CN105274160B

CN105274160B - 一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法

Info

Publication number: CN105274160B
Application number: CN201510772612.7A
Authority: CN
Inventors: 严明; 章志林; 魏淼; 陈晶晶
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2035-11-11
Also published as: CN105274160A

Abstract

本发明公开了一种酶法不对称还原制备(S)‑N‑boc‑3‑羟基哌啶的方法，以氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N‑boc‑3‑哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)‑N‑boc‑3‑羟基哌啶。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶应用于不对称还原制备(S)‑N‑boc‑3‑羟基哌啶中，其对底物的转化率高达99.34%，产物的对映体过量值为100%。反应体系简单、底物浓度高、高底物浓度的催化反应无需分批投料，具有重要的工业应用价值。

Description

一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法。

背景技术

哌啶酮及其衍生物是非常重要的哌啶同系物，利用哌啶酮结构中的羰基的活性可以引发许多有机反应。其衍生物已经被发现具有抗菌、抗肿瘤、治疗老年痴呆症和麻醉等多种药理活性，同时也是治疗病毒感染(包括AIDI)及糖尿病的重要药物之一(Shen,W.,etal.,Synthesis of(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine.Chinese Journal ofPharmaceuticals,2013.44(5):p.436-438.)。

以(S)-N-boc-3-羟基哌啶为例，(S)-N-boc-3-羟基哌啶可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林(Carpino,P.A.,et al.,Pyrazolinone-piperidinedipeptide growth hormone secretagogues(GHSs):Discovery ofcapromorelin.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2003.11(4):p.581-590.)、BTK抑制剂ibrutinib(Advani,R.H.,et al.,Bruton Tyrosine Kinase Inhibitor Ibrutinib(PCI-32765)Has Significant Activity in Patients With Relapsed/Refractory B-CellMalignancies.Journal Of Clinical Oncology,2013.31(1):p.88-94.)、天然物质异白刺啉淋胺(isonitramine)和小果白刺碱(sibirine)等药物前体(Snider,B.B.andC.P.Cartayamarin,TOTAL SYNTHESIS OF(+/-)-NITRAMINE-DEVELOPMENT OF A KETENEEQUIVALENT IN THE ENE REACTION.Journal Of Organic Chemistry,1984.49(10):p.1688-1691.)，因此该化合物具有广泛的应用前景。

迄今为止，关于(S)-N-boc-3-羟基哌啶的合成已进行了很多的研究报道。主要分为化学转化法和生物催化法。化学转化的方式因其催化剂价格昂贵、反应条件苛刻、收率低、合成步骤繁琐，并且产生的三废较多，没有能够实现工业化应用(Reddy,A.S.,M.Narender,and K.R.Rao,A new asymmetric synthetic route to substitutedpiperidines.Tetrahedron,2007.63(2):p.331-336.)。生物催化法不对称还原N-boc-3-哌啶酮制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的技术有一定进展。Lacheretz等(Lacheretz,R.,D.G.Pardo,and J.Cossy,Daucus carota Mediated-Reduction of Cyclic 3-Oxo-amines.Organic Letters,2009.11(6):p.1245-1248.)利用胡萝卜组织细胞还原N-boc-3-哌啶酮制备出95％光学纯的(S)-N-boc-3-羟基哌啶。该反应由于催化剂来源不稳定底物浓度低(3mM)、催化剂使用量大(23％,m/v)、收率低(73％)且光学纯度较低(95％ee)，不具有工业应用价值。Xin Ju等(Ju,X.,et al.,Development of a Biocatalytic Process toPrepare(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine.Organic Process Research&Development,2014.18(6):p.827-830.)筛选到了一条依赖于NADH的酮还原酶，在大肠杆菌表达，并添加适量的辅酶NAD、辅底物异丙醇及适量助溶剂IPA后，利用底物耦合的辅酶循环系统，分批添加总量为5g的底物，在50ml的水相反应体系中经过24h反应，摩尔转化率达到99.8％，(S)-N-boc-3-羟基哌啶收率和化学纯度分别为97.6％和93％。虽然该方法产物光学纯度不高，但是可以确定利用先进的重组酶技术能够开发出具备工业化参数标准的(S)-N-boc-3-羟基哌啶生物催化制备工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，首次将NCBI上的收录号为AGG35486.1的醇脱氢酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶，转化率高，产物光学活性高，大大降低了生产成本。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，以氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶。

反应体系中，N-boc-3-哌啶酮的浓度为15～220g/L，醇脱氢酶活性为5.6U/(mgprotein)，用量为60U～6000U。

反应条件为pH6.0～7.5、20～35℃、180～280rpm条件下反应1～12h。优选反应条件为pH7.0、30℃、200rpm条件下反应6h。

所述NADH辅酶体系为NAD⁺的浓度为0.05～0.5mmol/L，异丙醇13.5～198g/L。

所述NADH辅酶体系为NAD⁺、甲酸钠和甲酸脱氢酶混合体系。

所述NADH辅酶体系为NAD⁺、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶混合体系。

所述的醇脱氢酶是通过表达含有基因序列如SEQ ID NO：1所示的重组菌得到的。

本发明中涉及到的还原酶是醇脱氢酶，其包含336个氨基酸，其在NCBI上的收录号为：AGG35486.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该蛋白的基因含有1011bp碱基，其在NCBI中的收录号为KC236900.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现该酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶醇的报道。

本发明中所用催化剂为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶，可以以任意形式参与反应，比如，将基因导入到受体菌中表达得到醇脱氢酶参与反应，或者直接将发酵后的菌泥参与反应。

将基因序列如SEQ ID NO：1所示的醇脱氢酶诱导表达后，与15～220g/L的N-boc-3-哌啶酮、13.5～198g/L的异丙醇和0.05～0.5mmol/L的NAD⁺，在pH6.0～7.5、20～35℃、180～280rpm条件下反应1～12小时，得到(S)-N-boc-3-羟基哌啶。其中，加入的NAD⁺与异丙醇在醇脱氢酶作用下生成NADH，使反应循环进行，降低了加入量以减少生产成本。

发明人发现来源于白色念珠菌Candida albicans的醇脱氢酶在水相中能够高效催化N-boc-3-哌啶酮为(S)-N-boc-3-羟基哌啶，e.e值为100％。同时，通过在水相和水/有机相中反应中反应条件的优化，提高了转化效果，发现了该条基因催化N-boc-3-哌啶酮为高立体选择性的(S)-N-boc-3-羟基哌啶的新功能。催化体系中引入辅酶循环体系帮助辅酶再生，降低了辅因子的加入量以减少生产成本。

有益效果：本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶应用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶中，取得很好的效果，其对底物N-boc-3-哌啶酮的转化率高(99.34％)，产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶的光学活性高(e.e为100％)，且产量高，大大降低了生产成本。

本发明的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶方法与其他制备方法相比还有如下优点：

1、反应体系简单、反应时间短，产物得率和对映体过量值高；

2、本发明中的生物催化剂底物耐受性好，无需分批投料可实现高底物浓度下的催化反应；

3、催化体系中引入辅酶循环体系帮助辅酶再生，降低了辅因子的加入量以减少生产成本。

附图说明

图1为本发明的一种合成路线；

图2为实施例2中，反应1h取样所得样品的GC图谱；

图3为实施例2中，反应6h取样所得样品的GC图谱。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

本发明中重组大肠杆菌E.coli Rosetta(pET-22b-CA)为含有醇脱氢酶基因(SEQID No.2)的基因工程菌，构建方法参见文献201310132479.X。

实施例1：重组大肠杆菌E.coli Rosetta(pET-22b-CA)的发酵及酶活测定

将含有醇脱氢酶基因(SEQ ID No.2)重组大肠杆菌E.coli Rosetta(pET-22b-CA)(构建方法参见专利文献201310132479.X)的甘油菌接种到含氨苄青霉素及氯霉素抗性的LB固体培养基中，37℃活化培养后接种到5ml含氨苄青霉素及氯霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接100mL含氨苄青霉素及氯霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，于30℃、200rpm诱导表达10h后。4℃离心10min收集细胞，并用磷酸缓冲液(100mM，pH＝7.0)洗涤菌体两遍，离心，弃上清，沉淀备用。

菌泥用100mM,pH＝7.0磷酸盐缓冲重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声3s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，15min)，测定上清中的酶活。

酶反应体系包括100mM，pH＝7.0的磷酸盐缓冲，5mM NADH，20mM N-boc-哌啶酮，30℃，340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化1μmol NADH所需要的酶量为一个酶活性单位U。蛋白含量采用Brandford法进行测定。

结果显示，重组菌E.coli Rosetta(pET-22b-CA)的比酶活为5.6U/mg protein。

实施例2水相不对称合成(S)-N-boc-3-羟基哌啶

称取0.5g(湿重)实施例1的大肠杆菌菌泥，悬浮于25mL的反应液中(100mM，pH＝7.0的磷酸缓冲液)。加入N-Boc-3-哌啶酮20g/L、异丙醇18g/L、0.1mmol/L的NAD⁺及0.15％的Triton 100(购自上海生工)，在30℃下200rpm反应1h和6h后取样进行GC手性柱分析，图谱分别见图2(反应1小时样品，保留时间27.3min分钟为S型产物，26.4min分钟为底物)和图3(反应6小时样品，27.3min分钟为S型产物)，产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶得产量为19.87g/L，产物的得率为99.34％，光学纯度e.e％为100％。

产物的检测方法如下(以下实施例中产物得检测方法和实施例2相同)：

对于水相反应：反应结束后，加入等体积乙酸丁酯，剧烈振荡10min然后放置两小时，8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸丁酯过有机膜，保存测样。

对于水/有机相两相反应：反应结束后8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸丁酯过有机膜，保存测样。

测定N-Boc-3-哌啶酮和N-boc-哌啶醇浓度以及产物的旋光性都使用气相7820A(Agilent)，色谱柱为HYDRODEXβ-TBDAC毛细管柱(25m×0.25mm；anpel，手性柱)。程序为：检测器FID，温度220℃，汽化室温度220℃，柱温130℃保持20min再10℃/min升至150℃保持8min，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气0.1MPa，尾吹0.08MPa。

产物N-boc哌啶醇的对映体过量值(e.e.％)由下式计算：

对映体过量值

式中S为(S)-N-boc哌啶醇的浓度，R为(R)-N-boc哌啶醇的浓度。

其中底物N-Boc-3-哌啶酮的保留时间为26.4min，(S)-N-boc哌啶醇的保留时间为27.3min，(R)-N-boc哌啶醇的保留时间为27.7min.

实施例3水/有机相双相不对称合成(S)-N-boc-3-羟基哌啶

称取1g(湿重)实施例1的大肠杆菌菌泥，悬浮于25ml的反应液中(100mM，pH＝7.0的磷酸缓冲液与醋酸丁酯体积比为1:1)。加入N-Boc-3-哌啶酮50g/L、异丙醇45g/L、0.1mmol/L的NAD⁺及0.15％的Triton 100，在30℃下200rpm反应6h。产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶得产量为48.4g/L，产物的得率为96.8％，光学纯度e.e％为100％。

实施例4高底物浓度下不对称合成(S)-N-boc-3-羟基哌啶

称取1g(湿重)实施例1的大肠杆菌菌泥，悬浮于25ml的反应液中(100mM，pH＝7.0的磷酸缓冲液)。一次投料至N-Boc-3-哌啶酮100g/L、异丙醇90g/L、0.1mmol/L的NAD⁺及0.15％的Triton 100，在30℃下200rpm反应6h。产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶得产量为97g/L，产物的得率为97.0％，光学纯度e.e％为100％。

实施例5利用双酶偶联辅酶循环系统不对称合成(S)-N-boc-3-羟基哌啶

称取1g(湿重)实施例1的大肠杆菌菌泥，悬浮于15ml的pH＝7.0的磷酸缓冲中。加入葡萄糖300mmol/L，N-Boc-3-哌啶酮40g/L，葡萄糖脱氢酶200U，NAD⁺0.1mmol/L，在30℃下200rpm反应6h。产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶得产量为39.3g/L，产物的得率为98.25％，光学纯度e.e％为100％。

实施例6双酶偶联辅酶循环系统水相不对称合成(S)-N-boc-3-羟基哌啶

称取1g(湿重)实施例1的大肠杆菌菌泥，悬浮于15ml的pH＝7.0的磷酸缓冲中。加入甲酸钠400mmol/L，N-Boc-3-哌啶酮40g/L，甲酸脱氢酶200U，NAD⁺0.1mmol/L，在30℃下200rpm反应6h。产物(S)-N-boc-3-羟基哌啶得产量为38.2g/L，产物的得率为95.5％，光学纯度e.e％为100％。

<110> 南京工业大学

<120> 一种基因重组菌在不对称还原酮基化合物中的应用

<130> 6

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> Candida albicans

<400> 1

atgtcaattc catctactca gtacggattt ttttataata aagctagtgg tcttaacttg 60

aaaaaagact tgccggttaa caagccaggt gctggtcaat tgcttttaaa ggttgatgca 120

gttggccttt gtcattcaga tttacatgtt ctctatgaag gtttggattg tggtgataat 180

tatgtgatgg gccacgaaat tgctgggact gttgctgaac taggtgaaga ggtgagtgag 240

tttgcagttg gagatcgtgt cgcttgtgtc ggccccaatg gatgtggtct ttgtaaacac 300

tgtcttactg gtaacgataa tgtttgtacc aagtcgtttt tggattggtt tggattgggt 360

tacaatggag gttacgagca attcttgtta gtcaagagac caagaaactt ggtcaagatc 420

cctgacaatg ttacttccga ggaagctgca gctattacgg atgccgtatt gactccttac 480

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ggattaggag gtaacgctat tcaagttgca aaagcatttg gtgcgaaggt tactgttttg 600

gataaaaagg ataaggcaag agaccaagct aaggcctttg gagctgacca ggtttacagt 660

gaattaccag acagcgtttt acctgggtca ttcagtgctt gttttgattt tgtttcggtt 720

caggcaacat acgatttgtg tcaaaagtat tgtgagccaa agggtactat tgttcccgta 780

ggtctaggtg caacttcgct taacataaat cttgctgatt tagatcttcg tgaaattacc 840

gtcaagggct cattctgggg taccctgatg gacttaagag aagcatttga attggctgca 900

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gagaagttga gagccggtgg ttatgaagga agagtcgtgt ttaatccata a 1011

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 2

Met Ser Ile Pro Ser Thr Gln Tyr Gly Phe Phe Tyr Asn Lys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Leu Asn Leu Lys Lys Asp Leu Pro Val Asn Lys Pro Gly Ala Gly

20 25 30

Gln Leu Leu Leu Lys Val Asp Ala Val Gly Leu Cys His Ser Asp Leu

35 40 45

His Val Leu Tyr Glu Gly Leu Asp Cys Gly Asp Asn Tyr Val Met Gly

50 55 60

His Glu Ile Ala Gly Thr Val Ala Glu Leu Gly Glu Glu Val Ser Glu

65 70 75 80

Phe Ala Val Gly Asp Arg Val Ala Cys Val Gly Pro Asn Gly Cys Gly

85 90 95

Leu Cys Lys His Cys Leu Thr Gly Asn Asp Asn Val Cys Thr Lys Ser

100 105 110

Phe Leu Asp Trp Phe Gly Leu Gly Tyr Asn Gly Gly Tyr Glu Gln Phe

115 120 125

Leu Leu Val Lys Arg Pro Arg Asn Leu Val Lys Ile Pro Asp Asn Val

130 135 140

Thr Ser Glu Glu Ala Ala Ala Ile Thr Asp Ala Val Leu Thr Pro Tyr

145 150 155 160

His Ala Ile Lys Ser Ala Gly Val Gly Pro Ala Ser Asn Ile Leu Ile

165 170 175

Ile Gly Ala Gly Gly Leu Gly Gly Asn Ala Ile Gln Val Ala Lys Ala

180 185 190

Phe Gly Ala Lys Val Thr Val Leu Asp Lys Lys Asp Lys Ala Arg Asp

195 200 205

Gln Ala Lys Ala Phe Gly Ala Asp Gln Val Tyr Ser Glu Leu Pro Asp

210 215 220

Ser Val Leu Pro Gly Ser Phe Ser Ala Cys Phe Asp Phe Val Ser Val

225 230 235 240

Gln Ala Thr Tyr Asp Leu Cys Gln Lys Tyr Cys Glu Pro Lys Gly Thr

245 250 255

Ile Val Pro Val Gly Leu Gly Ala Thr Ser Leu Asn Ile Asn Leu Ala

260 265 270

Asp Leu Asp Leu Arg Glu Ile Thr Val Lys Gly Ser Phe Trp Gly Thr

275 280 285

Ser Met Asp Leu Arg Glu Ala Phe Glu Leu Ala Ala Gln Gly Lys Val

290 295 300

Lys Pro Asn Val Ala His Ala Pro Leu Ser Glu Leu Pro Lys Tyr Met

305 310 315 320

Glu Lys Leu Arg Ala Gly Gly Tyr Glu Gly Arg Val Val Phe Asn Pro

325 330 335

Claims

1.一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶；所述NADH辅酶体系为醇脱氢酶、NAD+和异丙醇组成的底物偶联的辅酶循环混合体系；所述NADH辅酶体系中NAD⁺的浓度为0.05~0.5 mmol/L，异丙醇13.5~198 g/L。

2.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：N-boc-3-哌啶酮的浓度为15~220 g/L，醇脱氢酶活性为5.6 U/mg蛋白，用量为60U~6000U。

3.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：反应条件为pH6.0~7.5、20~35℃、180~280rpm条件下反应1~12h。

4.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：所述NADH辅酶体系为NAD⁺、甲酸钠和甲酸脱氢酶混合体系。

5.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：所述NADH辅酶体系为NAD⁺、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶混合体系。

6.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：所述的醇脱氢酶是通过表达含有基因序列如SEQ ID NO：1所示的重组菌得到的。

7.根据权利要求3所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：反应条件为pH7.0、30℃、200rpm条件下反应6h。