CN112852769B - 制备(s)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法 - Google Patents

制备(s)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了羰基还原酶，能够高浓度转化1‑(2‑甲氧基‑3‑溴苯基)乙酮的能力，并且具有高的立体选择性。本发明提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。

Description

制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法
技术领域
本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及羰基还原酶在催化抗血小板减少症新药Lusutrombopag中间体制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法中的应用。
背景技术
抗血小板减少症新药Lusutrombopag是一款口服的、小分子的人血小板生成素受体激动剂，诱发内源性血小板生成，已被批准在美国、欧盟和日本上市，作为常规药物在临床使用。Lusutrombopag能与巨核细胞表面的TPO受体相结合，诱导这些细胞的增殖、分化、与成熟，从而上调血小板的产生。这款创新疗法已于2015年9月获得日本厚生劳动省的批准，在选择进行侵入性手术的慢性肝脏疾病患者中，改善他们的血小板减少症病情。
中国约有1360万慢性肝病成人患者，其中多数患者会接受选择性侵入性治疗。另一方面，由于患者在更高水平医疗护理中对于输血需求的不断增加，加之无偿献血的比例要低于欧洲、美国和日本，因此国内长期面临血液库存短缺的问题。另外，众所周知，采集的血液有较高的传播感染性疾病风险。在现在中国血液供应的大环境下，Lusutrombopag在中国的上市，与输血小板相比，无疑是一种更优的选择。
Figure BDA0002633189190000011
药物Lusutrombopag结构中存在手性结构可以通过手性醇引入，其关键手性中间体可以通过1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原实现。目前已报道的能够实现1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原使用反应试剂为硼烷四氢呋喃或者硼烷二甲硫醚，催化剂为(R)-2-甲基-CBS-恶唑硼烷或者(S)-2-甲基-CBS-恶唑硼烷，反应所使用溶剂为四氢呋喃或者甲苯。有机试剂以及硼烷试剂的使用，对环境的压力较大。羰基还原酶能够在反应溶剂为水溶液，常温常压下实现羰基的还原，因此使用羰基还原酶还原底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原是非常有吸引力的。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种羰基还原酶及其在催化合成(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇化合物中的应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种羰基还原酶，其氨基酸序列与为SEQ ID NO：1具有至少90％同一性，且所述的羰基还原酶具有转化1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮生成(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的能力。优选地，所述羰基还原酶来源于Novosphingobium。
第二方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达了第一方面所述的羰基还原酶，还表达了能够催化NAD+合成NADH的葡萄糖脱氢酶(GDH)或者甲酸脱氢酶(FDH)。
第三方面，本方面提供了一种制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法，将本发明第二方面所述的重组细胞与反应底物接触，进行催化反应，从而获得(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇。
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
(i)反应体系的pH为5.0-9.0，较佳地，5.0-8.0，更佳地，7.0；
(ii)反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇，更佳地，N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇。
(iii)所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，25-32℃。
(iiii)反应时间为1-24小时，较佳地，5-12小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(i)本发明提供了羰基还原酶，能够高浓度转化1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的能力，并且具有高的立体选择性。
(ii)本发明提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。
附图说明
图1所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮标样的HPLC图；
图2所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇消旋体HPLC图；
图3所示的是(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的HPLC图；
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1：羰基还原酶(CBR)重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将SEQ ID No.1的序列全合成后，连接在pET21a载体上，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET-21a-CBR。
实施例2：羰基还原酶CBR与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达重组细胞的构建
以实施例1中已构建好的羰基还原酶基因以及实验室已有的葡萄糖脱氢酶SEQ IDNo.3基因为模板，利用PCR手段扩增这些突变体基因和GDH基因，纯化后分别连接到共表达载体pRSFDuet的两个阅读框，验证成功后转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，即获得CBR与GDH共表达的重组细胞。
实施例3：羰基还原酶CBR与甲酸脱氢酶(FDH)共表达重组细胞的构建
以实施例1中已构建好的羰基还原酶CBR基因以及实验室已有的甲酸脱氢酶基因为模板，利用PCR手段扩增这些突变体基因和FDH SEQ ID No.2基因，纯化后分别连接到共表达载体pRSFDuet的两个阅读框，验证成功后转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，即获得CBR与FDH共表达的重组细胞。
实施例4：羰基还原酶CBR与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达重组细胞制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇
配置种子液50mL，培养基为LB培养基，用接种环挑取构建好的pRSFDuet-CBR-GDH的基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导10～16h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/l，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v甲醇)至终浓度为15g/L，葡萄糖45g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，8h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。图2所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇消旋体HPLC图；图3所示的是(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的HPLC图；
(2)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v乙醇)至终浓度为30g/L，葡萄糖80g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，10h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/l，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％DMF)至终浓度为50g/L，葡萄糖120g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，18h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v DMSO)至终浓度为100g/L，葡萄糖240g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
实施例5：羰基还原酶CBR与甲酸脱氢酶(FDH)共表达重组细胞制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇
配置种子液50mL，培养基为LB培养基，用接种环挑取构建好的pRSFDuet-CBR-FDH的基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导10～16h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/l，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v甲醇)至终浓度为15g/L，甲酸钠15g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，8h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
(2)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v乙醇)至终浓度为30g/L，甲酸钠30g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，10h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
(3)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/l，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％DMF)至终浓度为50g/L，甲酸钠50g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，18h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
(4)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v DMSO)至终浓度为150g/L，甲酸钠150g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，24h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法
<130> 氨基酸序列
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 259
<212> PRT
<213> Novosphingobium
<400> 1
Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Ala Ala Asn Ala
20 25 30
Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp Val Glu Gly Ala
35 40 45
Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala Gly Trp Lys Ala
50 55 60
Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val Asp Ala Leu Val
65 70 75 80
His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu Asp Thr Pro Leu
85 90 95
Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp Ser Ile Ile Ile
100 105 110
Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly Gly Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys Ala Ala Val Lys
145 150 155 160
Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala Leu Gly Tyr Asn
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp Thr Pro Met Leu
180 185 190
Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala Ala Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro Ile Gly Arg Met
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr Leu Cys Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met Asp Gly Gly Phe
245 250 255
Ser Gln Val
<210> 2
<211> 401
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. 101
<400> 2
Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro
20 25 30
Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly
35 40 45
Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser
85 90 95
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala
100 105 110
Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val
115 120 125
Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu
145 150 155 160
Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly
165 170 175
Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala
180 185 190
Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu
195 200 205
Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His
210 215 220
Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala
225 230 235 240
Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys
245 250 255
Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys
260 265 270
Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu
275 280 285
Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala
290 295 300
Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His
305 310 315 320
Pro Trp Arg Thr Met Pro Tyr Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile
340 345 350
Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile
355 360 365
Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys
370 375 380
Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala
385 390 395 400
Val
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 3
Met Gly Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln
20 25 30
Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu
35 40 45
Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln
50 55 60
Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala
65 70 75 80
Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu
85 90 95
Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys
100 105 110
Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala
115 120 125
Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met
130 135 140
Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala
145 150 155 160
Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu
165 170 175
Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile
180 185 190
Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala
195 200 205
Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu
210 215 220
Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser
245 250 255
Phe Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (1)

1.一种制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法，其特征在于，将重组细胞与反应底物1-(2-甲氧基-3-溴)苯基乙酮接触，进行催化反应，从而获得所述S-构型醇；
其中重组细胞表达了羰基还原酶，还表达了能够催化NAD+合成NADH的甲酸脱氢酶FDH；
或者所述重组细胞表达了羰基还原酶，还表达了能够催化NAD+合成NADH的葡萄糖脱氢酶GDH；
其中，所述的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No .1所示；所述的甲酸脱氢酶FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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