好氧相比，具有低能耗、 高转化率的优点，生产过程中不需要通空气，大大节约能耗；产品的转化率通常接近理论最大值。氨基酸生产的厌氧发酵最早是在丙氨酸生产 过程中实现的，目前其他氨基酸的生产暂未有纯厌氧发酵工艺的报道。 此外，目前工程菌改造过程中关键基因的过表达都是通过在质粒上实现 的，这就导致发酵过程中需要添加抗生素维持质粒存在，增加了生产成 本并存在在产业化生产中质粒丢失的风险。
因此，本领域仍需要提供稳定、高产、节能、简便的生产L-缬氨酸 的重组微生物以及相应的L-缬氨酸的生产制备方法。
发明内容
本发明发现，原增强乙酰羟基还异构酶和/或氨基酸脱氢酶的活性， 能够提高大肠杆菌生产L-缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧 发酵L-缬氨酸。
本发明的第一个方面，是提供一种L-缬氨酸的重组微生物的构建方 法，经该方法获得的重组微生物具有稳定遗传背景、且具备平衡的L- 缬氨酸还原力，适宜一步法厌氧发酵。
在本申请中，酶的活性“增强”是指提高微生物中有相应的DNA编 码的一种或多种酶的胞内活性，增强活性可以通过本领域已知的任何合 适方法实现，例如通过过表达，包括但不限于提高所述基因或等位基因 的拷贝数，修饰指导或控制基因表达的核苷酸序列，使用强启动子或使 用蛋白质活性或浓度一般比起始微生物水平提高10％-500％。
在一个实施方式中，向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因或/ 和氨基酸脱氢酶基因，使得所述酶活性增强。
在一个实施方式中，本发明导入的乙酰羟基酸还原酶基因和氨基酸 脱氢酶基因对于被导入的微生物而言是外源的。所述乙酰羟基酸还原酶 基因和氨基酸脱氢酶基因可以是来自任何微生物例如乳球菌、芽孢杆菌 等的相应基因。
在一个实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢 酶基因是NADH依赖型的。
厌氧条件下细胞产生的还原力类型大部分是NADH，为实现在厌氧 条件下高效生产L-缬氨酸，须解决辅因子不平衡问题。本发明一个实施 方式中选择NADH依赖型的乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢 酶基因能够使得厌氧条件下过剩的NADH得到消耗，解决厌氧发酵时还 原力平衡的问题。
在一个实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是ilvC或KARI； 所述氨基酸脱氢酶基因是亮氨酸脱氢酶基因。
在一个优选的实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是KARI， 所述亮氨酸脱氢酶基因是leuDH。
所述乙酰羟酸异构还原酶基因和氨基酸脱氢酶基因可以以本领域已 知的任何合适方式，例如以质粒形式，或者整合入基因组中的形式存在 与所述微生物中。在一个实施方式中，所述整合入基因组中的酶编码基 因置于合适的调控元件的控制下。
所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93人工调控元件或 RBS5人工调控元件；
在一个实施方式中，M1-46人工调控元件调控ilvC基因。
在一个实施方式中，M1-93人工调控元件调控leuDH基因；
在一个实施方式中，RBS5人工调控元件调控KARI基因。
在一个实施方式中，本发明还包括对上述重组微生物的以下酶基因 中的一种或几种进行如下改造，以使得这些酶的活性降低或失活。
(1)敲除甲基乙二醛合酶(mgsA)基因；
(2)敲除乳酸脱氢酶(ldhA)基因；
(3)敲除磷酸乙酰转移酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)基因；
(4)敲除丙酸激酶(tdcD)和/或甲酸乙酰转移酶(tdcE)基因；
(5)敲除醇脱氢酶(adhE)基因；
(6)敲除富马酸还原酶(frd)和/或丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基 因。
本领域技术人员能够理解，可以用现有技术已知的方式进行基因敲 除，使得所述酶的活性被降低或失活。所述的敲除操作针对的是出发微 生物内源性的酶基因，使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。
还可以通过同源重组等基因工程的方式，以另一基因的编码序列取 代上述(1)-(6)中所述酶基因的编码序列，从而使得微生物的上述内 源性酶活性降低或失活。替代这些内源性酶的基因可以是待增强表达的 基因，如上述的ilvC基因、KARI基因或leuDH基因。
在一个实施方式中，还包括增强本发明的重组微生物中的乙酰乳酸 合成酶(AHAS)和/或二羟酸脱水酶(ilvD)的活性。
在一个优选地实施方式中，AHAS选自ilvBN、ilvGM或ilvIH，它 们中至少一种酶的活性被增强。在一个优选地实施方式中，AHAS的活 性通过解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制得到增强，例如通过突变ilvH基 因解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制。
就涉及L-缬氨酸生物合成的乙酰羟酸合成酶而言，除了同功酶Ⅱ(这 里也称为AHASⅡ)，还知道有同功酶Ⅲ(这里也称为AHASⅢ)。AHASⅢ 由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基(催化亚基)的ilvI和编码小 亚基(控制亚基)的ilvH组成。AHASⅢ受L-缬氨酸的反馈抑制。可采用 已报道的方法突变ilvI基因，例如ilvH 14Gly→Asp的氨基酸取代(Vyazmensky,M.等，《生物化学》35:10339-10346(1996))和/或ilvH 17Ser→Phe(US6737255B2)；以及ilvH612(De Felice等，《细菌学杂志》 120:1058-1067(1974))等。
在一个实施方式中，本发明的重组微生物中的二羟酸脱水酶(ilvD) 的活性被增强，例如通过向微生物中导入ilvD基因增强ilvD的活性。
增强AHAS和/或二羟酸脱水酶(ilvD)的活性，任选地结合上述(1) -(6)任一项或几项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(2)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(6)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(2)项和第(5)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(1)项、第(3)-(6)项改造进行操 作。
在一个实施方式中，结合第(1)-(6)项改造进行操作。
在一个实施方法中，任选地，以ilvC基因替换微生物内源性的mgsA 基因来实现第(1)项敲除。
在一个实施方式中，以ilvD基因替换微生物内源性的pflB基因， 和/或以leuDH基因替换微生物内源性的frd基因来实现第(6)项敲除。
在一个优选地实施方式中，以KARI基因替换微生物内源性的adhE 基因来实现第(5)项敲除。
所述替换可以本领域技术人员已知的方式，将待插入的基因的编码 序列整合到所述微生物染色体中被替换的基因编码序列位点，使得原位 点基因编码序列被整合插入的基因的编码序列所取代。
优选地，KARI、ilvC、ilvD和leuDH的替换同时发生，其中ilvC 基因可任选的被再次敲除。
在一个实施方式中，所述的微生物为大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述的微生物为大肠杆菌ATCC 8739。
在一个实施方式中，使用至少一个调控元件调控上述涉及的酶的基 因。
在一个实施方式中，所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93 人工调控元件或RBS5人工调控元件。
在一个实施方式中，M1-46人工调控元件调控ilvC基因。
在一个实施方式中，M1-93人工调控元件调控ilvD、leuDH、ilvBN 和ilvGM基因。
在一个实施方式中，RBS5人工调控元件调控KARI基因。
调控元件可通过已知的基因工程方法插入ilvC基因的上游。所述方 法包括但不限于以基因重组的方式，例如以同源重组的方式调控元件的 序列插入目标酶的基因编码序列上游，以增强目标基因表达的强度。
在一个实施方式中，其中所述酶编码基因和所述的调控元件整合入 所述微生物的基因组中。
在一个实施方式中，将包含所述述酶编码基因和所述的调控元件序 列的质粒导入所述微生物中。
在一个实施例中，以整合入所述微生物的基因组的方法完成目标酶 基因的导入、突变或敲除。
在一个实施例中，以同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变 或敲除。
在一个实施例中，以两步同源重组的方法完成所述酶基因的导入、 突变或敲除。
可采用本领域已知的同源重组系统，如大肠杆菌RecA重组系统， Red重组系统进行同源重组以实现目标基因的导入、突变或敲除。
以两步同源重组的方法导入、突变或敲除目标基因包括如下步骤 (以大肠杆菌为例)：
(1)DNA片段I的制备：以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用扩增引物1扩增出 DNA片段I，用于第一步同源重组；
(2)第一步同源重组：将pKD46质粒(Datsenko and Wanner 2000, Proc NatlAcadSci USA 97:6640-6645)转化至大肠杆菌，然后将DNA片 段I转至pKD46的大肠杆菌，使用检测引物1验证转化的菌并挑选菌落；
(3)DNA片段II的制备：以出发大肠杆菌为模板，用扩增引物2 扩增出DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。
(4)第二步同源重组：将DNA片段II转化至步骤(2)挑选获得 的菌落；使用检测引物2验证转化的菌并挑选菌落。
本发明的第二个方面，是提供了一种利用上述构建方法得到的用于 生产L-缬氨酸的重组微生物，具体是一种重组大肠杆菌，其包含乙酰羟 酸异构还原酶和/或氨基酸脱氢酶基因，
在一个实施方式中，采用大肠杆菌ATCC 8739作为出发菌株，通过基因 同源重组实现胞内辅因子NADH供给和细胞生长的偶联，从而实现厌氧 条件下细胞生长和L-缬氨酸生产的偶联(附图1)。
在一个实施方式中，利用上述构建方法得到的重组大肠杆菌，进一 步经过代谢进化，经过例如50代、70代、80代、90代、100代、120 代获得了高产L-缬氨酸的重组大肠杆菌。在一个实施方式中，经105 代代谢进化获得了一株产L-缬氨酸的重组大肠杆菌，其于2020年3月6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏单位 位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC 19458，分 类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
本发明的第三方面，是上述方法获得的重组微生物在生产L-缬氨酸 中的应用。
本发明的第四方面，是利用上述构建获得的重组微生物发酵生产L- 缬氨酸的方法，包括：(1)发酵培养构建获得的重组微生物；(2)分离 并收获L-缬氨酸。
在一个实施方式中，所述发酵培养为厌氧发酵培养。
在一个实施方式中，所述厌氧发酵包括如下步骤：
(1)种子培养：挑取平板上的克隆接种到种子培养基中，37℃， 振荡培养，获得种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液接种于发酵培养基，37℃，150rpm， 发酵2～4天，得到发酵液。控制发酵罐的pH在7.0。培养过程不通任何 气体。
其中种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O2g/L。
发酵培养基和种子培养基成分相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50 g/L。
本发明的有益效果：
(1)相对于之前的生产方法和菌株，本发明实现了一步法厌氧发 酵生产L-缬氨酸，降低了生产成本、提高了转化率。
(2)本发明优选对重组微生物的基因组而非以质粒形式构建稳定 遗传的L-缬氨酸生产菌株，不需要额外添加抗生素和诱导剂等物质，生 产工艺稳定易操作。
(3)通过代谢进化方式，提高了重组微生物的L-缬氨酸的产量和 转化率以及细胞耐受性。
附图说明
图1：L-缬氨酸合成途径
图2：高效液相色谱测定L-缬氨酸的标准品
图3：高效液相色谱测定Sval064菌株发酵液组分
图4：代谢进化发酵培养获得Sval065菌株
图5：高效液相色谱测定L-缬氨酸的标准品
图6：高效液相色谱测定Sval065菌株发酵液组分
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当 理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要 求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以 清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的 前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改 变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下 述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本研究中所构建的菌株和质粒详见表1，所用引物详见表2。
表1本发明所用的菌株和质粒
Figure BDA0002489612930000091
Figure BDA0002489612930000101
Figure BDA0002489612930000111
表2本发明所用的引物
Figure BDA0002489612930000112
Figure BDA0002489612930000121
Figure BDA0002489612930000131
Figure BDA0002489612930000141
实施例1：ATCC 8739菌株中甲基乙二醛合酶编码基因mgsA的敲除 从大肠杆菌ATCC 8739出发，采用两步同源重组的方法敲除甲基乙 二醛合酶编码基因mgsA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物mgsA-cs-up/ mgsA-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：Phusion 5X缓冲液(NewEngland Biolabs)10μl、 dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总 体积为50μl。
扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃ 退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒-(购 买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化 法转化至大肠杆菌ATCC 8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌ATCC 8739。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC 8739的 电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片 段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅 速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm， 30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml) 和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌 落进行PCR验证，所用引物XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down，正确的菌落 扩增产物为3646bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval001。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的基因组DNA为模板，用 引物XZ-mgsA-up/mgsA-del-down扩增出566bp的DNA片段II。DNA 片段II用于第二次同源重组。扩增条件和体系同第一步中所述。将DNA 片段II电转至菌株Sval001。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Sval001的电转化感受态 细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放 置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad 公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mlLB培养基 转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。 将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶 中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB 固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-mgsA-up/mgsA-del-down，正确的菌落扩增产物为1027bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval002。
实施例2：乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除
从Sval002出发，通过两步同源重组的方法敲除乳酸脱氢酶编码基 因ldhA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ldhA-cs-up/ ldhA-cs-dwon扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I电转至 Sval002。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval002，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval002。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，正确的PCR 产物应该3448bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval003。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-ldhA-up/ldhA-del-down扩增出476bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval003。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为829bp的片段，挑 选一个正确的单菌落，将其命名为Sval004。
实施例3：磷酸乙酰转移酶编码基因pta和乙酸激酶编码基因ackA的敲 除
从Sval004出发，通过两步同源重组的方法敲除磷酸乙酰转移酶编码 基因pta和乙酸激酶编码基因ackA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 ackA-cs-up/pta-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同 源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval004。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval004，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval004。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行验证，正确的PCR 产物应该3351bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval005。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-ackA-up/ackA-del-down扩增出371bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval005。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-ackA-up/XZ-pta-down，正确的菌落扩增产物为732bp的片段，挑选 一个正确的单菌落，将其命名为Sval006。
实施例4：丙酸激酶编码基因tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE的 敲除
从Sval006出发，通过两步同源重组的方法敲除丙酸激酶编码基因 tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 tdcDE-cs-up/tdcDE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval006。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval006，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval006。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-tdcDE-up/XZ-tdcDE-down进行验证，正确的 PCR产物应该4380bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval007。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-tdcDE-up/tdcDE-del-down扩增出895bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval007。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-tdcDE-up/ XZ-tdcDE-down，正确的菌落扩增产物为1761bp的片段，挑选一个正 确的单菌落，将其命名为Sval008。
实施例5：醇脱氢酶基因adhE的敲除
从Sval008出发，通过两步同源重组的方法敲除醇脱氢酶基因adhE， 具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物adhE-cs-up /adhE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。 扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval008，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval008。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行验证，正确的PCR 产物应该3167bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval009。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-adhE-up/adhE-del-down扩增出271bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval009。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-adhE-up/XZ-adhE-down，正确的菌落扩增产物为548bp的片段，挑 选一个正确的单菌落，将其命名为Sval010。
实施例6：乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC在甲基乙二醛合酶编码 基因mgsA位点的整合
从Sval010出发，通过两步同源重组的方法将来自大肠杆菌的乙酰 羟基酸还原异构酶编码基因ilvC整合到甲基乙二醛合酶编码基因mgsA 位点，具体步骤包括：
第一步，在Sval010菌株中mgsA位点整合cat-sacB片段，cat-sacB 片段的PCR、整合、验证同实施例1中mgsA基因敲除的第一步完全一 致，获得的克隆命名为Sval011。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 mgsA-ilvC-up/mgsA-ilvC-down扩增出1576bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval011。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down，正确的菌落扩增产物为2503bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval012。
实施例7：乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC的调控
从Sval012出发，使用人工调控元件调控整合在甲基乙二醛合酶编 码基因mgsA位点的乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC的表达，具体 步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 mgsA-Pcs-up/mgsA-Pcs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一 步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片 段I电转至Sval012。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval012，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval012。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-mgsA-up/ilvC-YZ347-down进行验证，正确的 PCR产物应该3482bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval013。
第二步，以M1-46(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物 mgsA-P46-up/ilvC-P46-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval013。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-mgsA-up/ilvC-YZ347-down，正确的菌落扩增产物为951bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval014。
实施例8：二羟酸脱水酶编码基因ilvD的整合
从Sval014出发，通过两步同源重组的方法将来自大肠杆菌的二羟 酸脱水酶编码基因ilvD整合到丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB位点并替 换掉pflB基因，即在整合ilvD的同时敲除pflB基因，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 pflB-CS-up/pflB-CS-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval014。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval014，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval014。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down进行验证，正确的 PCR产物应该3675bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval015。
第二步，以大肠杆菌MG1655(来自ATCC，编号700926)的基因 组DNA为模板，用引物pflB-ilvD-up/pflB-ilvD-down扩增出1951bp的 DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转 至菌株Sval015。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down，正确的菌落扩增产物为2907bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval016。
实施例9：二羟酸脱水酶编码基因ilvD的表达调控
从Sval016出发，使用人工调控元件调控整合在丙酮酸甲酸裂解酶 编码基因pflB位点的二羟酸脱水酶编码基因ilvD的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 pflB-Pcs-up/pflB-Pcs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval016。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval016，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval016。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-pflB-up600/ilvD-YZ496-down进行验证，正确 的PCR产物应该3756bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval017。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物 pflB-Pro-up/ilvD-Pro-down扩增出189bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval017。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-pflB-up600/ilvD-YZ496-down，正确的菌落扩增产物为1226bp的片 段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval018。
实施例10：乙酰乳酸合成酶基因ilvBN的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合 成酶基因ilvBN的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvB pro-catup/ilvB pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval018，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval018。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown进行验证，正确的 PCR产物应该2996bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval019。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物ilvB pro-up/ilvB pro-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源 重组。将DNA片段II电转至菌株Sval019。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown，正确的菌落扩增产物为465bp的片段，挑选一个正确的单 菌落，将其命名为Sval020。
实施例11：乙酰乳酸合成酶基因ilvGM的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合 成酶基因ilvGM的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvGpro-catup/ilvG pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval020，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval020。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvGpro-YZup/ilvGp-YZdown进行验证，正确的 PCR产物应该2993bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval021。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA质粒DNA为模板，用引物ilvG pro-up/ilvGpro-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段II用于 第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval021。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvG pro-YZup/ilvG p-YZdown，正确的菌落扩增产物为462bp的片段，挑选一个正确的单 菌落，将其命名为Sval022。
实施例12：乙酰乳酸合成酶基因ilvH的突变
通过两步同源重组的方法在ilvH基因中引入突变解除L-缬氨酸的 反馈抑制，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvH*-cat-up/ ilvH*-cat-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。 扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval022，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval022。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvH*-mutYZ-up/ilvH*-mut-down进行验证，正确 的PCR产物应该3165bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval023。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 ilvH*-mut-up/ilvH*-mut-down扩增出467bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval023。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvH*-mutYZ-up/ ilvH*-mut-down，正确的菌落扩增产物为619bp的片段，挑选一个正确 的单菌落，将其命名为Sval024。
实施例13：使用重组菌株Sval024发酵生产L-缬氨酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O2g/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50 g/L。
Sval024的厌氧发酵包括以下步骤：
(1)种子培养：将LB平板上新鲜的克隆接种到含有4ml种子培养 基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后，按照2％(V/V)的接 种量将培养物转接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃， 250rpm振荡培养12小时得到种子培养液用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种 子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150 rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制 在7.0。培养过程中不通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵4天的 发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯 乐(Biorad)公司的AminexHPX–87H有机酸分析柱。氨基酸测定使用Sielc 氨基酸分析柱primesep 100250×4.6mm。
结果发现：Sval024菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产1.3g/L 的L-缬氨酸(出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.31 mol/mol。
实施例14：亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH的克隆与整合
leuDH基因是根据文献报道(Ohshima,T.et.al,Properties of crystallineleucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus.The Journal of biologicalchemistry 253,5719-5725(1978))的来自Lysinibacillus sphaericus IFO 3525菌株的leuDH序列并经过密码子优化(优化序列为 序列69)后通过全基因合成获得，合成时在leuDH基因前加上M1-93 人工调控元件用于启动leuDH基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒pUC57-M1-93-leuDH(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合 成和载体构建)。将M1-93人工调控元件和leuDH基因一起通过来两步 同源重组的方法整合到Sval024菌株中富马酸还原酶编码基因frd位点并 替换掉frd基因，即在整合leuDH的同时敲除frd基因。具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物frd-cs-up/ frd-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval024，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval024。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-frd-up/XZ-frd-down进行验证，正确的PCR产 物应该3493bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval025。
第二步，以pUC57-M1-93-leuDH质粒DNA为模板，用引物 frd-M93-up/frd-leuDH-down扩增出1283bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval025。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-frd-up/XZ-frd-down， 正确的菌落扩增产物为2057bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其 命名为Sval026。
实施例15：使用重组菌株Sval026发酵生产L-缬氨酸
种子培养基和发酵培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵过程和分析过程同实施例13 中所述Sval024的发酵过程和分析过程一致。
结果发现：Sval026菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产1.8g/L 的L-缬氨酸(出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.56 mol/mol。
实施例16：NADH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因在醇脱氢酶 基因adhE位点的整合
乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari是根据文献报道 (Brinkmann-Chen,S.,Cahn,J.K.B.&Arnold,F.H.Uncovering rare NADH-preferring ketol-acidreductoisomerases.Metab Eng 26,17-22, doi:10.1016/j.ymben.2014.08.003(2014).)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的kari序列并经过密码子优化(优化序列参见序列70)后 通过全基因合成获得，合成时在kari基因前加上RBS5人工调控元件用 于启动kari基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒 pUC57-RBS5-kari(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成和载体 构建)。将RBS5人工调控元件和kari基因一起通过来两步同源重组的方 法整合到Sval026菌株中醇脱氢酶编码基因adhE位点。具体步骤包括：
第一步，将cat-sacB基因整合Sval026中adhE基因位点，片段的获 得和纯化、第一步同源重组的整合、验证同实施例5中adhE基因敲除 第一步同源重组所用片段和方法完全一致，获得的克隆命名为Sval061 (表1)。
第二步，以pUC57-RBS5-kari质粒DNA为模板，用引物 adhE-RBS5-up/adhE-kari-down扩增出1188bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval061。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-adhE-up/XZ-adhE-down，正确的菌落扩增产物为1636bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval062。
实施例17：mgsA位点NADPH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因 的敲除
通过两步同源重组的方法敲除整合在甲基乙二醛合酶编码基因mgsA 位点的NADPH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC，具体步骤 如下：
第一步，将cat-sacB基因整合到mgsA位点替代ilvC基因，片段的 获得和纯化、第一步同源重组的整合、验证同实施例1中mgsA敲除第 一步同源重组所用片段和方法完全一致，获得的克隆命名为Sval063(表 1)。
第二步，使用mgsA敲除的片段替代cat-sacB片段，获得mgsA基因 及ilvC基因敲除的菌株，片段的获得和纯化、第二步同源重组的整合、 验证同实施例1中mgsA敲除第二步同源重组所用片段和方法完全一致， 获得的克隆命名为Sval064。
实施例18：使用重组菌株Sval064发酵生产L-缬氨酸
种子培养基和发酵培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵过程和分析过程同实施例13 中所述Sval024的发酵过程和分析过程一致。
结果发现：
Sval064菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产2.0g/L的L-缬氨酸 (出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.80mol/mol(图3)。
实施例19：重组菌株Sval065的构建
从Sval064开始，通过进化代谢同步提高细胞生长和L-缬氨酸的生 产能力。
进化代谢过程使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。使用 5M氨水为中和剂，使发酵罐的pH控制在7.0。进化代谢所用的发酵培 养基组成和配制同实施例16中发酵培养基所述。每24小时，将发酵液 转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.1，经过105代进化，获得菌 株Sval065(图4)。Sval065菌株以保藏号CGMCC 19458保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
实施例20：重组菌株Sval065在500mL发酵罐中发酵生产L-缬氨酸
种子培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵培养基为250ml。发酵培养 基基本上和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为100g/L，使用的中和 剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0。
结果发现：Sval065发酵48小时后，L-缬氨酸产量达45g/L，产率 达0.9mol/mol，无杂酸等杂质生成。
实施例21：重组菌株Sval065在5L发酵罐中发酵生产L-缬氨酸
种子培养基的组成和配制、分析方法同实施例13中所述相同。发 酵培养基基本上和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为140g/L。
发酵在5L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中厌氧进行，包括以 下步骤：
(1)种子培养：500ml三角瓶中种子培养基为150ml，115℃灭菌15 min。冷却后将重组大肠杆菌Sval045按照1％(V/V)的接种量接种于种 子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于 发酵培养基接种。
(2)发酵培养：5L中发酵培养基体积为3L，115℃灭菌25min。将种 子液按照终浓度OD550＝0.2的接种量接种于发酵培养基，37℃厌氧培养 3天，搅拌转速200rpm，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培 养过程没有通任何气体。
结果发现：Sval065发酵48小时后，L-缬氨酸产量达83g/L，产率 达0.92mol/mol(0.6g/g)，无杂酸等杂质生成(图5-6)。

Claims (10)

1.一种生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，其特征在于：向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢酶基因，使得所述酶活性增强；
优选地，所述乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢酶基因是NADH依赖型；
优选地，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是ilvC或KARI；所述氨基酸脱氢酶基因是亮氨酸脱氢酶基因；
更优选地，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是KARI，所述氨基酸脱氢酶基因是leuDH。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：还包括对权利要求1所述的重组微生物进行以下(1)-(7)中的一种或几种改造：
(1)敲除mgsA基因；
(2)敲除ldhA基因；
(3)敲除pta和/或ackA基因；
(4)敲除tdcD和/或tdcE基因；
(5)敲除adhE基因；
(6)敲除frd和/或pflB基因；
(7)增强乙酰乳酸合成酶(AHAS)和/或二羟酸脱水酶(ilvD)的活性；
优选地，AHAS为ilvBN或ilvGM或ilvIH；任选地，所述ilvIHAHAS的活性通过解除缬氨酸对ilvH的反馈抑制得到增强，例如通过突变ilvH基因得到增强；
优选地，选择上述第(7)项进行改造；
优选地，选择上述第(7)和第(2)项进行改造；
优选地，选择上述第(7)和第(6)项进行改造；
优选地，选择上述第(7)项、第(2)项和第(5)项进行改造；
优选地，选择上述第(7)项、第(1)项、第(3)-(6)项进行改造；
优选地，选择上述第(1)-(7)项进行改造；
优选地，采用突变ilvH基因的方式解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制；
优选地，以ilvD基因替换微生物本身的pflB基因的方式实现第(6)项；
优选地，以leuDH基因替换微生物本身的frd基因的方式实现第(6)项；
优选地，以KARI基因替换微生物本身的adhE基因的方式实现第(5)项；
优选地，以ilvC基因替换微生物本身的mgsA基因的方式实现第(1)项，且ilvC在导入后任选地可再次敲除。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，所述的微生物为大肠杆菌；更优选的，所述的微生物为大肠杆菌ATCC 8739。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，使用至少一个调控元件增强所述酶的基因的活性；
优选地，所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93人工调控元件或RBS5人工调控元件；
优选地，M1-46人工调控元件调控ilvC基因；
M1-93人工调控元件调控ilvD、leuDH、ilvBN和ilvGM基因；
RBS5人工调控元件调控KARI基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，其中所述酶编码基因的一个或多个拷贝和所述的调控元件整合入所述微生物的基因组中，或者将包含所述酶编码基因的质粒导入所述微生物中；
优选地，以整合入所述微生物的基因组的方法完成所述酶基因的导入、突变、敲除或调控；
优选地，以同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变、敲除或调控；
优选地，以两步同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变、敲除或调控。
6.利用权利要求1-5任一所述构建方法得到的重组微生物。
7.一种获得高产L-缬氨酸的重组微生物的方法，其特征在于，在权利要求5所述的重组微生物的基础上，经过代谢进化获得。
8.一种重组微生物，其保藏号为CGMCC 19458。
9.权利要求6和权利要求8所述的重组微生物在生产L-缬氨酸中的应用。
10.一种生产L-缬氨酸的方法，包括：(1)发酵培养权利要求6或8所述的重组微生物；(2)分离并收获L-缬氨酸；优选地，所述发酵培养为厌氧发酵培养。
CN202010401422.5A 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用 Active CN113278655B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210084710.1A CN114457123B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN202010401422.5A CN113278655B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN202210084699.9A CN114457122B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
PCT/CN2020/137780 WO2021227500A1 (zh) 2020-05-13 2020-12-18 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
EP20925003.4A EP3929297A4 (en) 2020-05-13 2020-12-18 RECOMBINANT MICROORGANISM FOR THE PRODUCTION OF L-VALINE, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND ITS USE
US17/603,008 US20230072835A1 (en) 2020-05-13 2020-12-18 Recombinant microorganism for producing L-valine, construction method and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010401422.5A CN113278655B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210084699.9A Division CN114457122B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN202210084710.1A Division CN114457123B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113278655A true CN113278655A (zh) 2021-08-20
CN113278655B CN113278655B (zh) 2022-05-17

Family

ID=77275618

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210084710.1A Active CN114457123B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN202010401422.5A Active CN113278655B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN202210084699.9A Active CN114457122B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210084710.1A Active CN114457123B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210084699.9A Active CN114457122B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230072835A1 (zh)
EP (1) EP3929297A4 (zh)
CN (3) CN114457123B (zh)
WO (1) WO2021227500A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113278568B (zh) * 2020-05-27 2022-10-21 安徽华恒生物科技股份有限公司 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN113278641B (zh) * 2020-05-27 2022-06-21 安徽华恒生物科技股份有限公司 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌、其构建方法及其应用
CN116536237B (zh) * 2023-06-29 2023-11-10 北京中科伊品生物科技有限公司 改造的大肠杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用
CN117844728B (zh) * 2024-03-04 2024-06-04 天津科技大学 一种l-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027709A1 (ja) * 2011-08-22 2013-02-28 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるバリンの製造方法
CN103642766A (zh) * 2013-07-02 2014-03-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 蛋白、dna分子、含有该dna的转化宿主及该转化宿主用于生产l-缬氨酸的方法
CN103773745A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
CN110607268A (zh) * 2019-10-24 2019-12-24 天津科技大学 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06277067A (ja) * 1993-03-26 1994-10-04 Mitsubishi Petrochem Co Ltd アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子ｄｎａ
CN1370234A (zh) * 1999-06-25 2002-09-18 Basf公司 编码参与内环境稳定和适应的蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因
RU2209246C2 (ru) 2000-01-26 2003-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-валина (варианты) и способ получения l-валина
WO2008119009A2 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient alanine production
EP2222841B1 (en) * 2007-12-20 2015-08-26 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Ketol-acid reductoisomerase using nadh
WO2010051527A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Gevo, Inc. Engineered microorganisms capable of producing target compounds under anaerobic conditions
BR112012006941A2 (pt) * 2009-09-29 2015-09-08 Butamax Tm Advanced Biofuels célula bacteriana de ácido recombinante, método de produção de uma célula bacteriana do ácido lético recombinamte, método de produção de isobutanol, vetor de integração de bastérias do ácido lático e método para integrar aleatoriamente um segmento de dna em uma célula bacteriana do ácido lético genoma
US20140017748A1 (en) * 2010-02-12 2014-01-16 Gevo, Inc. Modified alcohol dehydrogenases for the production of fuels and chemicals
WO2013009818A2 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Gevo, Inc. High-performance ketol-acid reductoisomerases
JP6133010B2 (ja) * 2011-09-16 2017-05-24 協和発酵バイオ株式会社 アミノ酸の製造法
CN104178443B (zh) * 2013-05-24 2017-04-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用
CN104561074B (zh) * 2014-12-30 2017-06-06 福建师范大学 一株高产l‑缬氨酸工程菌的构建及其应用
WO2017139420A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Kembiotix Llc Biological fermentation using dihydroxyacetone as a source of carbon
CN109306343A (zh) * 2017-07-26 2019-02-05 中国科学院微生物研究所 新型天冬氨酸脱氢酶及在天冬氨酸族氨基酸生产上的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027709A1 (ja) * 2011-08-22 2013-02-28 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるバリンの製造方法
CN103946370A (zh) * 2011-08-22 2014-07-23 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法
CN103773745A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
CN103642766A (zh) * 2013-07-02 2014-03-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 蛋白、dna分子、含有该dna的转化宿主及该转化宿主用于生产l-缬氨酸的方法
CN110607268A (zh) * 2019-10-24 2019-12-24 天津科技大学 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGHOON LEE等: "《Crystal Structure and Biochemical Characterization of Ketol-Acid Reductoisomerase from Corynebacterium glutamicum》", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
EKATERINA A. SAVRASOVA等: "《Application of leucine dehydrogenase Bcd from Bacillus subtilis for L-valine synthesis in Escherichia coli under microaerobic conditions》", 《HELIYON》 *
HASEGAWA, SATOSHI等: "《Improvement of the Redox Balance Increases L-Valine Production by Corynebacterium glutamicum under Oxygen Deprivation Conditions》", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 》 *
JIN HWAN PARK等: "《Escherichia coli W as a New Platform Strain for the Enhanced Production of L-Valine by Systems Metabolic Engineering》", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
JIN HWAN PARK等: "《Fed-Batch Culture of Escherichia coli for L-Valine Production Based on In Silico Flux Response Analysis》", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 》 *
SATOSHI HASEGAWA等: "《Engineering of Corynebacterium glutamicum for High-Yield L-Valine Production under Oxygen Deprivation Conditions》", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
XIAOYUAN WANG等: "《Production of L-valine from metabolically engineered Corynebacterium glutamicum》", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 *
张海灵: "《系统代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-缬氨酸》", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021227500A1 (zh) 2021-11-18
CN114457123B (zh) 2023-06-20
CN114457122B (zh) 2023-06-20
EP3929297A4 (en) 2022-09-21
CN114457123A (zh) 2022-05-10
CN113278655B (zh) 2022-05-17
EP3929297A1 (en) 2021-12-29
CN114457122A (zh) 2022-05-10
US20230072835A1 (en) 2023-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113278655B (zh) 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
Zhang et al. Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli
CN113278568B (zh) 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌及其应用
Pérez-García et al. Fermentative production of L‐pipecolic acid from glucose and alternative carbon sources
JP7373661B2 (ja) Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用
CN113278641B (zh) 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌、其构建方法及其应用
CN101501204B (zh) 一种利用甘油生产氨基酸的方法
CN114717172B (zh) 合成l-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用
TW200306352A (en) Method for producing L-amino acid
CN110699394B (zh) 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN110272857B (zh) β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途
CN113652383B (zh) 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其应用
WO2006025477A1 (ja) 工業的に有用な微生物
Wang et al. Heterotrophic and autotrophic production of L-isoleucine and L-valine by engineered Cupriavidus necator H16
WO2023246071A1 (zh) 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用
US11479795B2 (en) Genetically engineered bacterium for sarcosine production as well as construction method and application
Yin et al. Recent Advances in Metabolic Engineering for the Biosynthesis of Phosphoenol Pyruvate–Oxaloacetate–Pyruvate-Derived Amino Acids
WO2024124711A1 (zh) 构建l-缬氨酸生产菌株的方法、l-缬氨酸生产菌株及其应用
RU2820627C1 (ru) Генно-инженерные бактерии для продуцирования l-аргинина и способ конструирования и применения генно-инженерных бактерий
CN118726215A (zh) 一种产泛解酸的重组微生物及其应用
WO2024197704A1 (zh) 一种产泛解酸的重组微生物及其应用
US20150247174A1 (en) Engineering bacteria for producing dl-alanine and method for producing dl-alanine by using engineering bacteria
CN118562693A (zh) 一种基因工程菌及其在生产d-泛酸中的应用
CN118165905A (zh) 一株产l-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
CN117946950A (zh) 一种新的生产2-羟基异戊酸的脱氢酶及2-羟基异戊酸工程菌的构建和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant