CN104152500A - 一种生物合成(r)-3-羟基戊二酸单酯的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成新方法。更具体的，本发明提供了一种利用卤醇脱卤酶与腈水解酶或双酶共表达重组菌催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，所述的(R)-3-羟基戊二酸单酯是氟伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀等他汀类药物的关键中间体。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。

Description

一种生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的新方法

技术领域

本发明属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，涉及一种由(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法；主要涉及一种(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物制备新方法。 

背景技术

瑞舒伐他汀（Rosuvastatin，商品名Crestor）是由阿斯利康公司开发的他汀类降血脂药，该药2002年11月首次在荷兰获批，2003年2月首次在加拿大上市，之后陆续在新西兰、英国以及美国上市。瑞舒伐他汀上市后，在药效和安全性方面均达到令人满意的结果，被称为“超级他汀”。瑞舒伐他汀的侧链含有两个手性中心，(R)-3-羟基戊二酸单酯是合成瑞舒伐他汀手性侧链的关键中间体。瑞舒伐他汀及其关键中间体(R)-3-羟基戊二酸单酯的结构如化学结构式 1所示（A. Liljeblad, A. Kallinen, L. T. Kanerva. Biocatalysis in the Preparation of the Statin Side Chain. Current Organic Synthesis, 2009, 6, 362 - 379）。 

化学结构式1 瑞舒伐他汀及其关键中间体的化学结构式。 

卤醇脱卤酶（Halohydrin dehalogenase, EC 4.5.1.X）也叫做卤醇环氧酶或卤代醇卤化氢裂解酶。它能够脱掉卤素形成相应的环氧化物，而且催化反应是不需要任何辅酶。卤醇脱卤酶在亲核试剂（CN^-、N₃ ^-、NO₂ ^-等）存在的条件下，能够继续催化环氧化物开环反应（You ZY, Liu ZQ, Zheng YG. Properties and biotechnological applications of halohydrin dehalogenases: current state and future perspectives. Applied microbiology and biotechnology, 2013, 97(1), 9-21）。 

腈水解酶（Nitrilase, EC 3.5.5.1）是一类重要的水解酶，它可以将腈基转化为相应的羧酸。来源于细菌、真菌、植物、动物的多种腈水解酶已被发现，并进行基因克隆构建工程菌进行研究（Singh R, Sharma R, Tewari N, Geetanjali, Rawat DS. Nitrilase and its application as a 'green' catalyst. Chemistry & Biodiversity, 2006, 3(12), 1279-87.）。 

卤醇脱卤酶和腈水解酶在生物催化领域均已得到广泛的应用，并且两种酶均已和其他酶串联进行生物催化反应。卤醇脱卤酶和醇脱氢酶以及辅因子循环的酶（葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶）已经在大肠杆菌中进行共表达，通过醇脱氢酶和卤醇脱卤酶的串联反应，从卤代酮类化合物制备手性β-羟基腈（Shao-Yun Chen, Chen-Xi Yang, Jian-Ping Wu, Gang Xu, and Li-Rong Yang. Multi-Enzymatic Biosynthesis of Chiral β-Hydroxy Nitriles through Co-Expression of Oxidoreductase and Halohydrin Dehalogenase. Advanced Synthesis & Catalysis, 2013, 355(16), 3179–3190）。腈水解酶和羟腈裂解酶已经在大肠杆菌中同时表达，通过(S)-羟腈裂解酶和非选择性的腈水解酶串联反应，从苯甲醛和氰化物制备(S)-扁桃酸或(S)-扁桃酰胺（Olga Sosedov, Kathrin Matzer, Sibylle Bürger, Christoph Kiziak, Stefanie Baum, Josef Altenbuchner, Andrzej Chmura, Fred van Rantwijk andAndreas Stolz. Construction of Recombinant Escherichia coli Catalysts which Simultaneously Express an (S)-Oxynitrilase and Different Nitrilase Variants for the Synthesis of (S)-Mandelic Acid and (S)-Mandelic Amide from Benzaldehyde and Cyanide. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009, 351(10), 1531–1538）。 

(R)-3-羟基戊二酸单酯作为瑞舒伐他汀、氟伐他汀及匹伐他汀等他汀类药物的关键中间体，其生物合成方法越来越引起人们的关注。目前文献报道的生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法主要有以下几种。 

1、利用脂肪酶选择性水解3-羟基戊二酸二乙酯 

南极假丝酵母脂肪酶B（CAL-B）能选择性水解3-羟基戊二酸二乙酯生成(R)-3-戊二酸乙酯（E. E. Jacobsen, B. H. Hoff, A. E. Moen, T. Anthonsen. Enantioselective enzymatic preparation of chiral glutaric monocarboxylic acids and amides. J. Mol. Cat. B Enzym., 2003, 21, 55 - 58.）。此外，Lim报道了酯酶CLS-BC-14011能高对映选择性的水解3-羟基戊二酸二乙酯生成(R)-3-羟基戊二酸乙酯（K.-M. Lim. Chiral Intermediate and Process for the Production Thereof. WO2003/087112, 2003.）（化学方程式1），底物浓度达到3.6 mol/L，产物ee值为99.5%，收率为99.7%。

化学方程式1 脂肪酶选择性水解。 

2、外消旋4-氰基-3-羟基丁酸酯的拆分 

利用含有R型对映选择性腈水解酶的红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株ZJB-0910转化外消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，得到(R)-3-羟基戊二酸乙酯（Dong HP, Liu ZQ, Zheng YG, Shen YC. Novel biosynthesis of (R)-ethyl-3-hydroxyglutarate with (R)-enantioselective hydrolysis of racemic ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyate by Rhodococcus erythropolis. Applied microbiology and biotechnology, 2010, 87(4), 1335-45）（化学方程式2）。在优化后的条件下（pH 7.5，30℃，20 mM底物浓度），得到(R)-3-羟基戊二酸乙酯的产率为46.2%（w/w），产物的ee值 >99%。

化学方程式2 外消旋4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的拆分。 

3、(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的双酶水解法 

利用含有腈水合酶和酰胺水解酶的红球菌（Rhodococcus boritolerans）菌株转化(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯（Yang MJ, Wang XJ, Yang ZY, An J, Xiang WS, Zhang J. Bioconversion of ethyl (R)-4-cyano-3-hydroxybutyate into (R)-ethyl-3-hydroxyglutarate via an indirect pathway by Rhodococcus boritolerans. Biotechnology letters ,2012,34(5), 901-905）（化学方程式3），从而得到(R)-3-羟基戊二酸乙酯。最大转化底物浓度为10 g/L，7 g/L全细胞（干重），pH 7.5，温度25℃，反应8小时，得到的(R)-3-羟基戊二酸乙酯产率98%（w/w）。

化学方程式3 (R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的双酶水解法。 

此外，我们课题组发现来源于拟南芥的腈水解酶NIT1 (NM_180680.2)、NIT2 (NM_114298.2)、NIT3（NM_114300.3）能将高浓度的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸单酯水解为(R)-3-羟基戊二酸单酯（朱敦明，吴洽庆，姚培圆，袁京，李键煚，冯进辉，马延和，(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成方法，申请号：201310512331.9，2013年10月25日）。 

我们发现目前生物催化合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的工艺中，尚没有利用生物催化剂由(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法；而且，尚没有利用卤醇脱卤酶和腈水解酶的串联反应进行生物催化的报道。本方法利用卤醇脱卤酶和腈水解酶进行串联反应或在基因工程菌中共表达卤醇脱卤酶和腈水解酶，由(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法制备他汀类药物关键中间体(R)-3-羟基戊二酸单酯。该过程具有反应条件温和、反应速度快、无污染和工艺路线简单等显著特点。 

发明内容

本发明首次提出将卤醇脱卤酶与腈水解酶应用于一个反应体系，实现一锅两步反应。进一步构建了一种共表达卤醇脱卤酶和腈水解酶的基因工程菌，以及利用该共表达重组菌制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法（如化学方程式4）。 

化学方程式4 合成路线。 

本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：将一个腈水解酶（GenBank: CAA68934.3）的基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上Nco I和Hind Ⅲ 酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后将表达载体转入受体菌，得到所述的产腈水解酶的基因工程菌NIT；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了腈水解酶的高效异源表达。 

本发明中所述的产卤醇脱卤酶的基因工程菌，具体的构建方法是：将一个卤醇脱卤酶（GenBank: GP571591.1）的基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后将表达载体转入受体菌，得到所述的产卤醇脱卤酶的基因工程菌Hhe；并对基因工程菌进行发酵培养，实现了卤醇脱卤酶的高效异源表达。 

本发明中所述的共表达卤醇脱卤酶和腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：将含有腈水解酶NIT的质粒和pETDute-1质粒同时用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ 进行双酶切，酶切产物胶回收，将回收的NIT基因片段和质粒pETDute-1用T4连接酶连接，连接产物转化到受体中，以载体所携带的氨苄抗性筛选阳性转化子，提取质粒pETDute-NIT进行酶切验证。将验证成功的质粒pETDute-NIT和含有卤醇脱卤酶Hhe的质粒同时用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物胶回收，将回收的Hhe基因片段和质粒pETDute-NIT用T4连接酶连接，连接产物转化到宿主菌中，以载体所携带的氨苄抗性筛选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证，将验证成功的载体pETDuet-NIT-Hhe转入表达型宿主菌中，以载体所携带的氨苄抗性筛选阳性转化子，将成功构建的的基因工程菌进行发酵培养，实现了卤醇脱卤酶和腈水解酶的同时异源表达。 

本发明中所述的卤醇脱卤酶重组菌、腈水解酶重组菌及双酶共表达重组菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。 

本发明中所述的卤醇脱卤酶重组菌、腈水解酶重组菌及双酶共表达重组菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。 

在本发明中，由构建的卤醇脱卤酶质粒、腈水解酶质粒以及双酶共表达质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的卤醇脱卤酶和腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的卤醇脱卤酶和腈水解酶即可。 

本发明还涉及利用卤醇脱卤酶重组菌与腈水解酶重组菌或双酶共表达重组菌转化(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，所述方法为。 

1）将所述产卤醇脱卤酶或腈水解酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，然后将卤醇脱卤酶与腈水解酶加入到pH值为7.0～8.0的缓冲液，分批加入底物至50～150 g/L， 25～30 ℃，利用pH在线调控系统，流加30%氰化钠或氰化钾，控制反应体系的pH维持在7.5～8.5，反应完全后经离心、酸化、萃取、脱溶后得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，收率大于80%。 

2）将所述卤醇脱卤酶加入到pH值为7.0～8.0的缓冲液，加入底物50～200 g/L， 25～30 ℃，利用pH在线调控系统，流加30%氰化钠或氰化钾，控制反应体系的pH维持在7.5～8.5，反应一定时间后加入腈水解酶，继续反应至中间体反应完全，反应液经离心、酸化、萃取、脱溶后得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，收率大于80%。 

3）将所述产卤醇脱卤酶和腈水解酶的共表达基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，加入pH值为7.0～8.0的缓冲液，分批加入底物至50～100 g/L， 25～30 ℃，利用pH在线调控系统，流加30%氰化钠或氰化钾，控制反应体系的pH维持在7.5～8.5，反应完全后经离心、酸化、萃取、脱溶后得到(R)-3-羟基戊二酸单酯，收率大于80%。 

反应中适用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可以是水中加入一种或几种磷酸盐或Tris硫酸盐。 

本发明所述的pH值优选卤醇脱卤酶和腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH值为7.0～9.0。反应温度优选卤醇脱卤酶和腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选20～40 ℃。 

本发明所述的催化剂是可以是全细胞、破菌液、粗酶及纯酶，底物浓度大于50 g/L时，优先选择批次投入底物。 

本发明所述的(R)-3-羟基戊二酸单酯包括(R)-3-羟基戊二酸甲酯、(R)-3-羟基戊二酸乙酯等。 

附图说明

图1卤醇脱卤酶和腈水解酶共表达质粒结构图。 

图2底物50 g/L单次投入转化图：(■)(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯 Yield/%；(△)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯Yield/%；(●)(R)-3-羟基戊二酸单酯Yield/%。 

图3底物100 g/L批次投入转化图（100min时加入第二批底物）：(■)(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯 Yield/%；(△)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯Yield/%；(●)(R)-3-羟基戊二酸单酯Yield/%。 

图 4卤醇脱卤酶与腈水解酶重组菌一步法生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯转化图（1 h时加入第二批底物，3 h时加入第三批底物）：(■)(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯 Yield/%；(△)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯Yield/%；(●)(R)-3-羟基戊二酸单酯Yield/%。 

图5卤醇脱卤酶与腈水解酶重组菌两步法生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯转化图（4 h时加入腈水解酶重组菌）： (■)(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯 Yield/%；(△)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯Yield/%；(●)(R)-3-羟基戊二酸单酯Yield/%。 

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。 

实施实例1卤醇脱卤酶和腈水解酶基因工程菌的获得

全基因合成由上海旭冠公司完成。

将数据库中的一个卤醇脱卤酶（GenBank: GP571591.1）和一个腈水解酶（GenBank: CAA68934.3）基因进行密码子优化，以期使目的基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达，序列见附表。卤醇脱卤酶基因两端加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，构建到pET-32a(+) 载体中，得到基因工程菌Hhe；腈水解酶基因两端加上Nco I和Hind Ⅲ 酶切位点，构建到pET-28a(+) 载体中，得到基因工程菌NIT。 

将制备得到的重组载体用常规方法转入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构建重组工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于20%的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

实施实例2 共表达卤醇脱卤酶和腈水解酶基因工程菌的获得

根据标准方法，将以上所述的卤醇脱卤酶和腈水解酶构建到同一个pETDuet-1载体中，卤醇脱卤酶和腈水解酶双酶共表达质粒结构图如图1所示。将得到的共表达载体用常规方法转入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构建共表达基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好，共表达基因工程菌以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

实施实例 3基因工程菌的培养和静息细胞的制备

挑取平板上单菌落接种至5 ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15 h左右作为种子液，按照1%的接种量接种至含600 ml的发酵培养基中，在37℃，200 rpm的摇床上培养至OD₆₀₀=0.6～0.8左右，加入终浓度为0.1mM 的IPTG于25℃进行诱导10 h以上，以8000 rpm离心培养液收集菌体。

实施实例 4共表达重组菌静息细胞合成(R)-3-羟基戊二酸单酯-单次投入底物

取3.0 g 共表达基因工程菌的静息细胞（湿重）重悬于50 ml磷酸钠缓冲液（50 mM, pH 8.0），加入(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯（2.5 g，15 mmol)，然后利用pH在线调控系统，向反应体系流加30%氰化钠，控制反应体系的pH维持在pH 8.0左右，反应温度控制在25~30℃。反应4小时后，气相色谱检测显示反应完全（Agilent GC 7890A, HP-5），结果如图2所示，离心回收静息细胞，收集上层清液，适量30%过氧化氢处理10 min，然后6 M盐酸酸化至pH 1，分别用50 ml乙酸乙酯萃取3~4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸单酯2.32 g，收率87.8%。

实施实例 5共表达重组菌静息细胞合成(R)-3-羟基戊二酸单酯-批次投入底物

取5.0 g 上述静息细胞（湿重）重悬于50 ml磷酸钠缓冲液（50 mM, pH 8.0），先投入底物（S）-4-氯-3-羟基丁酸酯（2.5 g，15 mmol），然后利用pH在线调控系统，向反应体系流加30%氰化钠，控制反应体系的pH维持在pH 8.0左右，反应温度控制在25~30℃。反应2小时后，气相色谱检测显示反应完全（Agilent GC 7890A, HP-5）；此时，再向反应体系中投入底物（S）-4-氯-3-羟基丁酸酯（2.5 g，15 mmol）继续反应，反应条件与之前相同。继续反应4小时后，气相色谱检测显示反应完全。结果如图3所示，离心去除细胞，收集上层清液，适量30%过氧化氢处理10 min，然后6 M盐酸酸化至pH 1，分别用50 ml乙酸乙酯萃取3~4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸单酯（4.37 g，82.7%）。

实施实例6卤醇脱卤酶与腈水解酶重组菌静息细胞一步法合成(R)-3-羟基戊二酸单酯

分别取2.5 g 卤醇脱卤酶和1.5 g腈水解酶重组菌静息细胞（湿重）重悬于25 ml磷酸钠缓冲液（50 mM, pH 8.0），先投入底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯（1.25 g，7.5 mmol），然后利用pH在线调控系统，向反应体系流加30%氰化钠，控制反应体系的pH维持在pH 8.0左右，反应温度控制在25~30℃。反应1小时后，气相色谱检测显示反应完全（Agilent GC 7890A, HP-5）；此时，再向反应体系中投入底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯（1.25 g，7.5 mmol）继续反应2小时，气相色谱检测显示反应完全；此时，向反应体系中最后投入底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯（1.25 g，7.5 mmol）继续反应，反应条件均相同，3小时后，气相色谱检测显示反应完全。结果如图4所示，离心去除细胞，收集上层清液，适量30%过氧化氢处理10 min，然后6 M盐酸酸化至pH 1.0，分别用25 ml乙酸乙酯萃取3~4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸单酯（3.34 g，84.3%）。

实施实例7卤醇脱卤酶与腈水解酶重组菌静息细胞两步一锅法合成(R)-3-羟基戊二酸单酯

取2.5 g 卤醇脱卤酶重组菌静息细胞（湿重）重悬于25 ml的Tris硫酸盐缓冲液（50 mM, pH 9.0），投入底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯（5.0 g，30 mmol），然后利用pH在线调控系统，向反应体系流加30%氰化钠，控制反应体系的pH维持在pH 9.0左右，反应温度控制在25~30℃。反应4小时后，气相色谱检测显示反应完全（Agilent GC 7890A, HP-5）；此时，用6 M盐酸调节反应体系的pH为8.0，再向反应体系中投入1.5 g腈水解酶重组菌静息细胞（湿重），继续反应4小时后，气相色谱检测显示反应完全。结果如图5所示，离心去除细胞，收集上层清液，适量30%过氧化氢处理10 min，然后6 M盐酸酸化至pH 1.0，分别用25 ml乙酸乙酯萃取3~4次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(R)-3-羟基戊二酸单酯（4.58 g，86.7%）。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中科院天津工业生物技术研究所

 

<120>  一种生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的新方法

 

<130>  Vorwerk S, Biernacki S, Piotrowski M. (2001). Planta 212: 508-516

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  765

<212>  DNA

<213>  Hhe

 

<400>  1

atgtctaccg ctatcgttac caacgttaaa cacttcggtg gtatgggttc tgctctgcgt       60

 

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<210>  2

<211>  1020

<212>  DNA

<213>  NIT

 

<400>  2

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tgggagaacc gtatgccgct gtaccgtacc gctctgtatg ctaaaggtat cgaactgtac      600

 

tgtgctccga ccgcagatgg ttctaaagaa tggcagtctt ctatgctgca cattgctatt      660

 

gaaggtggtt gttttgttct gtctgcttgt cagttctgtc tgcgtaaaga cttcccggac      720

 

cacccggact atctgtttac tgactggtac gacgacaaag aaccggactc tatcgtttct      780

 

cagggtggtt ctgttatcat ctctccgctg ggtcaggttc tggctggtcc gaacttcgaa      840

 

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ccgaaaaaac cggttacttt catttctaaa gttgaaaaag ctgaagacga ctctaacaaa     1020

 

 

Claims (10)

1.一种生物合成(R)-3-羟基戊二酸单酯的新方法，其特征在于利用卤醇脱卤酶和腈水解  酶或它们共表达重组菌催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸单酯一锅法制备(R)-3-羟基戊二酸单酯，包括如下步骤：

a）卤醇脱卤酶重组菌、腈水解酶重组菌及双酶共表达重组菌的构建；

b）将卤醇脱卤酶重组菌、腈水解酶重组菌或双酶共表达重组菌分别在发酵培养基中扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；

c）将收集的卤醇脱卤酶与腈水解酶或双酶共表达重组菌悬浮在缓冲液中，加入一定量的(S)-4-氯-3-羟基丁酸单酯，并添加适量的氰化钠或氰化钾，在适当条件下反应一定时间，底物经过中间产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸单酯，最终转化为(R)-3-羟基戊二酸单酯； 

d）反应中止后从反应体系中收集上层清液，先用过氧化氢处理，再用盐酸酸化，并用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。

2.如权利要求1所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸单酯可以是其甲酯、乙酯等。

3.如权利要求1所述的a）步骤产卤醇脱卤酶和腈水解酶的共表达基因工程菌，其特征在于同时将一个卤醇脱卤酶和一个腈水解酶构建到同一个载体上，并转化到宿主菌进行诱导表达。

4.如权利要求1所述的a）步骤产卤醇脱卤酶或腈水解酶的基因工程菌，其特征在于将卤醇脱卤酶或腈水解酶构建到一个载体上，并转化到宿主菌进行诱导表达。

5.如权利要求1所述的b）步骤产卤醇脱卤酶和腈水解酶的共表达基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一：pET系列质粒、pETduet系列pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。

6.如权利要求1所述的b）步骤产卤醇脱卤酶或腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一：pET系列质粒、pETduet系列pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。

7.如权利要求1所述的方法中c）步骤中，其中所述酶可以是完整的微生物细胞、细胞破碎液、粗酶或纯酶。

8.如权利要求1所述的转化方法c）步骤，其特征在于所述卤醇脱卤酶与腈水解酶的添加顺序可以一起加入；也可以先加卤醇脱卤酶，等反应一定程度再加入腈水解酶；或者先加入卤醇脱卤酶，反应完全后离心清液加入腈水解酶。

9.如权利要求1所述的转化方法c）步骤，其特征在于所述的反应条件：温度为20～40℃，优选25～30℃；所用的缓冲液为磷酸盐、Tris硫酸盐；所用的缓冲液的pH为7.0～9.0，优选pH为8.0；反应时间为1～8小时，优选1～4小时。

10.如权利要求1所述的转化方法c）步骤，其特征在于所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯的浓度为50～200 g/L；其中，双酶共表达重组菌优选50 g/L的底物一次性单次投入反应体系，而100 g/L的底物分成两份批次投入到反应体系；先加卤醇脱卤酶，后加腈水解酶的双酶催化优选分批添加底物至200 g/L；同时加入卤醇脱卤酶与腈水解酶的双酶催化优选分批添加底物至150 g/L。