CN116024278B - 一种发酵法制备d-泛酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵法制备D‑泛酸的方法,是通过在利用D‑泛酸生产菌株发酵生产D‑泛酸的过程中,向发酵体系中额外添加甲基供体的同时添加甲基供体的载体,大大提高了D‑泛酸的合成产量。通过本发明提供的制备方法得到的D‑泛酸产量高、杂质含量低,同时该制备方法简单,添加的甲基供体和甲基供体的载体容易得到,成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,具体涉及一种发酵法制备D-泛酸的方法。
背景技术
D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的水溶性维生素,应用于制药、食品、化妆品、饲料等行业。DPA是维生素B复合物的成员,其是哺乳动物天然所需要的。细胞中,DPA主要用于辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的生物合成。目前,DPA的制备主要分为化学-酶法以及生物发酵法两种制备方法,化学法制备工艺较为复杂、且容易造成工业污染等。
近年来随着技术理念的发展,环保和成本的限制,D-泛酸发酵生产变得越来越可行。现有的对微生物发酵法的研究主要集中在菌种构建以及代谢研究,比如通过增强DPA合成途径中各种酶基因(panB、panC等)的表达或者是削弱DPA合成的竞争支路等方式构建多种生物工程菌以合成DPA。但,由于不同代谢途径之间的非线性关系,以及辅助因子与主要代谢途径之间的竞争与协作,代谢工程改造往往从多个角度进行,因而构建新的更加高产的菌株以进一步提高D-泛酸的产量较为困难。
发明内容
本发明旨在提供一种制备工艺简单、产量高且杂质少的发酵法制备D-泛酸的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种发酵法制备D-泛酸的方法,在利用D-泛酸生产菌株发酵生产D-泛酸的过程中,向发酵体系中添加甲基供体,同时添加甲基供体的载体。
优选地,所述甲基供体为氯化胆碱、多聚甲醛、蛋氨酸、甜菜碱和甲酸中的一种或多种。
优选地,所述甲基供体的载体为叶酸。
优选地,控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.02g/L~2g/L,例如,0.08g/L,0.16g/L,0.2g/L,0.3g/L,0.46g/L,0.5g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L等。
进一步优选地,控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/L~1g/L。
更进一步优选地,控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/L~0.5g/L。
优选地,控制所述甲基供体在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/L~5g/L。
优选地,控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/L~5g/L,例如,0.8g/L,1.2g/L,1.6g/L,2.2g/L,2.6g/L,3.4g/L,3.8g/L,4.4g/L,4.6g/L等。
进一步优选地,控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为1g/L~3g/L。
更进一步优选地,控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/L~2.5g/L。
优选地,控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/L~3g/L,例如,0.3g/L,0.8g/L,1.2g/L,1.6g/L,2.2g/L,2.6g/L等。
进一步优选地,控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/L~2g/L。
更进一步优选地,控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/L~2g/L
优选地,控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/L~5g/L,例如,0.8g/L,1.2g/L,1.6g/L,2.2g/L,2.6g/L,3.4g/L,3.8g/L,4.4g/L,4.6g/L等。
进一步优选地,控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为1g/L~3g/L。
更进一步优选地,控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/L~2.5g/L。
优选地,控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/L~5g/L,例如,0.8g/L,1.2g/L,1.6g/L,2.2g/L,2.6g/L,3.4g/L,3.8g/L,4.4g/L,4.6g/L等。
进一步优选地,控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为1g/L~3g/L。
更进一步优选地,控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/L~2.5g/L。
优选地,控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/L~5g/L,0.8g/L,1.2g/L,1.6g/L,2.2g/L,2.6g/L,3.4g/L,3.8g/L,4.4g/L,4.6g/L等。
进一步优选地,控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为1g/L~3g/L。
更进一步优选地,控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/L~2.5g/L。
优选地,在所述发酵生产的过程中第10~35小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。
进一步优选地,在所述发酵生产的过程中第18~26小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。
更进一步优选地,在所述发酵生产的过程中第19~22小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。
优选地,所述发酵生产的底物为葡萄糖。
优选地,所述葡萄糖在所述发酵体系中的起始浓度为15g/L~30g/L,例如,16g/L,22g/L,26g/L,28g/L等。
进一步优选地,所述葡萄糖在所述发酵体系中的起始浓度为18g/L~25g/L。
优选地,当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于5g/L,向所述发酵体系投加葡萄糖。
优选地,当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于设定值(5g/L)时,向所述发酵体系投加葡萄糖至所述葡萄糖在所述发酵体系中的浓度为15g/L~30g/L。
进一步优选地,当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于设定值时,向所述发酵体系投加葡萄糖至所述葡萄糖在所述发酵体系中的浓度为15g/L~26g/L。
优选地,所述发酵体系中还包括其他组份,所述其他组份及所述其他组份在所述发酵体系中的起始浓度分别为:硫酸铵5g/L~20g/L,磷酸二氢钾1g/L~5g/L,硫酸镁1.2g/L~3.0g/L,酵母提取物2g/L~8.0g/L,MOPS 60g/L~100g/L以及微量元素2mL/L~8mL/L,溶剂为去离子水。
进一步优选地,所述其他组份及所述其他组份在所述发酵体系中的起始浓度分别为:硫酸铵8g/L~15g/L,磷酸二氢钾1.5g/L~3g/L,硫酸镁1.5g/L~2.5g/L,酵母提取物3g/L~6.0g/L,MOPS 70g/L~90g/L以及微量元素3mL/L~6mL/L,溶剂为去离子水。
优选地,FeSO4·7H2O 8g/L~15g/L、CaCl2 1g/L~2g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L~3g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L~1g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L~2g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.05g/L~0.2g/L、Na2B4O7·10H2O 0.1g/L~0.5g/L、CoCl2·6H2O 0.2g/L~0.8g/L、30%~40% HCl8mL/L~15mL/L。
进一步优选地,所述微量元素包括FeSO4·7H2O 9g/L~12g/L、CaCl2 1.2g/L~1.6g/L、ZnSO4·7H2O 2.1g/L~2.6g/L、MnSO4·4H2O 0.3g/L~0.8g/L、CuSO4·5H2O 0.8g/L~1.5g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.08g/L~0.15g/L、Na2B4O7·10H2O 0.1g/L~0.3g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L~0.5g/L、32%~36% HCl 9mL/L~12mL/L。
优选地,所述发酵生产的时间为35~50小时。
进一步优选地,所述发酵生产的时间为38~45小时。
优选地,所述发酵生产的条件为:温度为36℃~38℃,pH为6.8~7.0,转速为210rpm~250rpm。
进一步优选地,所述发酵生产的条件为:温度为36.5℃~37.5℃,pH为6.8~7.0,转速为210rpm~230rpm。
优选地,所述生产菌株为通过基因工程构建的工程菌E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE。
优选地,所述制备D-泛酸的方法的具体步骤为:
(1)活化生产,将所述生产菌株接种到平板培养基活化生产菌株;
(2)种子生产,将步骤(1)得到的生产菌株接种至种子培养基进行种子生产,获得种子液;
(3)发酵生产,将步骤(2)得到的种子液接种至所述发酵体系进行发酵培养;发酵培养过程中,每隔3~5小时,用氨水调节发酵体系的pH,使发酵体系的pH为6.8~7.0;用生物传感分析仪检测发酵体系中葡萄糖的含量,当发酵体系中葡萄糖浓度低于5g/L时,向发酵体系投加葡萄糖,控制发酵体系中葡萄糖的浓度为15g/L~30g/L;在发酵生产的过程中第18~26小时向发酵体系中加入甲基供体的同时添加甲基供体的载体。
进一步优选地,发酵培养过程中,每隔3.5~4.5小时用氨水调节发酵体系的pH。
优选地,所述种子液接种量为所述发酵体系体积的2%~6%。
进一步优选地,所述种子液接种量为所述发酵体系体积的2.5%~5%。
与现有技术相比,本发明具有如下优势:
本发明通过额外向发酵培养体系中添加甲基供体和甲基供体的载体,有效提高了D-泛酸的合成产量,降低了杂质含量。而且本发明提供的制备工艺简单,且添加的甲基供体和甲基供体的载体容易得到,成本较低。
附图说明
图1为本发明中D-泛酸合成路线示意图;
图2为本发明中杂质X的质谱图谱;
图3为本发明中杂质Y的质谱图谱;
图4为本发明中实施例1发酵液中D-泛酸(6.167min)、杂质X(3.767min)和杂质Y(6.830min)液相检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整,未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
微生物体内D-泛酸合成途径复杂,受诸多因素的影响,且微生物在生长的不同阶段对环境条件要求也不同,因此对D-泛酸发酵过程的控制是整个生产的关键。为了提供一种生产工艺简单且产量高的发酵法制备D-泛酸的方法,发明人对发酵培养过程的控制策略进行了大量摸索,意外发现,在发酵培养过程中额外向发酵培养体系中添加一定浓度的甲基供体的同时添加甲基供体的载体,能够提高D-泛酸的产量,同时降低杂质的生成。具体地,在发酵培养过程第18~26小时额外向发酵体系添加甲基供体的同时添加甲基供体的载体,尤其是添加氯化胆碱、多聚甲醛、蛋氨酸、甜菜碱和甲酸中的一种或多种的同时添加叶酸,对于D-泛酸的产量的提高以及杂质的降低效果尤为显著。
本发明中额外添加的甲基供体同时添加的甲基供体的载体能够参与到泛解酸合成途径,确保流向泛解酸合成途径的前体物充足,促进该支路的合成代谢顺畅进行,避免前体物之前的合成途径中的中间产物增多,进而降低杂质的生成。
本发明提供一种发酵法制备D-泛酸的方法,具体的制备方法如下:
(1)将生产菌株接种到LB固体培养基上活化培养,于36℃~38℃条件下培养10h~12h,得到活化的生产菌株;
(2)将步骤(1)中得到的活化的生产菌株接种到LB液体培养基中,于36℃~38℃、210rpm~230rpm条件下培养10h~12h,得到种子液;
(3)将步骤(2)得到的种子液按照2%~5%的接种量接种于发酵培养基中,于36℃~38℃、210rpm~230rpm条件下培养35~50小时。
在步骤(3)中,每隔3~5小时,用氨水调节发酵培养基的pH,维持发酵培养基的pH为6.8~7.0;用生物传感分析仪检测发酵培养基中葡萄糖的含量,当发酵培养基中葡萄糖浓度低于5g/L时,向发酵培养基投加葡萄糖,控制发酵培养基中葡萄糖的浓度为15g/L~30g/L;在发酵生产的过程中第18~26小时向发酵培养基中加入甲基供体的同时添加甲基供体的载体。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
本实施例1提供一种发酵法制备D-泛酸的方法,其合成代谢途径如图1所示。
(1)生产菌株构建
本发明D-泛酸的生产菌株的构建方法参见专利CN2022102145885,具体方法如下:
1)过表达D-泛酸终端合成途径基因的重组质粒的构建
以P1和P2为引物,以野生型大肠杆菌K12 MG1655菌株的基因组DNA为模板,使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar,PCR扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,其中10nt~45nt为启动子trc,74nt~868nt为panB基因的编码序列,880nt~1731nt为panC基因的编码序列。引物P1上设计引入强启动子trc,P1和P2引物5’端分别设计BamHI和SphI限制性核酸内切酶位点。PCR程序为:98℃变性30秒,65℃退火15秒,72℃延伸90秒,26个循环,获得约1800bp的Ptrc-panBC基因片段。
P1: (如SEQ ID No.10所示,下划线所示序列为BamHI酶切识别位点,斜体为启动子trc的序列);
P2:5’-ACATGCATGCCCTGTGTTATGACAGATGAC-3’(如SEQ ID No.11所示,下划线所示序列为SphI酶切识别位点)。
PCR扩增得到的Ptrc-panBC产物,凝胶电泳鉴定回收后,使用BamHI和SphI双酶切,同时双酶切pACYC184质粒。切胶回收上述PCR电泳条带,使用限制性内切酶BamHI和SphI双酶切上述扩增的Ptrc-panBC基因的DNA片段和pACYC184质粒。凝胶电泳回收双酶切的Ptrc-panBC和pACYC184质粒,使用T4连接酶连接后,连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,复苏1小时后涂布氯霉素平板。涂布后的平板置于37℃培养箱12小时,挑取单菌落传代,提取重组质粒后进行测序,获得正确的重组质粒pACYC184-panBC。
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板,以P3和P4为引物,PCR扩增得到的序列如SEQ ID No.4所示,其中11nt~45nt为PJ23119启动子,66nt~977nt为panE基因的编码序列,988nt~1731nt为终止子序列。扩增引物P3上设计启动子PJ23119,引物P4上设计终止子L3S2P56序列,P3和P4引物5’端分别设计SphI和BsaBI限制性核酸内切酶位点。使用上述的PCR反应条件,扩增得到的PJ23119-panE产物,凝胶电泳鉴定回收后,使用SphI和BsaBI双酶切,同时双酶切pACYC184-Ptrc-panBC质粒。凝胶电泳回收双酶切的PJ23119-panE和pACYC184-panBC质粒,使用T4连接酶连接后,连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,复苏1小时后涂布氯霉素平板。涂布后的平板置于37℃培养箱12小时,挑取单菌落传代,提取重组质粒后进行测序,获得正确的重组质粒pACYC184-panBCE,从而获得了过表达D-泛酸终端合成途径基因的重组质粒。
P3: (如SEQ ID No.12所示,下划线所示序列为SphI酶切识别位点,斜体为启动子J23119的序列);
P4: (如SEQ ID No.13所示,下划线所示序列为BsaBI酶切识别位点,斜体为L3S2P56终止子序列)。
2)工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH的构建
应用已报道的包含pCas9和pTargetF载体的CRISPR-Cas9基因编辑系统(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.L.,Sun,B.B.,Yang,J.J.,and Yang,S.(2015)Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Appl Environ Microb81,2506-2514.)。
使用NEB公司的基因突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit,货号E0552S),按照试剂盒说明书设计引物P5和P6突变pTargetF载体。突变后的N20序列为CTTTCCAAGCTGGGTCTACC(如SEQ ID NO.49所示),靶向avtA基因。突变后的pTargetF命名为pTargetFavtA。
P5:5’-TGGGTCTACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(如SEQ ID NO.14所示);
P6:5’-GCTTGGAAAG GACTAGTATTATACCTAGG-3’(如SEQ ID NO.15所示);
P7:5’-CG GACTGGAAGAAGATCTG-3’(如SEQ ID NO.16所示);
P8:5’-TTTCTTAGACGTCGGAATTGAGACTCATGCACAGCACGA-3’(如SEQ ID NO.17所示);
P9:5’-TCGTGCTGTGCATGAGTCTCAATTCCGACGTCTAAGAAAC-3’(如SEQ IDNO.18所示);
P10:5’-GATCTCCTTTTTAAGTGAACTTGGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’(如SEQ ID NO.19所示);
P11:5’-ATCAGCAGGACGCACTGACCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATC-3’(如SEQ ID NO.20所示);
P12:5’-TGCCGTTCATATTGGTGATGCAAAAAACCCCTCAAGACC-3’(如SEQ IDNO.21所示);
P13:5’-GGTCTTGAGGGGTTTTTTGCATCACCAATATGAACGGCA-3’(如SEQ IDNO.22所示);
P14:5’-GCTGATAGAG CTGCTTGGT-3’(如SEQ ID NO.23所示);
P15:5’-GGAGCTACTCACACTGCTTG-3’(如SEQ ID NO.24所示);
P16:5’-CGCATACATT GATGCGTATG-3’(如SEQ ID NO.25所示)。
在基因合成公司合成了来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis天冬氨酸α-脱羧酶基因panD(如SEQ ID No.1所示),在定制合成上述panD基因序列时,通过同义密码子替换去除XbaI和HindIII限制性内切酶序列。在定制合成上述panD基因序列时,在每个panD序列前同时合成了相同的BCD2序列(如SEQ ID No.2所示),同时在BCD2-panD序列的两端加入XbaI和HindIII限制性酶切位点。合成后的序列连接到载体上。使用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切上述合成BCD2-panD的载体和pET28a(+)质粒,凝胶电泳回收得到酶切后的BCD2-panD的基因片段和线性化载体段,进一步使用T4连接酶连接这两个片段,连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选,获得含有重组质粒的转化子。转化子扩培后提取质粒并将其送测序,验证获得正确的质粒pET28a-BCD2-panDBl。
使用引物P7和P8扩增avtA基因上游序列,使用引物P9和P10扩增PL启动子,使用引物P11和P12,以pET28a-BCD2-panDBl为模板扩增获得BCD2-panDBl-Ter基因片段,使用引物P13和P14扩增avtA基因下游序列。通过重叠PCR连接上述4个片段,获得4个DNA片段的组合体DonorBl(如SEQ ID No.5所示),作为基因编辑的模板。其中SEQ ID No.5的1nt~312nt为靶基因avtA基因上游序列,313nt~474nt为PL启动子,475nt~560nt为BCD2序列,560nt~943nt为panDBl序列,944nt~995nt为终止子序列,996nt~1261nt为avtA基因下游序列。
将pCas9质粒转化入MG1655涂布含有50mg/L卡那霉素抗性平板,30℃培养,获得菌株MG655/pCas9。挑取MG1655/pCas9菌苔于50mL含卡那霉素的LB的500mL摇瓶中,30℃,220rpm培养,当培养基OD600为0.2时加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导,OD600为0.45时制备感受态细胞。取2微升pTargetFavtA质粒和10微升DonorBs模板DNA,电转化至MG655/pCas9感受态细胞,涂布含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的双抗性平板,30℃培养。使用引物P15和P16鉴定在avtA基因上整合PPL-BCD2-panD-Ter的单菌落,测序验证大小正确的PCR产物。挑选测序正确的单菌落,加入0.2mM的IPTG培养,消除pTargetFavtA质粒,获得工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl/pCas,按照上述方法制备感受态备用。
工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl/pCas接入无抗性的LB液体培养基,37℃培养12小时,稀释涂布LB平板,分别获得消除pCas质粒的工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl。基因panD插入染色体avtA基因的编码序列,导致AvtA失活,弱化了缬氨酸竞争代谢途径。
野生型大肠杆菌K12 MG1655的ilvG基因突变,其编码的乙酰乳酸合成酶没有活性。本发明在大肠杆菌MG1655的染色体上引入了大肠杆菌BL21的具有活性的ilvG基因,提高了D-泛酸的前体乙酰乳酸的合成。本发明在大肠杆菌K12 MG1655的染色体上插入了来源于大肠杆菌BL21的ilvG+M基因,且使用trc强启动子调控ilvG+M的转录起始,使用终止子Ter调控ilvG+M的转录终止。ilvG+M基因整合到avtA基因的另外一个N20靶序列。使用上述突变试剂盒和引物P17和P18突变pTargetF载体,突变后pTargetF命名为pTargetFavtA1。P17:5’-ACGGTCCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(如SEQ ID NO.26所示);
P18:5’-CGTAGTTACA GACTAGTATTATACCTAGG-3’(如SEQ ID NO.27所示);
P19:5’-GGCAGAAAAT CAGCCAGTTC-3’(如SEQ ID NO.28所示);
P20:5’-TCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGAACTCTGTAGCAAGG AAGG-3’(如SEQ ID NO.29所示);
P21:5’-TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGACAAGATTCAGGACGGG GAAC-3’(如SEQ ID NO.30所示);
P22:5’-CGAAAAAAGACGCTCTAAAAGCGTCTCTTTTCTGGTATATTCCTTTTGCGCT CAG-3’(如SEQ ID NO.31所示);
P23:5’-CAGAAAAGAGACGCTTTTAGAGCGTCTTTTTTCGTTTTGGAGCTACTCACAC TGCTTG-3’(如SEQ ID NO.32所示);
P24:5’-GCCAATATGC AGATGCTCATGAGCATCTGCATATTGGC-3’(如SEQ ID NO.33所示);
P25:5’-CACGTTCGGATATGAACTG-3’(如SEQ ID NO.34所示);
P26:5’-CGTCAAGCTT CAGCAACTC-3’(如SEQ ID NO.35所示)。
使用引物P19和P20扩增avtA基因上游序列,使用引物P21和P22扩增E.coli BL21的ilvG+M序列,使用引物P23和P24扩增avtA基因下游序列。通过引物P20和P21引入trc启动子5’-TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA-3’(如SEQ ID NO.8所示),通过引物P22和P23引入终止子序列5’-CCAGAAAAGAGACGCTTTTAGAGCGTCTTTTTTC GTTTT-3’(如SEQ ID NO.9所示)。使用重叠PCR连接上述3个片段,获得组合体DonorilvGM(如SEQ ID No.6所示),作为基因编辑的模板。SEQ ID No.6的1nt~305nt为靶基因avtA基因上游序列,306nt~341nt为trc启动子,367nt~2013nt为源于E.coli BL21的ilvG+基因的编码序列,2010nt~2273nt为ilvM基因的编码序列,2274nt~2328nt为终止子序列,2329nt~2629nt为avtA基因下游序列。
取2微升pTargetFavtA1质粒和10微升DonorilvGM模板DNA,电转化至E.coliMG1655avtA:panDBl/pCas感受态细胞,涂布含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的双抗性平板,30℃培养。使用引物P25和P26鉴定在avtA基因上整合Ptrc-ilvG+M-Ter的单菌落,测序验证大小正确的PCR产物。挑选测序正确的单菌落,加入0.2mM的IPTG培养,消除pTargetFavtA1质粒。进一步接入无抗性的LB液体培养基,37℃培养12小时,稀释涂布LB平板,分别获得消除pCas质粒的工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M。通过在染色体上整合有活性的ilvG+M,提高了D-泛酸前体乙酰乳酸的合成。
使用上述突变试剂盒和引物P27和P28突变pTargetF载体的N20序列,突变后pTargetF命名为pTargetFcadA。
P27:5’-TCATATCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(如SEQ ID NO.36所示);
P28:5’-CTATGAACGT GACTAGTATTATACCTAGG-3’(如SEQ ID NO.37所示);
P29:5’-GTTGCGT GTTCTGCTTCATC-3’(如SEQ ID NO.38所示);
P30:5’-CCAGTTGGTGTTAATGTTTTGCTCCCAACACATGGGACA-3’(如SEQ IDNO.39所示);
P31:5’-TGTCCCATGTGTTGGGAGCAAAACATTAACACCAACTGG-3’(如SEQ IDNO.40所示);
P32:5’-CTCCTTAGCATGATTAAGATGGTGAATAAAAGGTTGCCTGT-3’(如SEQ IDNO.41所示);
P33:5’-ACAGGCAACCTTTTATTCACCATCTTAATCATGCTAAGGAG-3’(如SEQ IDNO.42所示);
P34:5’-GCTAATTTCTTCGCACAGCTGGACCAAAACGAAAAAAGACG(如SEQ IDNO.43所示);
P35:5’-CGTCTTTTTTCGTTTTGGTCCAGCTGTGCGAAGAAATTAGC-3’(如SEQ IDNO.44所示);
P36:5’-TCGTCAGTGGTCTGCTTGA-3’(如SEQ ID NO.45所示);
P37:5’-CTACTCTTGCGTTGACCTGA-3’(如SEQ ID NO.46所示);
P38:5’-GTGACCAGGAGTACAGAAAG-3’(如SEQ ID NO.47所示)。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板,使用引物P29和P30扩增cadA基因上游序列,使用引物P31和P32扩增gapA启动子,使用引物P35和P36扩增cadA基因下游序列。从基因合成公司合成了含RBS和终止子的aspDH基因,使用引物P33和P34扩增RBS-aspDH-Ter序列。通过重叠PCR连接上述4个片段,获得组合体DonoraspDH(如SEQ ID No.7所示),作为基因编辑的模板。SEQ ID No.7的1nt~210nt为靶基因cadA基因上游序列,211nt~480nt为gapA启动子,481nt~509nt为RBS序列,510nt~1307nt源于戴尔福特菌Csl-4的aspDH基因的编码序列(如SEQ ID No.48所示),1308nt~1360nt为终止子序列,1361nt~1535nt为cadA基因下游序列。
取2微升pTargetFcadA质粒和10微升DonoraspDH模板DNA,电转化至E.coliMG1655avtA:panDBl-ilvG+M/pCas感受态细胞,涂布含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的双抗性平板,30℃培养。使用引物P37和P38鉴定在cadA基因上整合PgapA-aspDH-Ter的单菌落,测序验证大小正确的PCR产物。挑选测序正确的单菌落,加入0.2mM的IPTG培养,消除pTargetFcadA质粒。进一步接入无抗性的LB液体培养基,37℃培养12小时,稀释涂布LB平板,获得消除pCas质粒的工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH。
3)工程菌E.coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE的构建
将上述构建的载体pACYC184-panBCE转化至上述工程菌E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH,进而获得本发明的生产菌株E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE。
(2)活化培养
将上述生产菌株划线接种到含34mg/L氯霉素的LB固体培养基平板上活化培养,于37℃条件下培养12h,得到活化的生产菌株。
挑取LB固体培养基上的菌株,接种至斜面LB培养基中,37℃静置培养10~12h后进行菌株保存。
(3)种子培养
挑取步骤(2)中生长良好的菌株,接种到含34mg/L氯霉素的LB液体培养基中,于37℃、220rpm条件下振荡培养12h,得到种子液。
(4)发酵
按照3%的接种量,将步骤(3)得到的种子液接种至20mL发酵培养基中,于37℃、220rpm条件下振荡培养40小时。
发酵培养基组份及浓度为:MOPS 80g/L,葡萄糖20g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水硫酸镁2g/L、酵母粉5g/L、微量元素混合液5mL/L,余量为去离子水。
微量元素混合液各组份为:FeSO4·7H2O 10g/L、CaCl2 1.35g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、MnSO4·4H2O 0.5g/L、CuSO4·5H2O 1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O 0.48g/L、35% HCl 10mL/L,余量为去离子水。
在发酵生产过程中,每隔4小时取样一次检测发酵培养基的pH,用氨水调节发酵培养基的pH,使其维持在6.8~7.0。
在发酵生产过程中,用生物传感分析仪SBA-40D检测发酵培养基中葡萄糖的含量,当发酵培养基中葡萄糖浓度低于5g/L时,向发酵培养基投加葡萄糖,使发酵培养基中葡萄糖的浓度达到20g/L;在发酵生产的过程中第20小时向发酵培养基中加入叶酸0.4g/L和氯化胆碱1g/L。
发酵菌株在合成D-泛酸的同时会产生杂质X和杂质Y,杂质质谱图见图2和图3,其中杂质X和杂质Y的结构式如下:
在投加叶酸和氯化胆碱20小时后,采用液相法对发酵体系中D-泛酸产量、杂质X和杂质Y进行测定。具体的测定的方法为:取发酵液5mL,10000r/min,离心5min,取上清液,用纯化水将样品稀释40倍左右之后,经0.22μm滤膜过滤,采用ZORBAX SB-Aq 5μm 4.6×150mm型号色谱柱进行液相分析。色谱条件:流速1.2mL/min,检测波长200nm;进样量10μL;柱温35℃。以D-泛酸钙为标品定量,以D-泛酸钙计发酵液中D-泛酸浓度,杂质X、Y浓度以D-泛酸钙标准曲线计算,检测图谱见图4,结果见表1。
结果显示,添加叶酸和氯化胆碱之后D-泛酸产量提高至6.4g/L。
实施例2
本实施例与实施例1中的制备方法基本相同,不同之处在于,在发酵生产过程中添加0.4g/L的叶酸和2g/L的氯化胆碱。
在投加上述物质20小时后,用液相法对发酵体系中D-泛酸产量、杂质X和杂质Y进行测定,结果见表1。
结果显示,该实施例的D-泛酸产量提高至6.52g/L。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同,不同之处在于,在发酵生产过程中的第26小时向发酵体系中投加叶酸和氯化胆碱。
在投加上述物质14小时后,用液相法对发酵体系中D-泛酸产量、杂质X和杂质Y进行测定,结果见表1。
结果显示,该实施例的D-泛酸产量提高至6.28g/L。
实施例4
本实施例与实施例1中基本相同,不同之处在于,在发酵生产过程中添加0.4g/L的叶酸和1g/L的甜菜碱。
在投加上述物质20小时后,用液相法对发酵体系中D-泛酸产量、杂质X和杂质Y进行测定,结果见表1。
结果显示,该实施例的D-泛酸产量提高至6.34g/L。
对比例1
该对比例与实施例1中的制备方法基本相同,不同之处在于,该对比例不添加氯化胆碱。
在发酵培养40小时后,用液相法对发酵体系中D-泛酸产量、杂质X和杂质Y进行测定,结果见表1。
结果显示,该对比例的D-泛酸产量为5.55g/L。
表1
实验 | D-泛酸浓度g/L | 杂质X g/L | 杂质Y g/L |
对比例1 | 5.55 | 2.48 | 1.49 |
实施例1 | 6.4 | 1.86 | 1.05 |
实施例2 | 6.52 | 2.0 | 0.91 |
实施例3 | 6.28 | 2.11 | 1.26 |
实施例4 | 6.34 | 1.95 | 1.12 |
以上结果显示:
实施例1与对比例1相比,D-泛酸产量提高了15.3%,且杂质X和杂质Y分别减少了25.0%和29.5%。
实施例2与对比例1相比,D-泛酸产量提高了17.5%,且杂质X和杂质Y分别减少了19.4%和38.9%。
实施例3与对比例1相比,D-泛酸产量提高了13.2%,且杂质X和杂质Y分别减少了14.9%和15.4%。
实施例4与对比例1相比,D-泛酸产量提高了14.2%,且杂质X和杂质Y分别减少了21.4%和24.8%。
综上,本发明通过在发酵过程中额外向发酵培养基中同时添加甲基供体和添加甲基供体的载体的策略,尤其是,在发酵生产的过程中第18~26小时向发酵培养基中加入一定浓度的甲基供体和甲基供体的载体,达到了提高D-泛酸的产量的积极效果,并且能够减少杂质的生成。同时该制备方法简单,添加的甲基供体和甲基供体载体容易得到,成本较低。
以上对本发明做了详尽的描述,其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,在利用D-泛酸生产菌株发酵生产D-泛酸的过程中,在第19~22小时向发酵体系中添加甲基供体,同时添加甲基供体的载体;所述发酵生产的时间为35~50小时;所述甲基供体为氯化胆碱,所述甲基供体的载体为叶酸;所述D-泛酸生产菌株工程菌E. coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE;
其中,所述D-泛酸生产菌株由载体pACYC184-panBCE转化至工程菌E. coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH获得;panBCE来自大肠杆菌E. coli MG1655;
其中,所述工程菌E. coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH通过将含有来源于戴尔福特菌Csl-4的aspDH基因的模板DNA电转化至E. coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M/pCas感受态细胞,经培养、消除pTargetFcadA质粒和pCas质粒获得,其中,所述aspDH基因序列如SEQ ID No.48所示;
所述E. coli MG1655 avtA:panDBl-ilvG+M/pCas感受态细胞通过将含有ilvG+M序列的组合体DonorilvGM的模板DNA电转化至E. coli MG1655 avtA:panDBl/pCas感受态细胞获得;其中,所述组合体DonorilvGM的序列如SEQ ID No.6所示;
所述E. coli MG1655 avtA:panDBl/pCas感受态细胞通过将含有panD基因序列和BCD2序列的模板DNA电转化至E. coli MG1655/pCas9感受态细胞获得;其中,所述所述panD基因序列SEQ ID No.1所示,所述BCD2序列如SEQ ID No.2所示;基因panD插入染色体avtA基因的编码序列导致avtA失活。
2.如权利要求1所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.02 g/L~2 g/L;和/或,控制所述甲基供体在所述发酵体系中的起始浓度为0.1 g/L~5 g/L。
3.如权利要求1所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.1 g/L~1 g/L;和/或,控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为1 g/L~3 g/L。
4.如权利要求1所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,所述发酵生产的底物为葡萄糖,所述葡萄糖在所述发酵体系中的起始浓度为15 g/L~30 g/L。
5.如权利要求4所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于5 g/L,向所述发酵体系投加葡萄糖。
6.如权利要求4所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于设定值时,向所述发酵体系投加葡萄糖至葡萄糖在所述发酵体系中的浓度为15 g/L~30 g/L。
7.如权利要求1所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,所述发酵体系中还包括其他组份,所述其他组份及所述其他组份在所述发酵体系中的起始浓度分别为:硫酸铵5g/L~20 g/L,磷酸二氢钾1 g/L~5 g/L,硫酸镁1.2 g/L~3.0 g/L,酵母提取物2 g/L~8.0 g/L,MOPS 60 g/L~100 g/L以及微量元素2 mL/L~8 mL/L,溶剂为去离子水。
8.如权利要求7所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,所述微量元素包括FeSO4·7H2O 8 g/L~15 g/L、CaCl2 1 g/L~2 g/L、ZnSO4·7H2O 2 g/L~3 g/L、MnSO4·4H2O0.1 g/L~1 g/L、CuSO4·5H2O 0.5 g/L~2 g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.05 g/L~0.2 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.1 g/L~0.5 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L~0.8 g/L、30%~40% HCl 8 mL/L~15 mL/L。
9.如权利要求1或8所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,所述发酵生产的条件为:温度为36℃~38℃,pH为6.8~7.0,转速为210rpm~250rpm。
10.如权利要求1至8中任一所述的发酵法制备D-泛酸的方法,其特征在于,所述制备D-泛酸的方法的具体步骤为:
(1)活化生产,将所述生产菌株接种到平板培养基活化生产菌株;
(2)种子生产,将步骤(1)得到的生产菌株接种至种子培养基进行种子生产,获得种子液;
(3)发酵生产,将步骤(2)得到的种子液接种至所述发酵体系进行发酵培养;发酵培养过程中,每隔3~5小时,用氨水调节发酵体系的pH,使发酵体系的pH为6.8~7.0;用生物传感分析仪检测发酵体系中葡萄糖的含量,当发酵体系中葡萄糖浓度低于5 g/L时,向发酵体系投加葡萄糖,控制发酵体系中葡萄糖的浓度为15 g/L~30 g/L;在发酵生产的过程中第18~26小时向发酵体系中加入甲基供体,同时添加甲基供体的载体;
和/或,步骤(3)中所述种子液接种量为所述发酵体系体积的2%~6%。
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