CN111662832A

CN111662832A - 一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株的构建方法和应用

Info

Publication number: CN111662832A
Application number: CN202010541446.0A
Authority: CN
Inventors: 张标; 任丽丽; 李峰; 徐大勇; 曾昕
Original assignee: Huaibei Normal University
Current assignee: Huaibei Normal University
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111662832B

Abstract

本发明公开了一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株及其构建方法和应用，其中耐热酵母工程菌株为耐热酵母工程菌株YZB194，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年11月25日，保藏编号：CGMCC NO.19004。YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖合成203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为2.99g/L/h，木糖转化率达到最大理论值的99％。

Description

一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株的构建方法和应用

技术领域

本发明属于微生物代谢工程以及微生物发酵工程领域，具体涉及一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物[11]。它被人体利用时不需要胰岛素的促进作用，在体内可促进胰岛素的少量分泌；用于静脉滴注时，血液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量会有所下降，肝糖元则有增加；无细胞毒性，可透过细胞膜成为组织的营养等。这些特性使得木糖醇具有重要的应用价值。另外，木糖醇作为甜味剂，口感清凉，而且可以预防龋齿；作为食品添加剂，可延长食品的保鲜期；木糖醇是糖尿病患者的理想的辅助治疗剂和营养甜味剂[1,5,6,8,9,11]。

目前木糖醇的生产主要是通过工业生产的方式。工业生产主要是化学加氢法，加氢需要高温高压，增加了生产成本，同时工艺复杂、收率低，限制了木糖醇的大规模生产，并且加氢需要镍的催化作用，这就带来了低食品安全和环境污染的隐患[3]。针对化学法生产木糖醇存在的问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物法来生产木糖醇。微生物法的原理是利用细胞内的木糖还原酶(XR)，将木糖还原为木糖醇，而不需要镍的催化作用，保证的食品安全却又不会带来环境污染；氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，不需另行制氢，反应在常温常压下进行，降低了成本。又由于酶的底物专一性，使得原料不必高度精制。因此，利用微生物来生产木糖醇将具有污染少、成本低、产品质量高并且无环境污染等优点，具有非常大的发展前景。

本发明中用来生产木糖醇的菌株为马克斯克鲁维耐热酵母(K.marxianus)。马克斯克鲁维酵母在高温下发酵有以下几个优点：1、高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2、纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF) 效率，促进糖化，减少在酶上的费用[4]；3、能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险[8,12]。除此之外，马克斯克鲁维酵母是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86-0.99h^-1，40℃)[2]。马克斯克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于马克斯克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，而被越来越多的用于生物能源的生产[4]，所以利用马克斯克鲁维酵母发展成木糖醇生产菌株有非常重要的应用价值。

木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料[17]。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键[10]。木质纤维素生物质(如农业废物玉米秸秆等)是丰富的可再生材料，同时木质纤维素可以从农业废物如玉米秸秆等中获得，不会与粮食造成竞争。因此，利用生物从可再生资源中生产有价值的产物木糖醇具有极大的经济和环境意义。葡萄糖和木糖是其水解液的主要两个单糖成份，要建立经济的工业利用过程，需要对两种糖的高效利用和发酵[6]，但目前的方法都不够高效，尤其是葡萄糖和木糖同时存在时，由于葡萄糖抑制效应，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而导致效率低下。各种工程菌株的构建，使利用木糖发酵生产木糖醇的能力不断提高，但是葡萄糖的抑制效应常常难以解除。在构建的马克斯克鲁维酵母菌株葡萄糖的抑制效应非常明显，因此利用葡萄糖和木糖共同发酵一直是一个瓶颈。

目前已经有一些利用耐热酵母发酵生产木糖醇的报道，其中申请人所在的项目组研究最为系统。申请人前期构建的耐热酵母工程菌YZJ015可以在不添加共培养底物的情况下，利用木糖作为单一碳源提供细胞生长所需的能量和还原力，在发酵结束时积累木糖醇，该菌株的缺点是木糖的转化率较低，因为有一部分木糖被彻底代谢为细胞提供能量[18]。申请人前期构建的耐热酵母工程菌YZJ017可以同步共利用甘油和木糖，以甘油作为碳源和能源，提供还原力还原木糖生成木糖醇，该菌株的木糖转化率接近最大理论值，但是甘油不是生物质水解物的主要成分，以葡萄糖作为木糖醇合成的共培养底物是更具应用价值的方向[18]。申请人前期构建的耐热酵母工程菌YZJ119可以同步共利用60g/L的木糖和120g/L的葡萄糖，发酵结束时积累约60g/L木糖醇和55g/L乙醇。该菌株的缺点是单位葡萄糖转化木糖的比例较低，每消耗2g葡萄糖才能合成1g木糖醇，并且发酵结束有乙醇的积累，不利于产物的纯化[16]。申请人前期参与构建的耐热酵母工程菌YHY013可以共利用20g/L葡萄糖和80g/L 木糖合成约60g/L木糖醇，该菌株的缺点是葡萄糖和木糖的利用不同步，葡萄糖先于木糖被利用完，后续消耗木糖作为能量和还原力的来源，所以木糖的转化率较低，约为0.75g/g[7]。

综上所述，木糖醇作为一种重要的化合物，广泛应用于食品、医药、化工等领域，但其应用受限于工业生产的安全性与高成本。本发明通过基因工程遗传育种，获得马克斯克鲁维酵母工程菌株YZB194，可以在高温下同步共利用木质纤维素的主要水解产物葡萄糖和木糖为底物高效生产木糖醇，发酵结束没有其他副产物的积累，木糖的转化率接近理论最大值 (99％)，合成每消耗1g葡萄糖约合成1.67g木糖醇。因此，本发明在利用生物质高效生物转化生产高附加值产品上有较大的应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株及其构建方法和应用。本发明以耐热性马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为平台，利用基因工程、代谢工程等方法，在一株重组表达了粗糙脉孢霉木糖还原酶(NcXR)和木糖特异性转运蛋白突变体(ScGAL2N376F)并敲除了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD1)的菌株YZJ119的基础上，构建了一种葡萄糖-6-磷酸异构酶(PGI)和木糖醇脱氢酶(XDH)缺失的菌株YZB194，所构建的菌株 YZB194具备高温好氧条件下高效同步共利用葡萄糖和木糖高效生产木糖醇的能力，且在发酵过程不产生副产物乙醇。本发明的研究结果将有力拓展合成生物学和代谢工程技术在诸多领域的应用，同时为葡萄糖和木糖同步共利用的分子机制提供新的理解。

本发明高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株，为耐热酵母工程菌株YZB194，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期： 2019年11月25日，保藏编号：CGMCC NO.19004。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，是以耐热酵母K.marxianusYZJ119菌株作为宿主，构建其葡萄糖-6-磷酸异构酶(PGI)和木糖醇脱氢酶(XDH)缺失的重组菌株，使重组菌株的葡萄糖经戊糖磷酸途径代谢，提供还原力将木糖还原成木糖醇。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，是通过基因工程的方法，首先以耐热酵母YZJ119 的尿嘧啶缺陷型菌株YZJ120为基础，敲除其KU70基因，构建具有高效同源重组能力的工程菌株，得到的菌株命名为YZB149；随后将YZB149中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为 YZB153；接下来将YZB153菌株的葡萄糖-6-磷酸异构酶编码基因PGI1敲除，得到葡萄糖-6- 磷酸异构酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB174；随后将YZB174中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为YZB181；最后将YZB181菌株的木糖醇脱氢酶编码基因XYL2敲除，得到糖醇脱氢酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB194。

本发明耐热酵母工程菌株的构建方法，具体包括如下步骤：

步骤1：以质粒pZB061为模板，用引物KU70-F(序列1)和KU70-R(序列2)PCR扩增KU70-URA3基因片段，将KU70-ScURA3基因片段导入YZJ120中，利用同源重组原理敲除KU70基因，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB149；

步骤2：以质粒pMD18T-ΔURA3为模板，用引URA3-F(序列7)和URA3-R(序列8)PCR扩增URA3敲除片段，将URA3敲除片导入YZB149中，再次敲除菌株YZB149内的URA3基因作为筛选标签，获得的菌株命名为YZB153；

步骤3：以质粒pZB054为模板，用引物PGI1-F(序列3)和PGI1-R(序列4)PCR扩增PGI1-URA3基因片段，将PGI1-URA3基因片段导入YZB153中，使菌株YZB153内的PGI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB174；

步骤4：以质粒pMD18T-ΔURA3为模板，PCR扩增URA3敲除片段，将URA3敲除片导入YZB174中，再次敲除菌株YZB174内的URA3基因作为筛选标签，获得的菌株命名为YZB181；

步骤5：以质粒pZB085为模板，用引物XDH-F(序列5)和XDH-R(序列6)PCR扩增XYL2-URA3基因片段，将XYL2-URA3基因片段导入YZB181中，使菌株YZB181内的XYL2被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB194。

本发明制备过程中使用的质粒均可由常规现有技术制备获得，质粒的功能和来源如下：

①质粒pMD18T-ΔURA3包含URA3基因的敲除盒，用于将尿嘧啶原养型马克斯克鲁维酵母菌株的尿嘧啶合成基因URA3敲除，从而得到尿嘧啶合成缺陷型菌株。因此，URA3基因就可以作为尿嘧啶合成缺陷型菌株基因转化的筛选标签。该质粒由发明人构建，具体构建过程见参考文献18。

②质粒pZB061包含马克斯克鲁维酵母KU70基因的敲除盒，用于将KU70基因从马克斯克鲁维酵母的基因组中敲除，该基因敲除后对菌株的生长代谢等影响可以忽略不计，却可以大大增加基于同源重组的基因敲除效率，为后续进一步的基因敲除的基因工程改造提供保障。该质粒由发明人构建，具体构建过程见参考文献13。

③质粒pZB054包含马克斯克鲁维酵母PGI1基因的敲除盒，用于将编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因PGI1从马克斯克鲁维酵母的基因组中敲除，该基因敲除后将切断马克斯克鲁维酵母中葡萄糖经糖酵解途径的代谢路线，迫使全部葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢，该途径是生物体还原反应所需辅酶NADPH的主要来源，NADPH的产生有利于NADPH-依赖的还原反应的进行。该质粒由发明人构建，具体构建过程见参考文献15。

④质粒pZB085包含马克斯克鲁维酵母XYL2基因的敲除盒，用于将编码木糖醇脱氢酶的基因XYL2从马克斯克鲁维酵母的基因组中敲除，该基因敲除后将切断马克斯克鲁维酵母中木糖醇继续向下代谢的途径使木糖代谢停留在木糖醇阶段，有利于马克斯克鲁维酵母积累木糖醇。该质粒由发明人构建，具体构建过程见参考文献14。

本发明耐热酵母工程菌株的应用，是在高温条件下共利用葡萄糖和木糖高效生产木糖醇，并且发酵结束没有乙醇等副产物的积累。发酵过程不需额外补充添加剂，发酵初始接种量为发酵体积的10％。

该体系在分批发酵时能耐受高达100g/L的木糖，体系中葡萄糖的浓度含量为木糖浓度含量的60％，即体系中葡萄糖的浓度为60g/L，木糖的浓度为100g/L。通过分批补料发酵，可以进一步提高木糖醇的产量。

所述高温是指37-42℃，优选为42℃。

具体地说，本发明耐热酵母工程菌株YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批发酵共利用60g/L葡萄糖和100g/L木糖产生99.61g/L木糖醇，木糖醇合成速率为1.84g/L/h，合成效率为1.67g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖产生203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为 2.99g/L/h，合成效率为1.69g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。

所述共利用葡萄糖和木糖是指底物中的葡萄糖和木糖的利用是同步进行的，不存在葡萄糖先于木糖利用完的情况。耐热酵母正常生理代谢所需碳源和能源全部来源于葡萄糖，葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢后产生的NADPH用于将木糖还原生成木糖醇。

本发明共利用葡萄糖和木糖高效生产木糖醇中获得的木糖醇全部来自木糖的还原，木糖醇代谢途径被切断，木糖转化成木糖醇的比例达到理论值的99％以上。

本发明耐热酵母工程菌株YZB194对于生物质水解产物在高温下好氧发酵生产高附加值的木糖醇具有重要意义。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用基因工程、代谢工程、分子生物学以及合成生物学的技术和方法，理性设计甘油生产路径，结合生物合成法高效无污染的特色和自然界发酵原料可持续获得的优势，以耐热酵母为平台，构建出有效的以葡萄糖为共培养底物，利用木糖合成木糖醇生产工程菌株，从而研究耐热酵母高温发酵转化木糖合成木糖醇与辅酶代谢的关联机制，最终建立和示范一种低成本、高效率、利用可再生资源的绿色环保的新型合成生物学的工业化应用。这些努力将有力拓展合成生物学和代谢工程技术在诸多领域的应用。本发明获得的菌株YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批发酵可以共利用60g/L葡萄糖和100g/L木糖产生99.61g/L木糖醇，木糖醇合成速率为1.84g/L/h，合成效率为1.67g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。 YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵，中间添加一次约60g/L葡萄糖和100 g/L木糖，最终达到共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖产生203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为 2.99g/L/h，合成效率为1.69g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。此菌株对于开发纤维素、半纤维素生物质发酵生产高附加值的木糖醇具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明耐热酵母工程菌株YZB194在42℃分别利用发酵罐分批发酵(A)和补料发酵(B)共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的结果。

图2是本发明制备流程示意图。

具体实施方式

试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上纯度。其中，葡萄糖、酵母基本氮源、尿嘧啶、木糖、木糖醇、胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。T4 DNA连接酶购于大连宝生物公司。Fast Pfu和Fast Taq DNA聚合酶购于滁州吐露港生物公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福尼亚Stratagene公司)，包含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(YNB葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶20mg/mL) 主要用于转化。YPD培养基(10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)用于酵母的前培养。YPDX(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，60g/L葡萄糖和120g/L木糖)用于木糖醇的合成发酵。

本发明耐热酵母工程菌株YZB194，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年11月25日，保藏编号：CGMCCNO.19004。

实施例1：菌株的制备

1、将外源DNA导入耐热酵母

(1)酵母化学转化步骤

①各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。

②取5mL液体YPD,并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。

③取1mL培养物转接于装入9mL液体YPD的50mL三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。

④取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。

⑤配制1mL转化缓冲液：800μL 50％PEG4000；50μL 4M醋酸锂；50μL ddH₂O；100μL1M DTT(溶于10mM醋酸钠,pH5.2)。

⑥使用200μL转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。

⑦用100μL转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μL(1-10μg)线性化的质粒,轻微震荡30sec。

⑧在47℃条件下水浴15min。

⑨将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。

⑩挑取板上单菌落在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。

(2)本发明中构建各种耐热酵母敲除菌株的具体过程

以pZB061敲除片段为模板，用引物KU70-F(序列1)和KU70-R(序列2)PCR扩增KU70-URA3基因片段。将KU70-URA3基因片段导入YZJ120中，经过同源重组后，使菌株 YZJ120内的KU70被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB149。

以pMD18T-ΔURA3敲除片段为模板，用引物URA3-F(序列7)和URA3-R(序列8)PCR扩增URA3敲除片段。将URA3敲除片导入YZB149中，同源重组后，使菌株YZB149内的URA3 基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/mL，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选URA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB153。

以pZB054敲除片段为模板，用引物PGI1-F(序列3)和PGI1-R(序列4)PCR扩增PGI1-URA3基因片段。将PGI1-URA3基因片段导入YZB153中，经过同源重组后，使菌株YZB153内的PGI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB174。

以pMD18T-ΔURA3敲除片段为模板，用引物URA3-F(序列7)和URA3-R(序列8)PCR扩增URA3敲除片段。将URA3敲除片导入YZB174中，同源重组后，使菌株YZB174内的URA3 基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/mL，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZB181。

以pZB085敲除片段为模板，用引物XDH-F(序列5)和XDH-R(序列6)PCR扩增 XYL2-URA3基因片段。将XYL2-URA3基因片段导入YZB181中，经过同源重组后，使菌株 YZB181内的XYL2被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZB194。

(3)扩增敲除片段的PCR体系

对应PCR程序：

2、阳性转化子的鉴定

(1)提取转化子的基因组

①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

④.取200μl实验室自配1x breaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100 mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠 (425-600um，sigma，美国)的EP管内。

⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl 1x TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)。轻微震荡。

⑥.12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。

⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl 1x TE重悬沉淀。

⑧.加入2μl RNase(RNA水解酶,中国上海生工生物)，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。

⑨.取40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。

⑩.12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

(2)鉴定酵母转化阳性菌株的PCR体系

对应PCR程序：

实施例2：构建的工程菌株发酵情况

本实施例用于测试工程菌株共利用葡萄糖和木糖发酵生产木糖醇的效果。结果表明通过改造耐热酵母得到的工程菌株可以在高温下(42℃)好氧发酵高效生产木糖醇，发酵结束发酵液中几乎不含副产物。

1、在YPE培养基平板上复苏菌株YZB194，37℃培养1天。

2、挑取单克隆，接于5mL液体YPE培养基，37℃、250rpm，过夜。

3、种子培养。将5mL液体YPE培养基转接到250mLYPE，37℃，250rpm，培养48h。

4、配制2.5LYPDX(60g/L葡萄糖和100g/L木糖)培养基于5L发酵罐中，灭菌待用。

5、将250mL种子培养基接入2.5L发酵培养基中，42℃、转速400rpm，通气量1vvm发酵。

6、定时取样，并取上清通过HPLC检测分析(图1)。

7、从图1可知，YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批发酵共利用60g/L葡萄糖和 100g/L木糖合成99.61g/L木糖醇，木糖醇合成速率为1.84g/L/h，合成效率为1.67g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖合成203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为2.99g/L/h，合成效率为 1.69g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。

参考文献

1.Ahmad I,Shim WY,Jeon WY,Yoon BH,Kim JH(2011)Enhancement of xylitolproduction in Candida tropicalis by co-expression of two genes involved inpentose phosphate pathway.Bioprocess Biosyst Eng

2.Banat IM,Marchant R(1995)Characterization and potential Industrialapplications of 5novel,thermotolerant, fermentative,yeast strains.WorldJ.Microbio.Biotechnol.11:304-306

3.Cheng KK,Zhang JA,Chavez E,Li JP(2010)Integrated production ofxylitol and ethanol using corncob. Applied Microbiology and Biotechnology 87:411-417

4.Fonseca GG,Heinzle E,Wittmann C,Gombert AK(2008)The yeastKluyveromyces marxianus and its biotechnological potential.AppliedMicrobiology and Biotechnology 79:339-354

5.Ha SJ,Galazka JM,Kim SR,Choi JH,Yang X,Seo JH,Glass NL,Cate JH,JinYS(2011)Engineered Saccharomyces cerevisiae capable of simultaneouscellobiose and xylose fermentation.Proc Natl Acad Sci U S A 108:504-509

6.Ha SJ,Kim SR,Choi JH,Park MS,Jin YS(2011)Xylitol does not inhibitxylose fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae expressing xylA asseverely as it inhibits xylose isomerase reaction in vitro.Appl MicrobiolBiotechnol

7.Hua Y,Wang J,Zhu Y,Zhang B,Kong X,Li W,Wang D,Hong J(2019)Releaseof glucose repression on xylose utilization in Kluyveromyces marxianus toenhance glucose-xylose co-utilization and xylitol production from corncobhydrolysate.Microb Cell Fact 18:24

8.Kumar S,Singh SP,Mishra IM,Adhikari DK(2009)Ethanol and xylitolproduction from glucose and xylose at high temperature by Kluyveromyces sp IIPE453.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36:1483-1489

9.Mueller M,Wilkins M,Banat IM(2011)Production of Xylitol by theThermotolerant Kluyveromyces marxianus IMB Strains.J.Bioproces.Biotechniq.1:102e

10.Sasaki M,Jojima T,Inui M,Yukawa H(2010)Xylitol production byrecombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation.Appl.Microbiol.Biotechnol.86:1057-1066

11.Vandeska E,Amartey S,Kuzmanova S,Jeffries TW(1996)Fed-batchculture for xylitol production by Candida boidinii.Process Biochem.31:265-270

12.Zhang B,Li LL,Zhang J,Gao XL,Wang DM,Hong J(2013)Improving ethanoland xylitol fermentation at elevated temperature through substitution ofxylose reductase in Kluyveromyces marxianus.J Ind Microbiol Biotechnol 40:305-316

13.Zhang B,Ren L,Wang Y,Xu D,Zhang S,Wang HN,Wang H,Zeng X,Xin B,Li F(2020)Glycerol production through TPI1 defective Kluyveromyces marxianus athigh temperature with glucose,fructose,and xylose as feedstock.In press.

14.Zhang B,Ren L,Xu D,Zeng X,Xing B,Li F(2020)Rapid refactoringxylitol-producing Kluyveromyces marxianus with transient CRISPR/Cas9.Inpress.

15.Zhang B,Ren L,Zeng S,Zhang S,Xu D,Zeng X,Li F(2020)Functionalanalysis of PGI1 and ZWF1 in thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus Inpress.

16.Zhang B,Zhang J,Wang DM,Han RX,Ding R,Gao XL,Sun LH,Hong J(2016)Simultaneous fermentation of glucose and xylose at elevated temperatures co-produces ethanol and xylitol through overexpression of a xylose-specifictransporter in engineered Kluyveromyces marxianus.Bioresour Technol 216:227-237

17.Zhang B,Zhang L,Wang DM,Gao XL,Hong J(2011)Identification of axylose reductase gene in the xylose metabolic pathway of Kluyveromycesmarxianus NBRC1777.J Ind Microbiol Biotechnol 38:2001-2010

18.Zhang J,Zhang B,Wang DM,Gao XL,Hong J(2014)Xylitol production athigh temperature by engineered Kluyveromyces marxianus.Bioresour Technol 152:192-201

序列1-6为引物

序列1KU70-F

5′-CTTTTTAAAGAGCCAGTTGTC-3′

序列2KU70-R

5′-TTCTGTTTTGGTTTTGATTC-3′

序列3PGI1-F

5′-TCAGACTTTAAGTTGGCAAC-3′

序列4PGI1-R

5′-GTTGATCAAACCGTTGGTAG-3′

序列5XDH-F

5′-ATGACCAACACTCAAAAAGC-3′

序列6XDH-R

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序列7URA3-F

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序列8URA3-R

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Organization Applicant

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City :

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<110> OrganizationName : 淮北师范大学

Application Project

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<120> Title : 一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株的构建方法和应用

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Claims

1.一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株，其特征在于：

所述耐热酵母工程菌株为耐热酵母工程菌株YZB194，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年11月25日，保藏编号：CGMCC NO.19004。

2.一种权利要求1所述的耐热酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：

通过基因工程的方法，首先以耐热酵母YZJ119的尿嘧啶合成基因缺陷型菌株YZJ120为基础，敲除其KU70基因，构建具有高效同源重组能力的工程菌株，得到的菌株命名为YZB149；随后将YZB149中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为YZB153；接下来将YZB153菌株的葡萄糖-6-磷酸异构酶编码基因PGI1敲除，得到葡萄糖-6-磷酸异构酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB174；随后将YZB174中的URA3基因再次敲除，得到的菌株命名为YZB181；最后将YZB181菌株的木糖醇脱氢酶编码基因XYL2敲除，得到木糖醇脱氢酶功能缺失的耐热酵母工程菌株，命名为YZB194。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：以质粒pZB061为模板，用引物KU70-F即序列1和KU70-R即序列2PCR扩增KU70-URA3基因片段，将KU70-ScURA3基因片段导入YZJ120中，利用同源重组原理敲除KU70基因，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB149；

步骤2：以质粒pMD18T-ΔURA3为模板，用引URA3-F即序列7和URA3-R即序列8PCR扩增URA3敲除片段，将URA3敲除片导入YZB149中，再次敲除菌株YZB149内的URA3基因作为筛选标签，获得的菌株命名为YZB153；

步骤3：以质粒pZB054为模板，用引物PGI1-F即序列3和PGI1-R即序列4PCR扩增PGI1-URA3基因片段，将PGI1-URA3基因片段导入YZB153中，使菌株YZB153内的PGI1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB174；

步骤5：以质粒pZB085为模板，用引物XDH-F即序列5和XDH-R即序列6PCR扩增XYL2-URA3基因片段，将XYL2-URA3基因片段导入YZB181中，使菌株YZB181内的XYL2被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能，得到的菌株命名为YZB194。

4.一种权利要求1所述的耐热酵母工程菌株的应用，其特征在于：

在高温条件下共利用葡萄糖和木糖高效生产木糖醇，并且发酵结束没有乙醇等副产物的积累。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述高温条件的温度为37-42℃。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述高温条件的温度为42℃。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：

发酵初始接种量为发酵体积的10％。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

体系中葡萄糖的浓度含量为木糖浓度含量的60％。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

体系中葡萄糖的浓度为60g/L，木糖的浓度为100g/L。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述耐热酵母工程菌株YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批发酵共利用60g/L葡萄糖和100g/L木糖产生99.61g/L木糖醇，木糖醇合成速率为1.84g/L/h，合成效率为1.67g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％；所述耐热酵母工程菌株YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖产生203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为2.99g/L/h，合成效率为1.69g/g葡萄糖，木糖转化率为最大理论值99％。