CN109182410B

CN109182410B - 一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法

Info

Publication number: CN109182410B
Application number: CN201811148796.XA
Authority: CN
Inventors: 杨仲毅
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN109182410A

Abstract

本发明涉及一种(S)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶的酶催化制备方法，属于生物催化技术领域。为了解决现有的酶催化的局限性，提供一种(S)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶的酶催化制备方法，该方法包括在辅酶及辅酶再生体系的共同作用下，将底物N‑Boc‑3‑哌啶酮在含羰基还原酶的催化剂作用下进行酶催化还原反应转化成(S)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶，所述羰基还原酶具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明具有酶催化活性高且实现高收率的效果。

Description

一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法

技术领域

本发明涉及一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶是一个重要的医药中间体，广泛应用于镇痛、抗精神病、抗肿瘤药物等合成，如可用于抗肿瘤药物依鲁替尼、夫拉平度、抗疟疾药物常山碱和异常山碱等的合成。目前，对于光学活性的(S)-N-Boc-3-羟基哌啶可通过化学法或酶促生物法得到，但是，采用化学法合成的产物大多为对消旋-3-羟基哌啶或N-Boc-3-羟基哌啶需进行拆分得到。拆分方法的局限性在于收率较低，且分离提取也较为复杂，不利于工业化生产。而采用生物法以酶催化为主要方法，通过生物催化羰基不对称还原，其最大理论收率及对映体过量值在100％，且反应体系简单、绿色环保，是手性醇生产的重要方法之一。而采用羰基还原酶催化N-Boc-3-哌啶酮得到(S)-N-Boc-3-羟基哌啶。生物催化得到的终产物光学纯度主要依赖于羰基还原酶的手性选择性，因此，对于羰基还原酶的选择是关键性的因素之一。虽然，现有的也有报道采用羰基还原酶进行生物催化的报道，但酶的来源及制备方法上仍存在局限性。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，解决的问题是提供一种新的酶催化且能生成高手性纯度质量的产物。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

在辅酶及辅酶再生体系的共同作用下，将底物N-Boc-3-哌啶酮在含羰基还原酶的催化剂作用下进行酶催化还原反应转化成(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，所述羰基还原酶具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明通过大量的研究最终筛选到的上述具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的羰基还原酶，能够有效的将底物中的羰基转化成手性产物，具手性纯度也较高，能够达到99％以上，同时，也能够保证产物的收率，也就是说，本发明开发提供了一种新的生物催化的酶催化剂，从而使能够有效提供一种新的酶催化合成工艺，扩展了该产物的酶催化的多样性。同时，本发明的具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的羰基还原酶(羰基还原酶I)可以是来源于Novosphingobium；具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的羰基还原酶(羰基还原酶Ⅱ)可以是来源于Lactobaci l lus Kefir，这也为提供新的用于该产物的羰基转化成高手性的羟基的羰基还原酶提供更好的可选择性，有利于工业化的生产需求。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，这里的羰基还原酶可以以不同形式添加到酶催化反应体系中，最好使采用由基因工程菌发酵培养得到。可以是采用含有T7启动子和表达相应重组羰基还原酶I或Ⅱ(SEQ NO.1或SEQ NO.2)的重组大肠杆菌。作为优选，所述含羰基还原酶的催化剂选自含相应羰基还原酶的菌体酶、菌体破壁后的液体酶和酶粉中的一种或几种。具有原料添加方便，易于操作的优点，且直接采用破壁液等作为相应的羰基还原酶，能够更好的保证酶的活性。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述羰基还原酶为具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列时，所述辅酶为辅酶Ⅰ；所述羰基还原酶为具有如SEQID NO.2的氨基酸序列时，所述辅酶为辅酶Ⅱ。这里对于两种羰基还原酶采用对应的辅酶类型，能够使酶催化反应更有效的进行，进一步的保证最终产物的光学纯度和产品收率。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述辅酶再生体系选自葡糖糖脱氢酶体系、甲酸脱氢酶体系或次级醇还原酶体系。既能够使酶催化体系能够有效进行，又能够使反应在相应的酶催化体系的溶剂进行温和的反应，有利于安全生产。更进一步的优选，所述辅酶再生体系中以异丙醇为再生底物，既可以作为溶剂，又可以更好的作为酶再生的体系，使氧化为丙酮时能将氧化型辅酶再生为还原型辅酶。其中，羰基还原酶I的催化体系中辅酶再生原理如下所示：

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述酶催化还原反应的温度为30℃～40℃。具有反应条件温和转化率高的优点。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述酶催化还原反应在pH值为6.0～9.0。能更有效的保证酶的活性，提高酶催化反应的效果。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述酶催化还原反应还在磷酸钾缓冲液存在下进行。通过该缓冲液的存在，能够反应体系处于一定较平稳的pH值体系，避免体系中的pH值变化过大，更有效的保证反应的稳定进行。

在上述(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法中，作为优选，所述辅酶的用量为N-Boc-3-哌啶酮的用量的0.3wt％～0.6wt％。通过控制辅酶的用量能够，减少辅酶原料的浪费，提高利用率。

综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

通过采用本发明的具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的相应羰基还原酶，在相应的辅酶及再生体系共同作用下，能够有效的使底物转化成高手性的产物，且具有收率高的优点，实现一种新的酶催化合成工艺，使能够实现酶催化的多样化效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

实施例1

TB培养基的配制：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾10g，磷酸氢二钾12g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基。

将60mL含有T7启动子和表达重组羰基还原酶(SEQ NO.1)的重组大肠杆菌菌种接入到TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液450mL，继续升温控制温度在37℃进行发酵培养至24h，培养结束后发酵得到相应的发酵液6.5L。离心收集菌体，-20℃保存备用。

取上述得到的菌体100g，以1.0L 50mmol/L且pH值为7.0的磷酸钾缓冲液进行重悬，而后经高压均质破壁2遍后得到相应的破壁酶液，再经10000rpm离心10min，得到待用酶液。

实施例2

将60mL含有T7启动子和表达重组羰基还原酶(SEQ NO.1)的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后控制温度在37℃下通气搅拌进行活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液450mL，继续控制温度在37℃进行低温发酵培养2h之后，将温度逐渐提高到39℃，再进行高温发酵培养24h，高温发酵培养结束后，如直接将发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物。上清液可以直接用于下游生物转化反应。

实施例3

将60mL含有T7启动子和表达重组羰基还原酶(SEQ NO.2)的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液450mL，继续控制温度在37℃进行发酵培养至24h，培养结束后发酵得到相应的发酵液6.5L。离心收集菌体，于-20℃保存备用。

实施例4

取10g实施例3得到的菌体悬浮于800mL 100mM pH7.0磷酸钾缓冲液，加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇100g，NAD 0.4g，然后，控制温度在35℃的条件下搅拌反应20h，离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，浓缩液以正己烷为溶剂，在0～4℃的条件下搅拌析出白色固体，过滤干燥后得到产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶90.4g，ee值为99.6％。

实施例5

取100mL实施例1得到的酶液(均质破壁的酶液)加入到700mL 100mM pH7.0磷酸钾缓冲液中悬浮，然后，再加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇100g和NAD 0.4g，再升温控制温度在30℃左右的条件下搅拌反应20h，反应结束后，反应液直接以乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩除去溶剂，得到的浓缩液以正己烷为溶剂进行结晶并使在4℃搅拌析晶完全使析出白色固体，过滤干燥后得到产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶91.5g，ee值为99.5％。

实施例6

将150mL实施例2得到的含羰基还原酶(SEQ NO.1)的上清液加入到650mL 100mMpH7.0磷酸钾缓冲液中，再加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇100g，NAD 0.4g，然后，控制温度在40℃的条件下搅拌反应22h，反应结束后，将得到的反应液直接加入乙酸乙酯萃取，萃取液进行减压浓缩除去溶剂，再将浓缩液以正己烷为溶剂进行结晶，并控制温度在4℃下搅拌析晶使析出白色固体，过滤干燥后得到相应的产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶92.1g，ee值为99.3％。

实施例7

将10g实施例3得到的菌体悬浮于800mL 100mM pH7.0磷酸钾缓冲液，加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇100g，NADP 0.5g，然后，控制温度在37℃的条件下搅拌反应24h，离心分离菌体，再向清液中加入乙酸乙酯萃取，萃取液进行减压浓缩除去溶剂，收集的浓缩液以正己烷为溶剂进行结晶，并控制温度在4℃搅拌析出白色固体，过滤干燥后得到产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶89.2g，ee值为99.3％。

实施例8

将100mL实施例2得到的上清液(含羰基还原酶(SEQ NO.1))悬浮于800mL 100mMpH7.0磷酸钾缓冲液，使反应体系的pH值保持在6.0～9.0之间，加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇100g，NADP 0.3g，然后，控制温度在40℃的条件下搅拌反应24h，离心分离菌体，再向清液中加入乙酸乙酯萃取，萃取液进行减压浓缩除去溶剂，收集的浓缩液以正己烷为溶剂进行结晶，并控制温度在4℃搅拌析出白色固体，过滤干燥后得到产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶90.5g，ee值为99.5％。

实施例9

将100mL实施例1得到的酶液(含羰基还原酶(SEQ NO.1))悬浮于800mL 100mMpH7.0磷酸钾缓冲液，使反应体系的pH值保持在6.0～9.0之间，加入底物N-Boc-3-哌啶酮100g、异丙醇150g，NADP 0.6g，然后，控制温度在30℃的条件下搅拌反应24h，离心分离菌体，再向清液中加入乙酸乙酯萃取，萃取液进行减压浓缩除去溶剂，收集的浓缩液以正己烷为溶剂进行结晶，并控制温度在5℃～8℃进行搅拌析晶使析出白色固体，过滤干燥后得到产品(S)-N-Boc-3-羟基哌啶91.2g，ee值为99.6％。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 台州学院

<120> 一种（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 羰基还原酶I(Novosphingobium)

<400> 1

Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val

1 5 10 15

Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys

20 25 30

Ala Ala Asn Ala Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp

35 40 45

Val Glu Gly Ala Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala

50 55 60

Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val

65 70 75 80

Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys Phe Glu

85 90 95

Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp

100 105 110

Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Arg Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val

130 135 140

Ala Gly Leu Arg Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys

145 150 155 160

Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp

180 185 190

Thr Pro Met Leu Gly Ser Leu Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala

195 200 205

Ala Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro

210 215 220

Ile Gly Arg Met Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr

225 230 235 240

Leu Cys Ser Asp Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met

245 250 255

Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val

260

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 羰基还原酶Ⅱ(Lactobacillus kefir)

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Tyr Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Val

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Thr

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ser Cys Val Leu

85 90 95

Lys Ser Val Lys Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

Claims

1.一种（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

在辅酶及辅酶再生体系的共同作用下，将底物N-Boc-3-哌啶酮在含羰基还原酶的催化剂作用下进行酶催化还原反应转化成（S）-N-Boc-3-羟基哌啶，所述羰基还原酶为如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述含羰基还原酶的催化剂选自含相应羰基还原酶的菌体酶、菌体破壁后的液体酶和酶粉中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述辅酶为辅酶Ⅰ。

4.根据权利要求1或2或3所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述辅酶再生体系选自葡糖糖脱氢酶体系、甲酸脱氢酶体系或次级醇还原酶体系。

5.根据权利要求1或2或3所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述酶催化还原反应的温度为30℃～40℃。

6.根据权利要求1或2或3所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述酶催化还原反应在pH值为6.0～9.0。

7.根据权利要求6所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述酶催化还原反应还在磷酸钾缓冲液存在下进行。

8.根据权利要求1或2或3所述（S）-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述辅酶的用量为N-Boc-3-哌啶酮的用量的0.3wt%～0.6wt%。