CN113652383B - 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产D‑泛酸的基因工程菌及应用，所述基因工程菌通过以下步骤构建获得：(1)以保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌为出发菌株，敲除aceF和mdh两个基因，获得菌株DPA02；(2)将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，以及ppnk基因在菌株DPA02中过表达获得产D‑泛酸的基因工程菌。本发明产D‑泛酸的基因工程菌的D‑泛酸的产量在摇瓶发酵中提高至6.89g/L，提高了80％；同时，利用20％溶氧反馈补料结合甜菜碱添加的分批补料发酵策略使5L发酵罐中D‑泛酸积累量提高至68.3g/L，糖酸转化率达到0.36g/L。

Description

一种高产D-泛酸的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌及应用方法。
背景技术
D-泛酸(D-pantothenic acid，D-PA)，又名遍多酸、维生素B5，是生物体维持正常生理功能所必需的微量营养素。作为CoA和ACP的专性前体，它在体内对碳水化合物，脂质，蛋白质和核酸的代谢调节中起着明显的作。D-泛酸的名称来自希腊语“pantothen”，意思是“来自所有方面”。顾名思义，D-泛酸在饮食中广泛可用。通常，花生酱(5-8mg/100g)，动物肝脏和肾脏(4-7mg/100g)，杏仁(2-3mg/100g)，麦麸(2-3mg/100g)和龙虾(1.5mg/100g)是D-泛酸的主要贡献者。此外，牛奶，谷物，牛肉，鸡蛋，坚果和蔬菜也是这种维生素的主要来源。因此，D-泛酸缺乏症很少见。但是，由于D-泛酸在食品加工或烹饪过程中的损失及不同群体对D-泛酸的吸收程度不同，仍然有部分人群的D-泛酸的摄入量低于维持正常人体功能所需的D-泛酸的充分摄入量，这可能导致记忆力减退，肾上腺功能衰竭和关节炎，以及其他症状。考虑到D-泛酸的重要生理功能，近年来它在临床研究中的作用日益突出，例如高脂血症，骨关节炎，类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。较前沿的研究包括D-泛酸有助于健康大脑所需的髓磷脂的合成，并且适当的摄入可以在早期阶段预防甚至逆转神经退行性疾病(例如亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病)。另外，口服含D-泛酸的膳食补充剂是安全缓解面部痤疮病变的有效策略。破骨细胞中D-泛酸的潜在调节作用使其在预防骨丢失相关疾病方面具有令人满意的潜力。D-泛酸缺乏可能是导致溃疡性结肠炎的潜在因素。临床研究表明，D-泛酸可以增加CoA的水平，并在抗炎机制中起抗氧化剂的作用。在饲料方面，添加一定量的D-泛酸可以满足动物的需求。在化妆品领域，D-泛酸具有增强的保湿和抗衰老作用。
由于D-泛酸的不稳定性，D-泛酸钙作为D-泛酸的主要应用形式，其目前的工业化生产主要是依赖化学合成。经典的化学过程包括DL-泛解酸内酯的合成、外消旋泛解酸内酯的光学拆分以及D-泛解酸内酯和β-丙氨酸的聚合反应。其中涉及剧毒原料(氢氰酸或氰化钠)的使用，繁琐的光学拆分以及含氰化物的废水污染。随着环境污染和能源短缺的加剧，通过生态友好且可持续的方法生产D-泛酸受到了研究人员的广泛关注。
天然可再生资源的微生物发酵生产D-泛酸由于具有环境友好和可持续的特征被认为是一种有吸引力的替代方法。随着代谢工程技术的发展，微生物途径的修饰使工程化大肠杆菌(Escherichia coil)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产D-泛酸成为可能。以葡萄糖作为碳源为例，D-泛酸的生物合成途径由两部分组成：泛解酸合成途径和β-丙氨酸合成途径。其中，由panB编码的酮戊酸酯羟甲基转移酶(KPHMT)和由panC编码的泛酸合成酶(PS)是D-泛酸生物合成途径中的关键限速步骤。尽管目前已经进行了各种努力来增加微生物中D-泛酸生物合成途径的代谢通量。然而，由于D-泛酸生物合成途径的复杂性和严格的控制，较低的产量和生产率仍然是D-泛酸微生物发酵生产的缺陷，这直接降低了微生物发酵合成D-泛酸的市场竞争力。
申请人前期的专利申请(公开号为CN109868254A的发明申请)中公开了一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用，通过强化D-泛酸生物生成途径中关键基因panB、panC、panE和ilvC的表达，通过修复ilvG基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，使D-泛酸积累达到0.48g/L，通过avtA基因的敲除和ilvE基因的敲降对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，高产泛酸的基因工程菌Escherichia coli ZJB18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018914，该高产菌D-泛酸效价从0.48g/L提高到1.54g/L。因此，鉴于目前D-泛酸的发酵菌株积累量较低，亟需针对大肠杆菌中D-泛酸合成的代谢途径开发新的生产者改善微生物发酵中低产量和产率的D-泛酸生产问题。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种高产D-泛酸的基因工程菌。
一种产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建获得：
(1)以保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌为出发菌株，敲除aceF和mdh两个基因，获得菌株DPA02；
(2)将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，以及ppnk基因在菌株DPA02中过表达获得产D-泛酸的基因工程菌。
优选的，敲除aceF和mdh两个基因时使用CRISPR-Cas9基因编辑技术。
优选的，步骤(2)中将panB基因、panC基因以及ppnk基因同时克隆到pTrc99A质粒中，获得质粒pTrc99A-panBC-ppnk，将该质粒转入菌株DPA02中获得产D-泛酸的基因工程菌。
优选的，aceF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；mdh基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ppnk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明又提供了所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
优选的，发酵过程中控制发酵体系pH维持在6.6～6.8，温度维持在28～30℃。
优选的，在发酵延迟期添加2g/L的甜菜碱，缓解发酵系统中重组大肠杆菌对渗透压的敏感。
优选的，发酵起始时使用发酵培养基，并依据20％溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO412～16g/L、KH2PO41～2g/L、MgSO40.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、0.5～1ml/L微量金属离子溶液，50～75mg/LKan抗生素，0.1～0.2mM的IPTG，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5～10g/LCoCl2、5～10g/L FeSO4·7H2O、0.5～1g/L ZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水；
补料培养基：葡萄糖400～500g/L，yeast extract 1～2g/L，硫酸铵8～10g/L，硫酸镁6～8g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，β-丙氨酸35～40g/L，异亮氨酸0.1～0.16g/L，VB18～10mg/L，VB122～4mg/L，Kan 50～75mg/L，IPTG 72～96mg/L，金属盐溶液1～2mL/L，消泡剂1～2mL/L。
本发明的有益效果：
大肠杆菌中复杂的代谢途径和严格的调控机制是影响D-泛酸生物合成的主要因素。一般认为，提高重要代谢前体的利用率对目标产物的生物合成存在明显的促进作用。本发明在基因组水平改善了细胞代谢途径，D-泛酸的积累得到提升；辅助因子是非蛋白质化合物或金属离子，对于所有生物有机体中无数酶的生物学功能和催化活性都是必需的。它们可以有效地促进生化转化。NAD和NADP是辅助因子的关键类别，在所有生物有机体中起着重要的电子供体或受体的作用，可引起大量的分解代谢和合成代谢反应。此外，它们在维持细胞内氧化还原稳态中起关键作用。对代谢途径进行的许多代谢工程改造，经常会引起辅因子氧化还原状态的波动，从而极大地阻碍细胞代谢，从而导致生长性能和生物合成能力下降。因此，在很多情况下，阻碍特定代谢途径的可能是氧化还原瓶颈。在D-泛酸合成途径中需要消耗2mol的NADPH，为避免菌株因NADPH供应不足，利用质粒分别表达不同来源的NADPH再生基因，筛选出最适的表达基因。结合以上策略，构建的基因工程菌株的D-泛酸产量在摇瓶发酵中提高至6.89g/L，提高了80％；在分批补料发酵过程中D-泛酸积累提高至68.3g/L，糖酸转化率达到0.36g/L。
附图说明
图1为重组大肠杆菌中D-泛酸生物合成途径及菌株开发示意图。
图2为重组大肠杆菌DPA01/pTrc99A-panBC的发酵性能。误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
图3为重组大肠杆菌DPA02/pTrc99A-panBC的发酵性能。误差棒代表标准品与一式三份实验的偏差。
图4为在不同溶氧水平反馈补料策略发酵过程中的D-泛酸产品的产量，菌体生物量和副产物积累的变化，其中，a：10％溶氧反馈补料；b：20％溶氧反馈补料；c：30％溶氧反馈补料；d：40％溶氧反馈补料。
图5为在不同时间段添加甜菜碱发酵过程中的D-泛酸产品的产量，菌体生物量和副产物积累的变化，其中，a：12h添加甜菜碱；b：48h添加甜菜碱；c：72h添加甜菜碱。
具体实施方式
申请人之前的专利技术“CN109868254A”、“CN201911418780.0”已经证明了D-泛酸途径基因panB与panC基因表达的增强对D-泛酸发酵生产的有益作用，以同专利技术“CN201911418780.0”中的方法在质粒pTrc99A质粒上过表达来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，构建质粒pTrc99A-panBC。将质粒pTrc99A-panBC导入本发明中所使用的底盘菌株Escherichia coli ZJB 18003进行过表达，获得D-泛酸生产菌株DPA，在此基础上进行后续步骤。
本申请中使用的引物汇总如表1。
表1
实施例1：丙酮酸脱氢酶复合物编码基因aceF的敲除
本发明中所使用的底盘菌株为申请人之前的专利技术(公开号为“CN109868254A”、发明名称为“一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用”、申请日为2019年3月14日)中的Escherichia coli ZJB 18003菌株。以Escherichia coli ZJB18003为出发菌株，重组大肠杆菌中D-泛酸生物合成途径及菌株构建示意图如图1所示，首先使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术对aceF基因进行敲除。
(1)构建pTarget-aceF质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模板，以pTarget-aceF-1/pTarget-aceF-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观霉素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-aceF质粒，用于后续Donor-DNA的连接。
(2)构建pTD-aceF质粒：以E.coli W3110基因组为模板，pTD-aceF-1与pTD-aceF-2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，pTD-aceF-3和pTD-aceF-4为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；pTarget-aceF质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Cleanup试剂盒回收DNA片段；按照(One step clonekit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-aceF质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-aceF质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入目标菌株中，转接单克隆到含75mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl1 mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600为0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(MolecularCloning：A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-aceF质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含75mg/L卡那霉素和75mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养12-16h，以T-aceF-up和T-aceF-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是阳性菌落。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和75mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含50mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含50mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含50mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-aceF质粒成功消除，挑取pTarget-aceF质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含50mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含50mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒DPA01菌株。将pTrc99A-panBC质粒转入DPA01获得菌株DPA01/pTrc99A-panBC。
实施例2：苹果酸脱氢酶基因mdh的敲除
以实施例1中获得的无质粒DPA01菌株为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术对mdh基因进行敲除。
(1)构建pTarget-mdh质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模板，以pTarget-mdh-1/pTarget-mdh-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观霉素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-mdh质粒，用于后续Donor-DNA的连接。
(2)构建pTD-mdh质粒：以E.coli W3110基因组为模板，pTD-mdh-1与pTD-mdh-2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，pTD-mdh-3和pTD-mdh-4为引物扩增获得donorDNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；pTarget-mdh质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-mdh质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-mdh质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入目标菌株中，转接单克隆到含75mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600为0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(MolecularCloning：A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-mdh质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mLLB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含75mg/L卡那霉素和75mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养12-16h，以T-mdh-up和T-mdh-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是阳性菌落。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和75mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含50mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含50mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含50mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-mdh质粒成功消除，挑取pTarget-mdh质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含50mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含50mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒DPA02菌株。将质粒pTrc99A-panBC质粒转入DPA02菌株获得菌株DPA02/pTrc99A-panBC。
实施例3：菌株DPA01/pTrc99A-panBC、菌株DPA02/pTrc99A-panBC的发酵培养及细胞量和D-泛酸积累的检测
将菌株DPA01/pTrc99A-panBC或DPA02/pTrc99A-panBC，以DPA(Escherichia coliZJB 18003)为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作种子液；8-12h后，接种200μL预培养物和0.2mM的IPTG到装有20mL的发酵培养基的250mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm条件下培养48h；发酵结束后进行取样检测细胞量和D-泛酸积累。
发酵结束后，取200μL发酵液于2mL离心管，加1.8mL无菌水稀释10倍。在常温状态下，12000rpm离心1min。去上清，加200μL乙酸用于溶解碳酸钙，同样的加1.8mL无菌水恢复至2mL。分光光度计，波长600nm测OD600值，测量值×稀释倍数即为实际OD600值。
D-泛酸积累量检测：将稀释后的发酵液上清使用0.22μm有机滤膜过膜，用于高效液相色谱(HPLC)检测。D-泛酸高效液相色谱检测条件如下：A流动相成分：95％超纯水、4.9％乙腈、0.1％磷酸，使用0.22μm微孔有机系滤膜过滤并超生波除气泡；B色谱柱型号：C18色谱柱(250×4.6mm，5μm，安捷伦科技公司)；C检测参数：进样量10μL，柱温30℃，流速0.9mL/min，检测波长200nm，D-PA出峰时间14.5min。发酵结果由图2和图3可见，基因组单独敲除aceF和组合敲除aceF和mdh基因，会对D-泛酸积累有一定促进作用，这说明丙酮酸利用的增强可有效增加胞内D-泛酸的积累。
实施例4：表达质粒pTrc99A-panBC-zwf的构建
以DPA(Escherichia coli ZJB 18003)基因组为模板，In-zwf-F与In-zwf-R为引物扩增获得目的片段zwf(zwf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；以pTrc99A-panBC质粒为模板，V-zwf-F与V-zwf-R为引物扩增获得线性载体；按照(One step clonekit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A-panBC质粒与zwf片段连接在一起，通过测序验证得到pTrc99A-panBC-zwf质粒。
实施例5：表达质粒pTrc99A-panBC-pntAB的构建
以DPA(Escherichia coli ZJB 18003)基因组为模板，In-pntAB-F与In-pntAB-R为引物扩增获得目的片段pntAB(pntAB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；以pTrc99A-panBC质粒为模板，V-pntAB-F与V-pntAB-R为引物扩增获得线性载体；按照(One stepclonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A-panBC质粒与pntAB片段连接在一起，通过测序验证得到pTrc99A-panBC-pntAB质粒。
实施例6：表达质粒pTrc99A-panBC-ppnk的构建
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(ATCC保藏库购买)基因组为模板，In-ppnk-F与In-ppnk-R为引物扩增获得的目的片段ppnk；以pTrc99A-panBC质粒为模板，V-ppnk-F与V-ppnk-R为引物扩增获得线性载体；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A-panBC质粒与ppnk片段连接在一起，通过测序验证得到pTrc99A-panBC-ppnk质粒。
实施例7：表达质粒pTrc99A-panBC-zwf-ppnk的构建
将实施例4和6分别获得的基因zwf和ppnk的目的片段通过融合PCR进行融合连接，获得目的片段zwf-ppnk；以pTrc99A-panBC质粒为模板，V-zwf-ppnk-F与V-zwf-ppnk-R为引物扩增获得线性载体；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A-panBC质粒与zwf-ppnk片段连接在一起，通过测序验证得到pTrc99A-panBC-zwf-ppnk质粒。
实施例8：菌株DPA02/pT-zwf、DPA02/pT-pntAB、DPA02/pT-ppnk和DPA02/pT-zwf-ppnk的构建
从无质粒DPA02菌株甘油冻存管中用枪头蘸取菌液划线于无抗的LB平板，37℃恒温培养箱过夜培养；从平板选择正确的单菌落接种到5mL的LB培养基中，37℃、200rpm恒温摇床培养箱过夜培养；然后吸取400mL菌液转接至40mL的LB培养基中，37℃、200rpm恒温摇床培养至OD处于0.4～0.6之间；将装有菌液的摇瓶置于冰里冷却10min左右，4℃，4000×g离心5min收集菌体；加入15mL预冷的11.1g/L的CaCl2无菌溶液，冰水浴重悬后冰浴30min；4000×g离心5min后加入1mL预冷的含11.1g/L CaCl2和15％甘油的无菌溶液，冰水浴重悬后分装至无菌1.5mL离心管(100μL每管)，-80℃保藏，获得无质粒DPA02菌株的感受态细胞。分别将构建的质粒pTrc99A-panBC-zwf质粒、pTrc99A-panBC-pntAB、pTrc99A-panBC-ppnk和pTrc99A-panBC-zwf-ppnk导入无质粒DPA02菌株的感受态细胞中，分别获得菌株DPA02/pT-zwf、DPA02/pT-pntAB、DPA02/pT-ppnk和DPA02/pT-zwf-ppnk。
实施例9：实施例8中构建菌株的摇瓶发酵培养
将实施例8中获得的菌株，以DPA02/pTrc99A-panBC为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作种子液；8-12h后，接种200μL预培养物和0.1～0.2mM的IPTG到装有20mL的发酵培养基的250mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm条件下培养40～48h；发酵结束后进行取样检测细胞量和D-泛酸积累。菌株DPA02/pT-zwf、DPA02/pT-pntAB、DPA02/pT-ppnk和DPA02/pT-zwf-ppnk在发酵48h分别积累5.93±0.12g/L、5.18±0.21g/L、4.82±0.15g/L、6.89±0.11g/L、5.02±0.09g/L的D-泛酸，而对照菌株DPA02/pTrc99A-panBC积累5.93±0.12g/L D-泛酸。这些结果表明，NADPH的供应不是D-泛酸生产中关键的限速步骤。ppnK的过表达更有效地改善了D-泛酸的产生，表明在增强D-泛酸的生物合成方面，NADP+的供给比NADPH的供给更为有效。D-泛酸生产的提高可能归因于潜在的动态氧化还原平衡，包括NAD/NADP而非单独的NADPH供应。
实施例10：DPA02/pT-ppnk菌株在5L发酵罐中的分批补料发酵培养
D-泛酸的分批补料发酵包括以下步骤：
(1)DPA02/pT-ppnk菌株的种子培养：
将-80℃甘油保藏的DPA02/pT-ppnk菌株划线于平板培养基上，培养箱中37℃活化培养12h，得到活化菌；平板培养基：蛋白胨8～10g/L、酵母提取物8～10g/L、NaCl 3～5g/L、琼脂粉18～20g/L。挑取新鲜的、生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的试管中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10～12h，获得一级种子液；之后，以1％的接种量转接到三瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10～12h，获得二级种子液。
(2)DPA02/pT-ppnk菌株的分批补料发酵培养：
分批补料发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(1)得到的二级种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值10％。在发酵19h后开始流加补料培养基，直至发酵结束。中间取样测细胞生长量。所有分批补料培养均以初始葡萄糖浓度为20g/L的分批培养开始。分批发酵18h左右，使用发酵罐控制系统控制蠕动泵将补料培养基溶液泵入发酵罐。发酵条件：pH 6.8，温度30℃，通气速率和搅拌速度用于调控溶解氧浓度。
分批补料发酵通常用于获得目标产物的高浓度。在分批补料发酵过程中，葡萄糖作为单一碳源，溶解氧等参数可以反映葡萄糖状况。使用溶氧水平来反馈培养基消耗的状态以控制葡萄糖的摄取速率，可以避免葡萄糖过量和溶氧限制。因此，在这项工作中，当溶氧浓度高于设定的饱和值(10％；20％；30％；40％)时(表明由于细胞活力降低而增加的溶氧浓度)，实施了溶氧反馈策略以向发酵培养基中添加丰富的补料培养基。此外，当溶解氧浓度降至设定的饱和值时，自动进料系统将终止(指示由于细胞生长速率增加而降低的溶解氧浓度)。
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨8～10g/L、酵母提取物8～10g/L、NaCl 3～5g/L；发酵培养基包括以下成分：0葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO412～16g/L、KH2PO41～2g/L、MgSO40.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、0.5～1ml/L微量金属离子溶液，50～75mg/L Kan抗生素，0.1～0.2mM的IPTG，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5～10g/L CoCl2、5～10g/L FeSO4·7H2O、0.5～1g/LZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
补料培养基：葡萄糖400～500g/L，yeast extract 1～2g/L，硫酸铵8～10g/L，硫酸镁6～8g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，β-丙氨酸35～40g/L，异亮氨酸0.1～0.16g/L，VB18～10mg/L，VB122～4mg/L，Kan 50～75mg/L，IPTG 72～96mg/L，金属盐溶液1～2mL/L，消泡剂1～2mL/L。
表2不同溶氧水平反馈补料中发酵参数
如图4(a-d)所示，在不同的溶氧水平的反馈补料条件下DCW、D-泛酸浓度和乙酸盐积累的曲线。当DO值设为20％时，最大D-泛酸浓度、DCW和D-泛酸产率分别达到46.5g/L、38.53g/L和0.28g/g葡萄糖(表2)。
实施例11：DPA02/pT-ppnk菌株在5L发酵罐中的20％溶氧反馈补料发酵培养中不同阶段的甜菜碱添加对D-泛酸合成的影响
D-泛酸的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)DPA02/pT-ppnk菌株的种子培养：
将-80℃甘油保藏的DPA02/pT-ppnk菌株划线于平板培养基上，培养箱中37℃活化培养12h，得到活化菌；平板培养基：蛋白胨8～10g/L、酵母提取物8～10g/L、NaCl 3～5g/L。挑取新鲜的、生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的试管中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养12h，获得一级种子液；之后，以1％的接种量转接到三瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为37℃，摇床转速180r/min，培养10h，获得二级种子液。
(2)DPA02/pT-ppnk菌株的分批补料发酵培养：
分批补料发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(1)得到的二级种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值10％。在发酵19h后开始流加补料培养基，直至发酵结束。中间取样测细胞生长量。所有分批补料培养均以初始葡萄糖浓度为20g/L的分批培养开始。分批发酵18h左右，使用发酵罐控制系统控制蠕动泵将补料培养基溶液泵入发酵罐。发酵条件：pH 6.8，温度30℃，通气速率和搅拌速度用于调控溶解氧浓度。为了研究甜菜碱的影响，在分批补料发酵过程中分别选择三个阶段，延迟期(12h)、对数生长期(48h)和后期(72h))添加甜菜碱到发酵体系中。如图5所示，在10～12h添加2g/L甜菜碱的20％溶氧反馈控制补料中的残留葡萄糖浓度、DCW、D-泛酸浓度和乙酸盐积累随时间变化的过程曲线图。在这种条件下，细胞浓度增加到55.18g/L，D-PA产量达到68.3g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产D-泛酸的基因工程菌及其应用方法
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1893
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)
<400> 1
atggctatcg aaatcaaagt accggacatc ggggctgatg aagttgaaat caccgagatc 60
ctggtcaaag tgggcgacaa agttgaagcc gaacagtcgc tgatcaccgt agaaggcgac 120
aaagcctcta tggaagttcc gtctccgcag gcgggtatcg ttaaagagat caaagtctct 180
gttggcgata aaacccagac cggcgcactg attatgattt tcgattccgc cgacggtgca 240
gcagacgctg cacctgctca ggcagaagag aagaaagaag cagctccggc agcagcacca 300
gcggctgcgg cggcaaaaga cgttaacgtt ccggatatcg gcagcgacga agttgaagtg 360
accgaaatcc tggtgaaagt tggcgataaa gttgaagctg aacagtcgct gatcaccgta 420
gaaggcgaca aggcttctat ggaagttccg gctccgtttg ctggcaccgt gaaagagatc 480
aaagtgaacg tgggtgacaa agtgtctacc ggctcgctga ttatggtctt cgaagtcgcg 540
ggtgaagcag gcgcggcagc tccggccgct aaacaggaag cagctccggc agcggcccct 600
gcaccagcgg ctggcgtgaa agaagttaac gttccggata tcggcggtga cgaagttgaa 660
gtgactgaag tgatggtgaa agtgggcgac aaagttgccg ctgaacagtc actgatcacc 720
gtagaaggcg acaaagcttc tatggaagtt ccggcgccgt ttgcaggcgt cgtgaaggaa 780
ctgaaagtca acgttggcga taaagtgaaa actggctcgc tgattatgat cttcgaagtt 840
gaaggcgcag cgcctgcggc agctcctgcg aaacaggaag cggcagcgcc ggcaccggca 900
gcaaaagctg aagccccggc agcagcacca gctgcgaaag cggaaggcaa atctgaattt 960
gctgaaaacg acgcttatgt tcacgcgact ccgctgatcc gccgtctggc acgcgagttt 1020
ggtgttaacc ttgcgaaagt gaagggcact ggccgtaaag gtcgtatcct gcgcgaagac 1080
gttcaggctt acgtgaaaga agctatcaaa cgtgcagaag cagctccggc agcgactggc 1140
ggtggtatcc ctggcatgct gccgtggccg aaggtggact tcagcaagtt tggtgaaatc 1200
gaagaagtgg aactgggccg catccagaaa atctctggtg cgaacctgag ccgtaactgg 1260
gtaatgatcc cgcatgttac tcacttcgac aaaaccgata tcaccgagtt ggaagcgttc 1320
cgtaaacagc agaacgaaga agcggcgaaa cgtaagctgg atgtgaagat caccccggtt 1380
gtcttcatca tgaaagccgt tgctgcagct cttgagcaga tgcctcgctt caatagttcg 1440
ctgtcggaag acggtcagcg tctgaccctg aagaaataca tcaacatcgg tgtggcggtg 1500
gataccccga acggtctggt tgttccggta ttcaaagacg tcaacaagaa aggcatcatc 1560
gagctgtctc gcgagctgat gactatttct aagaaagcgc gtgacggtaa gctgactgcg 1620
ggcgaaatgc agggcggttg cttcaccatc tccagcatcg gcggcctggg tactacccac 1680
ttcgcgccga ttgtgaacgc gccggaagtg gctatcctcg gcgtttccaa gtccgcgatg 1740
gagccggtgt ggaatggtaa agagttcgtg ccgcgtctga tgctgccgat ttctctctcc 1800
ttcgaccacc gcgtgatcga cggtgctgat ggtgcccgtt tcattaccat cattaacaac 1860
acgctgtctg acattcgccg tctggtgatg taa 1893
<210> 2
<211> 939
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)
<400> 2
atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc actactgtta 60
aaaacccaac tgccttcagg ttcagaactc tctctgtatg atatcgctcc agtgactccc 120
ggtgtggctg tcgatctgag ccatatccct actgctgtga aaatcaaagg tttttctggt 180
gaagatgcga ctccggcgct ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg 240
cgtaaaccgg gtatggatcg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 300
ctggtacagc aagttgcgaa aacctgcccg aaagcgtgca ttggtattat cactaacccg 360
gttaacacca cagttgcaat tgctgctgaa gtgctgaaaa aagccggtgt ttatgacaaa 420
aacaaactgt tcggcgttac cacgctggat atcattcgtt ccaacacctt tgttgcggaa 480
ctgaaaggca aacagccagg cgaagttgaa gtgccggtta ttggcggtca ctctggtgtt 540
accattctgc cgctgctgtc acaggttcct ggcgttagtt ttaccgagca ggaagtggct 600
gatctgacca aacgcatcca gaacgcgggt actgaagtgg ttgaagcgaa ggccggtggc 660
gggtctgcaa ccctgtctat gggccaggca gctgcacgtt ttggtctgtc tctggttcgt 720
gcactgcagg gcgaacaagg cgttgtcgaa tgtgcctacg ttgaaggcga cggtcagtac 780
gcccgtttct tctctcaacc gctgctgctg ggtaaaaacg gcgtggaaga gcgtaaatct 840
atcggtaccc tgagcgcatt tgaacagaac gcgctggaag gtatgctgga tacgctgaag 900
aaagatatcg ccctgggcga agagttcgtt aataagtaa 939
<210> 3
<211> 816
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 3
atgcccatgt caggcattga tgcaaagaaa atccgcaccc gtcatttccg cgaagctaaa 60
gtaaacggcc agaaagtttc ggttctcacc agctatgatg cgctttcggc gcgcattttt 120
gatgaggctg gcgtcgatat gctccttgtt ggtgattccg ctgccaacgt tgtgctgggt 180
cgcgatacca ccttgtcgat caccttggat gagatgattg tgctggccaa ggcggtgacg 240
atcgctacga agcgtgcgct tgtggtggtt gatctgccgt ttggtaccta tgaggtgagc 300
ccaaatcagg cggtggagtc cgcgatccgg gtcatgcgtg aaacgggtgc ggctgcggtg 360
aagatcgagg gtggcgtgga gatcgcgcag acgattcgac gcattgttga tgctggaatt 420
ccggttgtcg gccacatcgg gtacaccccg cagtccgagc attccttggg cggccacgtg 480
gttcagggtc gtggcgcgag ttctggaaag ctcatcgccg atgcccgcgc gttggagcag 540
gcgggtgcgt ttgcggttgt gttggagatg gttccagcag aggcagcgcg cgaggttacc 600
gaggatcttt ccatcaccac tatcggaatc ggtgccggca atggcacaga tgggcaggtt 660
ttggtgtggc aggatgcctt cggcctcaac cgcggcaaga agccacgctt cgtccgcgag 720
tacgccacct tgggcgattc cttgcacgac gccgcgcagg cctacatcgc cgatatccac 780
gcgggtacct tcccaggcga agcggagtcc ttttaa 816
<210> 4
<211> 840
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
atgcaggtag caaccacaaa gcaggcgctt atcgacgccc tcctccacca caaatccgtc 60
gggctcgtcc ccaccatggg tgcgctacac agcggacacg cctcgttggt taaagcagca 120
cgcgctgaaa acgacactgt tgtagccagt atttttgtca atcccctgca gtttgaagca 180
ctcggtgatt gcgatgatta ccgcaactat ccccgccaac tcgacgccga tttagcactg 240
cttgaagagg caggtgtgga tattgtgttc gcacccgatg tggaggaaat gtaccccggt 300
ggcttgccac tagtgtgggc gcgcaccggt tccatcggaa caaaattgga gggtgccagc 360
aggcctggcc atttcgatgg tgtggctacc gtggtggcga agctgttcaa tttggtgcgc 420
cctgatcgtg catattttgg acaaaaagat gctcagcagg ttgcggtgat tcggcgattg 480
gttgccgatc tagacattcc cgtggagatt cgtcccgttc cgattattcg tggcgccgat 540
ggcttagccg aatccagccg caatcaacgt ctttctgcgg atcagcgagc gcaagctctg 600
gtgctgccgc aggtgttgag tgggttgcag cgtcgaaaag cagctggtga agcgctagat 660
atccaaggtg cgcgcgacac cttggccagc gccgacggcg tgcgcttgga tcacctggaa 720
attgtcgatc cagccaccct cgaaccatta gaaatcgacg gcctgctcac ccaaccagcg 780
ttggtggtcg gcgcgatttt cgtggggccg gtgcggttga tcgacaatat cgagctctag 840
<210> 5
<211> 1476
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)
<400> 5
atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60
cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120
ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180
gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240
accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300
cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360
cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420
gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480
gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540
aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600
tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660
gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720
ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780
cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840
gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900
tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960
gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020
ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080
aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140
ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200
atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260
tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320
gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380
gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440
acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476
<210> 6
<211> 2932
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)
<400> 6
atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60
aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120
caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180
aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240
gcgttactga atcctgggac aacgctggtg agttttatct ggcctgcgca gaatccggaa 300
ttaatgcaaa aacttgcgga acgtaacgtg accgtgatgg cgatggactc tgtgccgcgt 360
atctcacgcg cacaatcgct ggacgcacta agctcgatgg cgaacatcgc cggttatcgc 420
gccattgttg aagcggcaca tgaatttggg cgcttcttta ccgggcaaat tactgcggcc 480
gggaaagtgc caccggcaaa agtgatggtg attggtgcgg gtgttgcagg tctggccgcc 540
attggcgcag caaacagtct cggcgcgatt gtgcgtgcat tcgacacccg cccggaagtg 600
aaagaacaag ttcaaagtat gggcgcggaa ttcctcgagc tggattttaa agaggaagct 660
ggcagcggcg atggctatgc caaagtgatg tcggacgcgt tcatcaaagc ggaaatggaa 720
ctctttgccg cccaggcaaa agaggtcgat atcattgtca ccaccgcgct tattccaggc 780
aaaccagcgc cgaagctaat tacccgtgaa atggttgact ccatgaaggc gggcagtgtg 840
attgtcgacc tggcagccca aaacggcggc aactgtgaat acaccgtgcc gggtgaaatc 900
ttcactacgg aaaatggtgt caaagtgatt ggttataccg atcttccggg ccgtctgccg 960
acgcaatcct cacagcttta cggcacaaac ctcgttaatc tgctgaaact gttgtgcaaa 1020
gagaaagacg gcaatatcac tgttgatttt gatgatgtgg tgattcgcgg cgtgaccgtg 1080
atccgtgcgg gcgaaattac ctggccggca ccgccgattc gggtatcagc tcagccgcag 1140
gcggcacaaa aagcggcacc ggaagtgaaa actgaggaaa aatgtacctg ctcaccgtgg 1200
cgtaaatacg cgttgatggc gctggcaatc attctttttg gctggatggc aagcgttgcg 1260
ccgaaagaat tccttgggca cttcaccgtt ttcgcgctgg cctgcgttgt cggttattac 1320
gtggtgtgga atgtatcgca cgcgctgcat acaccgttga tgtcggtcac caacgcgatt 1380
tcagggatta ttgttgtcgg agcactgttg cagattggcc agggcggctg ggttagctac 1440
cttagtttta tcgcggtgct tatagccagc attaatattt tcggtggctt caccgtgact 1500
cagcgcatgc tgaaaatgtt ccgcaaaaat taaggggtaa catatgtctg gaggattagt 1560
tacagctgca tacattgttg ccgcgatcct gtttatcttc agtctggccg gtctttcgaa 1620
acatgaaacg tctcgccagg gtaacaactt cggtatcgcc gggatggcga ttgcgttaat 1680
cgcaaccatt tttggaccgg atacgggtaa tgttggctgg atcttgctgg cgatggtcat 1740
tggtggggca attggtatcc gtctggcgaa gaaggttgaa atgaccgaaa tgccagaact 1800
ggtggcgatc ctgcatagct tcgtgggtct ggcggcagtg ctggttggct ttaacagcta 1860
tctgcatcat gacgcgggaa tggcaccgat tctggtcaat attcacctga cggaagtgtt 1920
cctcggtatc ttcatcgggg cggtaacgtt cacgggttcg gtggtggcgt tcggcaaact 1980
atgtggcaag atttcgtcta aaccattgat gctgccaaac cgtcacaaaa tgaacctggc 2040
ggctctggtc gtttccttcc tgctgctgat tgtatttgtt cgcacggaca gcgtcggcct 2100
gcaagtgctg gcattgctga taatgaccgc aattgcgctg gtattcggct ggcatttagt 2160
cgcctccatc ggtggtgcag atatgccagt ggtggtgtcg atgctgaact cgtactccgg 2220
ctgggcggct gcggctgcgg gctttatgct cagcaacgac ctgctgattg tgaccggtgc 2280
gctggtcggt tcttcggggg ctatcctttc ttacattatg tgtaaggcga tgaaccgttc 2340
ctttatcagc gttattgcgg gtggtttcgg caccgacggc tcttctactg gcgatgatca 2400
ggaagtgggt gagcaccgcg aaatcaccgc agaagagaca gcggaactgc tgaaaaactc 2460
ccattcagtg atcattactc cggggtacgg catggcagtc gcgcaggcgc aatatcctgt 2520
cgctgaaatt actgagaaat tgcgcgctcg tggtattaat gtgcgtttcg gtatccaccc 2580
ggtcgcgggg cgtttgcctg gacatatgaa cgtattgctg gctgaagcaa aagtaccgta 2640
tgacatcgtg ctggaaatgg acgagatcaa tgatgacttt gctgataccg ataccgtact 2700
ggtgattggt gctaacgata cggttaaccc ggcggcgcag gatgatccga agagtccgat 2760
tgctggtatg cctgtgctgg aagtgtggaa agcgcagaac gtgatcgtct ttaaacgttc 2820
gatgaacact ggctatgctg gtgtgcaaaa cccgctgttc ttcaaggaaa acacccacat 2880
gctgtttggt gacgccaaag ccagcgtgga tgcaatcctg aaagctctgt aa 2932
<210> 7
<211> 963
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 7
atgactgcac ccacgaacgc tggggaactc aggcgagttt tgctggttcc acacaccggg 60
cgttcttcca atattgaatc cgccatcttg gcagccaagc tgctcgacga tgctggaatc 120
gatgtgaggg tgctgatcaa tgatgcagat gatccaattg cagagcactc cgttttaggc 180
cgtttcaccc atgtcaggca cgctgcagac gccgctgacg gcgcagaact agttctggtg 240
ctgggtggag atggcacctt cctccgcgca gcagatatgg cccacgctgt tgatttgcct 300
gttctgggca tcaacctagg ccatgtggga ttcttggctg aatgggagtc tgactcactt 360
gaagaggcac tcaaacgtgt gatcgaccgc gattaccgta ttgaagatcg catgacctta 420
actgtcgttg tcctagacgg cggtggagaa gaaatcggcc gaggctgggc tctcaatgag 480
gtcagtattg aaaacttaaa ccgcagggga gtgctcgatg caaccctcga ggtagatgca 540
cgaccagttg cttcctttgg ttgcgatggc gtgctgattt ccaccccaac cggctccacc 600
gcttatgcat tttccgccgg tggtcctgta ctgtggccag aactcgatgc catcttggtg 660
gttcctaata acgcccacgc gctgtttacc aaaccgctgg ttgtgagccc aaaatccacc 720
gtagctgtgg aatccaattc agatacttca gcagcgatgg ccgtcatgga tggtttccgt 780
cccattccta tgcctccagg atcccgtgtt gaggtcacca ggggtgagcg tcccgtgcgt 840
tgggtgaggc ttgattcttc accgtttacc gaccgacttg tgagcaaatt aaggctcccc 900
gttaccggtt ggcggggtcc gcaaaaacag gcggaaaata aagatcccag gtcagcgggg 960
taa 963
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatactagt aaagagatca aagtgaacgt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctctaaaac acgttcactt tgatctcttt actagtatta tacctaggac 50
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaacgaaaac taccacatgc 20
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagaaaaaag ccgtctttta cctcttacgc cag 33
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtaagaggta aaagacggct tttttctggt aatct 35
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgtcgaagt tgatcacggt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccggcttac gcttacgaag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcagtggag tcccagatac 20
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctttttttga attctctaga cagcaccaaa cttggtcaac at 42
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attacttatt cctaaactcc ttattatatt ga 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagtttagg aataagtaat tgattagcgg at 32
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atagatctaa gcttctgcag tcgaatcggt ctgaaccc 38
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctgcagaagc ttagatctat taccc 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctagagaat tcaaaaaaag caccg 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttcttcaatg gactggaggt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tacaacctcg ggcagaccat 20
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccatggaatt cgagctcggt atggcggtaa cgcaaacagc 40
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctgcaggtcg actctagagg ttactcaaac tcattccagg aacg 44
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctctagagt cgacctgcag gc 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
accgagctcg aattccatgg 20
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccatggaatt cgagctcggt atgcgaattg gcataccaag a 41
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctgcaggtcg actctagagg ttacagagct ttcaggattg catc 44
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctctagagt cgacctgcag gc 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
accgagctcg aattccatgg 20
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccatggaatt cgagctcggt atgactgcac ccacgaacgc t 41
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctgcaggtcg actctagagg ttaccccgct gacctgggat ct 42
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cctctagagt cgacctgcag gc 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
accgagctcg aattccatgg 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccaattcaga tacttcagc 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tggcagttcc ctactctcg 19

Claims (6)

1.一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建获得：
（1）以保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌为出发菌株，敲除aceF和mdh两个基因，获得菌株DPA02；
（2）将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB与panC基因，以及ppnk基因在菌株DPA02中过表达获得高产D-泛酸的基因工程菌，
aceF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；mdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ppnk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
步骤（2）中将panB基因、panC基因以及ppnk基因同时克隆到pTrc99A质粒中，获得质粒pTrc99A-panBC-ppnk，将该质粒转入菌株DPA02中进行独立过表达，获得高产D-泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，敲除aceF和mdh两个基因时使用CRISPR-Cas9基因编辑技术。
3.如权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵过程中控制发酵体系pH维持在6.6~6.8，温度维持在28~30℃。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在发酵延迟期添加2 g/L的甜菜碱，缓解发酵系统中所述基因工程菌对渗透压的敏感。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵起始时使用发酵培养基，并依据20%溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~20 g/L、(NH4)2SO4 12~16 g/L、KH2PO4 1~2 g/L、MgSO4 0.3~0.5 g/L、酵母提取物1~2 g/L、0.5~1 ml/L微量元素溶液，50~75 mg/L Kan抗生素，0.1~0.2 mM的IPTG，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：5~10 g/LCoCl2、5~10 g/L FeSO4·7H2O、0.5~1 g/L ZnSO4·7H2O、0.10~0.20 g/L CuSO4、0.01~0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水；
补料培养基：葡萄糖400~500 g/L，酵母提取物 1~2g/L，硫酸铵8~10 g/L，硫酸镁6~8g/L，磷酸二氢钾10~14 g/L，β-丙氨酸35~40 g/L，异亮氨酸0.1~0.16 g/L，VB1 8~10 mg/L，VB12 2~4 mg/L，Kan抗生素 50~75 mg/L，IPTG 72~96 mg/L，金属盐溶液1~2 mL/L，消泡剂1~2 mL/L。
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