CN105238807A - 一种辅酶高效再生体系的构建及其应用 - Google Patents
一种辅酶高效再生体系的构建及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法。首先，按照大肠杆菌的密码子偏好对博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列进行密码子优化。对甲酸脱氢酶密码子优化后可以显著提高其在大肠杆菌中的表达量，增加α-氨基丁酸的产量，同时共表达甲酸脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶于大肠杆菌中可以促进辅因子在菌体胞内的循环，可以不需要添加任何外源辅因子，另外利用全细胞转化大宗化学品L-苏氨酸生产α-氨基丁酸过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中该方法所得的α-氨基丁酸产量可达81.5g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种按密码子优化的博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列合成方法，同时将其与氨基酸脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中的表达，利用重组大肠杆菌进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸的方法。
背景技术
非天然α-氨基酸是区别于能够由生物体自身合成的22种天然α-氨基酸的一大类氨基酸，它们具有重要的生物活性和生理作用，广泛用于多肽、手性药物以及生物碱等化合物的合成。α-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。α-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成，市场巨大。
α-氨基丁酸的合成方法主要包括化学合成法、酶拆分法及酶转化法三种。其中化学法包括脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原法等，化学合成虽然操作简单，但往往反应条件苛刻且易生成副产物，有时需要利用对环境有害的大量有机溶剂，如JefferyE.A.等利用电化学法制备得α-氨基丁酸，产率仅有48％，同时存在副产物谷氨酸。相比之下，微生物法制备α-氨基丁酸具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。并且随着基因工程技术的发展，构建重组微生物合成非天然氨基酸代谢途径已经可以完成。目前，α-氨基丁酸的微生物法制备主要通过细胞外酶转化法，包括对消旋α-氨基丁酸进行酶法拆分制备及以2-丁酮酸为原料通过脱氢酶或转氨酶来催化制备。
专利CN102212567A构建了以大宗化学品L-苏氨酸为廉价底物，通过L-苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶及辅酶再生系统的酶体系进行一步法制备α-氨基丁酸。以甲酸脱氢酶作为辅酶NADH循环的转化体系中，将底物甲酸或甲酸盐催化生成CO2，反应中不产生任何副产物，有利于α-氨基丁酸的分离提取，但甲酸脱氢酶存在酶活较低、价格昂贵等的问题，使得NADH的再生速率已成为限制α-氨基丁酸转化的主要因素。另外，以酶体系去进行α-氨基丁酸的生产需要对产酶的重组菌进行细胞破碎，同时在转化的过程中因辅因子的损耗需要不断地外源添加，进一步增加了α-氨基丁酸的生产成本。因此，有必要寻找一种高效但成本低廉的制备α-氨基丁酸的方法。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明在于按照大肠杆菌的密码子偏好对博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列(fdh，GenBankAccessionNo.AJ011046)进行密码子优化，并合成这段基因。将合成的甲酸脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a-fdh+Bcldh、pET-28a-fdh+Rjpdh及pET-duet-fdh+Bsadh、pET-duet-fdh+Scvdh，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-fdh+Bcldh/BL21、pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-fdh+Bsadh/BL21、pET-duet-fdh+Scvdh/BL21。同时将L-苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸进行转化高效制备α-氨基丁酸，为α-氨基丁酸的工业化生产提供了一种实际有效策略。
本发明的技术方案：
1.甲酸脱氢酶的密码子优化
将来源于博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列针对大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，然后进行基因合成。
2.甲酸脱氢酶引物设计
根据密码子优化后的fdh基因序列，设计甲酸脱氢酶基因的PCR引物P1和P2以及在pET-28a与L-氨基酸脱氢酶共表达的引物P3和P4。
P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATCGTTCTGGTTCTG-3’(BamHI)
P2：5’-CGCGTCGACTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(SalI)
P3：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(SphI)
P4：5’-GAAGATCTTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(BglII)
3.L-氨基酸脱氢酶及L-苏氨酸脱氨酶引物设计
根据不同来源的苏氨酸脱氨酶的基因序列设计引物。
PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamHI)
PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(HindIII)
PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamHI)
PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(HindIII)
根据不同来源的氨基酸脱氢酶的基因序列设计引物。
PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamHI)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(SacI)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamHI)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(SacI)
PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(KpnI)
PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(XhoI)
PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(NdeI)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(XhoI)
4.重组菌的构建
以染色体DNA或合成的密码子优化甲酸脱氢酶DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pET-Duet和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素或卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
之后以连上pET-28a的甲酸脱氢酶质粒为模板，根据预先设计好的带启动子的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上L-氨基酸脱氢酶的载体pET-28a-ldh和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
以pET-Duet为甲酸脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时。先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-氨基酸脱氢酶的基因PCR，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的甲酸脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coliBL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。
5.重组菌的培养
将构建好的工程菌接种于LB培养基中进行活化，次日转接于发酵培养基中，IPTG诱导表达，离心收集菌体。发酵培养基中具备微生物生长所需的营养成分，即碳源、氮源、无机盐、生长因子等。碳源包括葡萄糖、甘油、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等；氮源主要有玉米浆、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、其他含氮有机物尿素、氨基酸等以及含氮无机物氨水、硫酸铵和氯化铵等。以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外，培养基中还适量加入金属离子。
6.重组菌全细胞转化产α-氨基丁酸
将获得的菌体用pH7.5的50mMPB缓冲液洗涤两次，再加入pH6.0-8.0的50mMPB缓冲液重悬，然后于30-42℃不同温度下加入底物L-苏氨酸及甲酸或甲酸盐，以20％甲酸或者5M氨水控制pH在6.0-8.0之间，以HPLC检测底物α-氨基丁酸的产率。
本发明中，所用的L-氨基酸脱氨酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。所述L-苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。
本发明的有益效果：
α-氨基丁酸一种重要的化工原料和医药中间体，被广泛用于药物的合成如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成。本发明首次对α-氨基丁酸的酶体系转化限制因素甲酸脱氢酶基因进行了大肠杆菌密码子偏好的优化，并将其与L-氨基酸脱氢酶串联在质粒上于E.coliBL21中的表达，构建了共表达甲酸脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的工程菌株，同时结合构建单表达L-苏氨酸脱氢酶的重组E.coliBL21。利用这些重组菌对L-苏氨酸进行全细胞转化为α-氨基丁酸，转化过程中不需要添加任何辅因子，在提高转化效率的同时降低了成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。
实施例1：甲酸脱氢酶的密码子优化
将来源于博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列(fdh，GenBankAccessionNo.AJ011046)上传到http://www.jcat.de/针对大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，然后送至上海生工生物进行基因合成。优化后的基因fdh经DNAMAN与原序列比对后发现，序列同源性为80.37％。
实施例2：重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh的构建及转化
[1]以蜡样芽孢杆菌、红球菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶及红球菌的L-苯丙氨酸脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ldh基因引物。
PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamHI)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(SacI)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamHI)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(SacI)
[3]利用蜡样芽孢杆菌及红球菌的DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[6]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamHI和HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例3：重组质粒pET-28a-fdh+Bcldh/pET-28a-fdh+Rjpdh的构建及转化
[1]以合成的密码子优化甲酸脱氢酶DNA作为模板。
[2]根据合成的密码子优化甲酸脱氢酶基因序列以及pET-28a及pET-duet质粒上的酶切位点设计fdh基因引物。根据密码子优化后的fdh基因序列，设计甲酸脱氢酶基因的引物P1和P2以及在pET-28a与L-氨基酸脱氢酶共表达的引物P3和P4。
P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATCGTTCTGGTTCTG-3’(BamHI)
P2：5’-CGCGTCGACTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(SalI)
P3：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(SphI)
P4：5’-GAAGATCTTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(BglII)
[3]利用合成的甲酸脱氢酶DNA作为模板，以P1、P2为引物，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-fdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[6]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-fdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamHI和SalI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-fdh转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[6]利用[5]提出的质粒pET-28a-fdh作为模板，以P3、P4为引物，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min30s，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[7]构建重组质粒pMD18-T-promoter+fdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[6]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-pfdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[8]将[7]中提取的质粒和实施例2中已经连上L-氨基酸脱氢酶的表达载体pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh分别用SphI和BglII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-fdh+Bcldh/pET-28a-fdh+Rjpdh转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pET-duet-fdh+Bsadh/pET-duet-fdh+Scvdh的构建及转化
[1]以枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因序列、天蓝色链霉菌的缬氨酸脱氢酶基因序列以及pET-duet质粒上的酶切位点设计基因引物。
PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(KpnI)
PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(XhoI)
PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(NdeI)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(XhoI)
[3]利用枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[6]，转化产物涂布含氨苄霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将实施例[3]中提取的质粒pMD18-T-fdh和表达载体pET-duet分别用BamHI和SalI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-fdh转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
[6]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Bsadh和表达载体pET-duet-fdh分别用KpnI和XhoI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将[4]中提取的质粒pMD18-T-Scvdh和表达载体pET-duet-fdh分别用NdeI和XhoI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-fdh+Bsadh/pET-duet-fdh+Scvdh转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例5：重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd的构建及转化
[1]以大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的基因组DNA作为模板。
[2]根据大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的L-苏氨酸脱氨酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ltd基因引物。
PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamHI)
PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(HindIII)
PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamHI)
PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(HindIII)
[3]利用大肠杆菌及鼠伤寒沙门(氏)菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
[4]构建重组质粒pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，导入感受态E.coliJM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[6]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。
[5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamHI和HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd转化到感受态E.coliBL21，转化方法参照实施例[6]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。
实施例6：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10mlLB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD6000.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1MCaCl2400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1MCaCl280μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例7：重组菌的发酵培养基
[1]LB基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10。
[2]TB基(g/L)：甘油4，胰蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO412.5，KH2PO42.3，MgSO40.2，pH7.0-7.2。
[3]TY基(g/L)：葡萄糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl3，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH7.0-7.2。
[4]TYG基(g/L)：甘油10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH7.0-7.2。
[5]GP基(g/L)：葡萄糖30，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH7.0-7.2。
实施例8：串联甲酸脱氢酶及L-亮氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化产α-氨基丁酸
[1]将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-亮氨酸脱氢酶的pET-28a-fdh+Bcldh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100mlTB基、TY基、TYG基及GP基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。进行全细胞转化实验，取不同培养基中培养好的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mLpH7.0的50mMPB缓冲液洗涤二次，分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-fdh+Bcldh/BL21两种重组大肠杆菌共同重悬于100mL的50mMPB缓冲液中。向该体系中投入0.8ML-苏氨酸和0.8M甲酸铵及0.1％(v/v)tween-80，置30℃摇床中继续培养，培养过程中每隔0.5h加入20％甲酸或5M氨水以保持反应液pH为6.0-8.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2mlpH9.5的0.lM硼砂缓冲液及50μL2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL0.1MKH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoilC18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UVDetector，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
[2]最适培养基：经过HPLC测定，发现L-苏氨酸到α-氨基丁酸在TB基、TY基、TYG基及GP基发酵后的全细胞转化产率分别为88％，76％，79％，84％。因胰蛋白胨及酵母提取物的成本相比于葡萄糖来说较高，因此确定最佳的发酵培养基为GP培养基。
[3]全细胞转化最适条件：在GP培养基条件下，待终浓度为1mM的IPTG对重组菌在16℃摇床24h诱导表达后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mLpH7.0的50mMPB缓冲液洗涤二次，重悬于pH分别为6.0、7.0、8.0的等体积的50mMPB缓冲液中。向该体系中投入1ML-苏氨酸和0.1％(v/v)tween-80，分别置于30℃、37℃及42℃摇床中进行转化，转化过程中实时监测pH值，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH恒定。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。得到全细胞转化缓冲液pH为7.5、摇床温度为30℃的转化率最高，达到98％，α-氨基丁酸的产率为69.2g/L。
[4]发酵罐上全细胞转化：在GP培养基条件下，接种量8％，300r/min、1.0vvm通气量条件下培养2-3h，之后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH7.0的50mMPB缓冲液洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH7.0的50mMPB缓冲液中，向该体系中投入1ML-苏氨酸和0.1％(v/v)tween-80，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH恒定7.0。待转化18h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析，得到α-氨基丁酸的产率为81.5g/L。
实施例9：串联甲酸脱氢酶及L-苯丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化产α-氨基丁酸
将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-苯丙氨酸脱氢酶的pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的GP基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH7.0的50mMPB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH7.0的50mMPB缓冲液中，向该体系中投入1ML-苏氨酸和1％(v/v)甲苯，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH6.0。待转化18h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例8中的HPLC方法)，得到α-氨基丁酸的产率为36.2g/L。
实施例10：串联甲酸脱氢酶及L-丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化产α-氨基丁酸
将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-丙氨酸脱氢酶的pET-duet-fdh+Bsadh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的GP基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH7.0的50mMPB缓冲液分别将pET-28a-Seltd/BL21和pET-duet-fdh+Bsadh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH7.0的50mMPB缓冲液中，向该体系中投入1ML-苏氨酸和0.2％(v/v)曲拉通X100，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH8.0。待转化18h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例8中的HPLC方法)，得到α-氨基丁酸的产率为52.5g/L。
实施例11：串联甲酸脱氢酶及L-缬氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化产α-氨基丁酸
将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-缬氨酸脱氢酶的pET-duet-fdh+Scvdh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的GP基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH7.0的50mMPB缓冲液分别将pET-28a-Seltd/BL21和pET-duet-fdh+Scvdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH7.0的50mMPB缓冲液中，向该体系中投入1ML-苏氨酸和0.5％(v/v)CTAB，于30℃、300r/min进行转化，并以20％甲酸或者5M氨水调节使pH7.0。待转化18h后取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例8中的HPLC方法)，得到α-氨基丁酸的产率为45.1g/L。
Claims (6)
1.一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法，其特征包括以下内容：
1)将来源于博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列针对大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，然后进行基因合成。
2)将合成的甲酸脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a-fdh+Bcldh、pET-28a-fdh+Rjpdh及pET-duet-fdh+Bsadh、pET-duet-fdh+Scvdh，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-fdh+Bcldh/BL21、pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-fdh+Bsadh/BL21、pET-duet-fdh+Scvdh/BL21。同时将L-苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。
3)使用重组大肠杆菌在不同的发酵培养基进行诱导培养优化，用于α-氨基丁酸的全细胞转化，利用pH7.0的50mMPB缓冲液洗涤细胞然后将细胞重新悬浮于pH6.0-8.0的50mMPB缓冲液中，在不加入任何辅因子的情况下，加入0.8ML-苏氨酸、0.8M甲酸铵及0.1-1％的增加细胞通透性的表面活性剂，利用20％的甲酸及5M氨水调节使转化的pH保持在6.0-8.0之间，并控制转化的温度在30-42℃之间，制备得到α-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的甲酸脱氢酶密码子优化针对：但不限于，大肠杆菌表达系统。
3.根据权利要求1所述的一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氢酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。
5.根据权利要求1所述的一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的增加细胞通透性的表面活性剂为：但不限于，吐温80、甲苯、曲拉通X100、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
6.根据权利要求1所述的一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌
制备α-氨基丁酸的方法，其特征在于不向转化反应液中添加任何辅因子。
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