CN112522121B - 一种克鲁维酵母及其在生产木糖醇中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种克鲁维酵母，所述克鲁维酵母为暹罗克鲁维酵母（Kluyveromyces siamensis THUZTY2041），保藏日期：2020年10月19日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20917，本发明还提供了一种克鲁维酵母在生产木糖醇中的应用，以秸秆糖发酵尾液为原料，可以在低成本条件下，高温培养克鲁维酵母获得木糖醇，摆脱传统工业生产的条件束缚，发挥高温发酵生产的优势，提高了农业秸秆的综合利用价值。

Description

一种克鲁维酵母及其在生产木糖醇中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种克鲁维酵母及其在生产木糖醇中的应用。
背景技术
木糖醇是一种五碳糖醇，广泛应用于化工、食品、医药、皮革及饲料等行业。作为一种食品添加剂，甜度与蔗糖相当，无致龋性，在体内代谢不需要胰岛素的参与，不会引起血糖的升高，在糖尿病人与防龋齿食品中有重要的应用价值。
目前木糖醇的来源主要是工业生产，由D-木糖加氢在高温高压下催化制得，该方法对原料要求高、能耗较大、工艺复杂，限制了木糖醇的大规模生产；同时木糖醇的生产过程中还需要加入镍，存在一定的环境污染和食品安全问题。而D-木糖主要是以玉米芯为原料，采用硫酸处理制得的，在生产D-木糖过程中，不仅能耗较高，而且极易对环境造成污染，同时制备过程中会产生大量的糠醛、5-羟甲基糠醛等物质，不利于后续的木糖的提纯结晶；若将制得的木糖液直接用于微生物的培养，其中含有的糠醛、5-羟甲基糠醛等对菌体生长存在一定的抑制作用。
另一种生产木糖醇的方法是微生物法，该方法具有成本低、反应条件温和、对环境污染小等优点，因此发酵生产木糖醇近年来受到广泛的关注。目前可利用木糖生产木糖醇的微生物主要有酵母、细菌和霉菌，其中酵母的转化能力最强，主要为热带假丝酵母、酿酒酵母、汉逊德巴利酵母等。目前微生物发酵仍然使用玉米芯酸化制得的木糖为原料，且木糖制备过程对环境污染大且对化工设备要求高。本发明筛选到一株克鲁维酵母，并将其应用在发酵生产木糖醇中。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种克鲁维酵母及其在生产木糖醇的应用，以低成本的秸秆糖发酵尾液为原料代替传统的玉米芯，可以在低成本条件下，高温培养克鲁维酵母获得木糖醇，摆脱传统工业生产的条件束缚，发挥高温发酵生产的优势，提高了农业秸秆的综合利用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种克鲁维酵母，其特征在于所述克鲁维酵母为暹罗克鲁维酵母(Kluyveromycessiamensis THUZTY2041)，保藏日期：2020年10月19日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20917。
所述克鲁维酵母经优选所得：海南红树林收集落叶后采用松花粉垂钓法分离得到十多株克鲁维酵母，使用秸秆糖发酵尾液进行高温培养，经过反复筛选驯化，选出对较高发酵温度、发酵尾液适应性最强、木糖醇生产能力最强的一株，再经过发酵尾液连续传代驯化培养，最终获得驯化菌株；克鲁维酵母菌落为乳白色，大而厚、圆形、光滑湿润、具有粘性；用分子生物学手段对其18S rDNA序列进行比对，发现该菌株与克鲁维的18S rDNA序列的同源性为100％，判定本菌株属于克鲁维酵母。
所述克鲁维酵母为克鲁维酵母的18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了克鲁维酵母在生产木糖醇中的应用。
优选地，本发明的克鲁维酵母以含有秸秆糖发酵尾液的发酵培养基发酵生产木糖醇。
优选地，克鲁维酵母发酵生产木糖醇的步骤为：(1)以秸秆糖发酵尾液为原料制备克鲁维酵母发酵培养基：以秸秆糖为碳源，加入适合的无机盐及其他营养成分后，发酵培养不具备木糖代谢能力的微生物，发酵结束后固液分离，测定尾液中木糖浓度、葡萄糖、氮、磷、木质素等指标，根据木糖的浓度浓缩或稀释发酵尾液，使发酵尾液中木糖的初始浓度在18-30g/L，添加2g/L酵母粉与25g/L海盐高温高压灭菌，制得发酵培养基；(2)种子液的制备：将克鲁维酵母的菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中培养，制得种子液；(3)发酵生产木糖醇：将上述所得种子液接入克鲁维酵母发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，待克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分积累木糖醇后，离心或板框压滤去除菌体得到发酵清液，即木糖醇母液；(4)木糖醇母液依次经脱色、脱盐、蒸发浓缩、结晶与离心，得到木糖醇产品。
优选地，所述步骤(1)中，使用不同来源的秸秆糖为碳源对不具备木糖代谢能力的微生物(小球藻、谷氨酸棒状杆菌或酿酒酵母)进行发酵时，发酵结束后发酵尾液中葡萄糖浓度不高于2g/L、木糖浓度为28-30g/L、氮的浓度为220-500mg/L、磷的浓度为25-60mg/L、木质素浓度低于100mg/L。
优选地，所述步骤(1)中，发酵尾液秸秆糖为木糖或葡萄糖和木糖的混合品，所述秸秆糖为小麦秸秆糖、玉米秸秆糖、水稻秸秆糖中的一种；不具备木糖代谢能力的微生物为谷氨酸棒状杆菌、小球藻、酿酒酵母等中的一种；浓缩时采用反渗透膜进行浓缩，使尾液中木糖浓度不低于18g/L；克鲁维酵母发酵发酵培养基配方为：木糖初始浓度为18-30g/L的秸秆糖发酵尾液、2g/L酵母粉、25g/L海盐，高温高压灭菌的条件为115℃，保温15min。
优选地，所述步骤(1)中，不具备木糖代谢能力的微生物以秸秆糖为碳源，经种子培养、发酵得到秸秆糖发酵尾液，浓缩或稀释所得秸秆糖发酵尾液，使木糖初始浓度为18-30g/L。
进一步优选地，所述步骤(1)中，以小麦秸秆秸秆糖为碳源培养谷氨酸棒状杆菌获得发酵尾液的过程包括：a.种子液的制备：将谷氨酸棒状杆菌菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于30℃培养箱恒温培养，振荡速率为250转/分钟，培养3天；其中种子培养基配方：10g/L小麦秸秆秸秆糖(以制得的小麦秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，20g/L(NH4)2SO4，5g/L尿素，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.25g/L MgSO4·7H2O，10mg/L CaCl2，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·H2O，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4，0.02mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L原儿茶酸、42g/L MOPs；b.发酵及尾液的收集：将所得种子液接入初始培养基中，接种量为10％(V/V)，培养温度30℃，搅拌速度为250转/分钟；当残糖浓度低于5g/L时，补加小麦秸秆糖，葡萄糖浓度按菌体葡萄糖消耗速率计算控制，发酵48h后补加50％的其他培养基成分，总葡萄糖消耗达120g/L时，离心固液分离，收集发酵尾液；其中初始发酵培养基配方：10-20g/L小麦秸秆糖(以制得的小麦秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，20g/L(NH4)2SO4，5g/L尿素，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.25g/L MgSO4·7H2O，10mg/L CaCl2，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·H2O，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4，0.02mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L原儿茶酸、42g/L MOPs。
进一步优选地，所述步骤(1)中，以水稻秸秆秸秆糖为碳源培养蛋白核小球藻获得发酵尾液的过程如下：a.种子液的制备：将蛋白核小球藻菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于25℃培养箱恒温培养，振荡速率为120转/分钟，培养4天；其中种子培养基配方为：每升基础培养基加入10g水稻秸秆秸秆糖(以制得的水稻秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，其中基础培养基(mg/L)：771.5尿素、264磷酸氢二钾·3H2O、75MgSO4·2H2O、36CaCl2·2H2O、6柠檬酸、6柠檬酸铁铵、2.86H3BO3、1.86MnCl4·4H2O、0.22ZnSO4·7H2O、0.08CuSO4·5H2O、0.39Na2MoO4·2H2O、0.05CO(NO3)2·6H2O；b.发酵及尾液的收集：将上述所得种子液接入初始培养基中，接种量为10％(V/V)，培养温度25℃，搅拌速度为100转/分钟；当残糖浓度低于5g/L时，补加水稻秸秆秸秆糖，葡萄糖浓度按菌体葡萄糖消耗速率计算控制，发酵48h后补加50％的其他培养基成分，当总葡萄糖消耗达100-200g/L时，离心固液分离，收集发酵尾液；其中初始发酵培养基配方为：每升基础培养基加入10-20g水稻秸秆秸秆糖(以制得的水稻秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，2g酵母粉，25g海水晶；其中基础培养基(mg/L)：771.5尿素、264磷酸氢二钾·3H2O、75MgSO4·2H2O、36CaCl2·2H2O、6柠檬酸、6柠檬酸铁铵、2.86H3BO3、1.86MnCl4·4H2O、0.22ZnSO4·7H2O、0.08CuSO4·5H2O、0.39Na2MoO4·2H2O、0.05CO(NO3)2·6H2O。
发酵尾液收获时，优选控制葡萄糖的残糖量至少低于5g/L，低于2g/L最优；葡萄糖的少许残余可以帮助克鲁维酵母的生长以及较快启动对木糖的利用。
需要说明的时，根据本发明中发酵尾液的获得工艺，葡萄糖浓度基本会低于2g/L，甚至完全不含有葡萄糖。本发明的主要目的是利用克鲁维酵母代谢发酵尾液中的木糖，从而获得木糖醇，以提高农业秸秆的综合利用价值。发酵尾液中的少量葡萄糖的存在，会加速启动对木糖的利用，但葡萄糖是否存在对木糖醇的最终获得没有特别大的影响。
此外，本发明所述步骤(1)中使用的秸秆糖的具体制备步骤为：a.蒸汽爆破：以农业秸秆为原料，采用蒸汽爆破对农业秸秆进行预处理；b.碱处理：经蒸汽爆破的小麦秸秆采用无机碱进行处理，充分脱除木质素后，提取秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；c.酶水解：将秸秆纤维浸泡在缓冲液中，投加纤维素酶进行水解，使纤维浆水解为高浓度糖溶液，水解后水解液中的葡萄糖浓度约为15-60g/L；d.活性炭脱色：加入活性炭对水解后的溶液进行脱色，通过离心或压滤将水解液与剩余残渣分开，充分去除水解液中的有色物质，最终获得秸秆糖；其中：
蒸汽爆破的具体条件为：饱和蒸汽温度210-250℃，压力0.2-1.2Mpa，保温时间2-8min；碱处理的条件为：无机碱使用氢氧化钠与亚硫酸钠，氢氧化钠重量：秸秆原料绝干重为1:(5-8)，亚硫酸钠：氢氧化钠的重量比为1:(6-10)，在150-160℃反应1-3h；酶水解的具体条件为：pH 4-6，固液比1:5-1:30，单位质量纤维的酶投加量5-20FPU(滤纸酶活单位)，反应温度50-55℃，反应时间24-48h(随酶投加量而变)，振荡速率200转/分钟；活性炭脱色条件为：每百毫升水解液的活性炭投加量0.5-1.0g，脱色温度45-55℃，脱色时间20-40min；
进一步优选地，所述农业秸秆为小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆中的至少一种；
进一步优选地，所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液或同类具备缓冲效应的缓冲对，同类具备缓冲效应的缓冲对为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液等。
本发明中，碱处理可以有效去除大部分木质素，保留纤维素和绝大部分半纤维素。在高温碱性条件下，木质素可以和亚硫酸根离子发生磺化反应从而使得木质素脱落，同时去除有机酸，利于纤维素和半纤维的水解。碱处理过程中包含大量的腐殖酸，可用于后续有机肥的制作，而植物对钠离子较敏感，氢氧化钠为常用碱处理试剂，故优选为氢氧化钠和亚硫酸钾的混合溶液。活性炭可以去除纤维水解液中残留的糠醛、木质素等抑制物及一些色素，除去除率可达80％以上。本发明中，秸秆糖也可称为纤维水解脱色液，或者简称为水解液，在制备过程中为区分每一阶段得到的产物而仅在名称上加以区分。
优选地，所述步骤(2)中种子液的培养条件为：30℃恒温培养24h，振荡速率为200转/分钟；其中种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，海水晶25g/L，尿素0.7715g/L、磷酸氢二钾·3H2O 0.264g/L、MgSO4·2H2O 0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L，H3BO3 2.86mg/L、MnCl4·4H2O 1.86mg/L、ZnSO4·7H2O0.22mg/L、CuSO4·5H2O 0.08mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05mg/L；高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，保温15min。
优选地，所述步骤(3)中，木糖醇的发酵条件为：在40～45℃条件下单批次发酵或半连续发酵培养，振荡或搅拌速率为150～250转/分钟，充分曝气。
优选地，所述步骤(3)中，克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分是指木糖残糖的浓度低于1g/L。
进一步优选地，采用半连续发酵生产木糖醇时，所得种子液接入发酵培养基中培养，当菌体充分利用木糖至木糖浓度低于1g/L时，放出大部分发酵液，补加相同体积的新鲜培养基，保持罐内体积不变，一个半连续发酵周期总木糖消耗量不大于100g/L。
优选地，所述步骤(4)中，脱色过程为：每百毫升木糖醇母液的活性炭投加量为0.5-1.0g，脱色温度45-55℃，脱色时间20-40min，充分去除有色物质；采用离心或过滤方式去除木糖醇母液中的活性炭，得到木糖醇脱色液；活性炭可以去除木糖醇母液中残留的一些大分子有机色素、糠醛和木质素等，去除率可达80％以上，利于木糖醇母液的结晶纯化，所制得的木糖醇不受发酵尾液颜色的影响；
所述步骤(4)中，脱盐过程为：用强碱性阴离子树脂与强酸性阳离子树脂串联对木糖醇脱色液进行离子吸附，用去离子水洗脱，收集洗脱液料液，得到木糖醇脱色脱盐液；
其中进料量为树脂柱床体积的10倍，进料与洗脱速度为每小时1～1.5倍柱床体积；树脂串联为D202强碱性阴离子树脂和HD-8强酸性阳离子树脂串联，或者为D293强碱性阴离子树脂和HD-8强酸性阳离子树脂串联。
糖液经过阴阳离子交换柱交换后，糖液中的阳离子和阴离子杂质、一些色素、有机酸与灰分等被树脂吸附，洗脱时不会随着洗脱液流出，从而达到去除的目的。从树脂上交换进入木糖醇脱色液的氢离子和氢氧根离子结合为水。
所述步骤(4)中，蒸发浓缩条件为：用旋转蒸发仪在55℃，-0.1Mpa进行浓缩，至糖浓度为500-800g/L即可；
所述步骤(4)中，结晶与离心的过程为：浓缩后的木糖醇基本上呈膏状，温度约在60-80℃左右，采用梯度降温程序结晶，温度降至-12～-6℃时，加入0.1％木糖醇晶体作为晶种，养晶24h；结晶结束后离心分离，获得木糖醇母液，晶体用乙醇洗涤后干燥得到结晶木糖醇产品。
进一步优选地，梯度程序降温的步骤为：初始温度为60-80℃，终止温度为-12～-6℃，降温采取每小时下降1-2℃的方式，下降到3℃时，加入0.1％(w/w)的木糖醇作为晶种，在终止温度下进行养晶，养晶时间为24h。
木糖醇液之前经过微生物处理，去除了木糖、葡萄糖、半乳糖等杂糖对后期产品结晶的干扰，结晶收率与传统的含有木糖、葡萄糖、半乳糖等杂糖的产品结晶收率相似，约在50-60％，晶体的纯度在95％左右。
本发明的有益效果为：
一些微生物不具有戊糖代谢能力，以秸秆糖为碳源发酵结束后，发酵尾液中会剩余大量的戊糖(木糖、阿拉伯糖等)和一些未完全利用的无机盐与氮、磷，包括少量的葡萄糖，经过处理后可以用于培养具有戊糖代谢能力的微生物。本发明筛选到的克鲁维酵母具有高温发酵生产木糖醇的能力，可以在低成本条件下，以无木糖代谢能力微生物的秸秆糖发酵尾液为原料，高温培养克鲁维酵母获得木糖醇。本发明中木糖醇晶体采用高温发酵-活性炭脱色-树脂脱盐-浓缩-结晶的工艺流程获得，该方法的优势在于：
1)以秸秆糖发酵尾液为原料，与使用玉米芯为原料相比，大大降低生产成本，提高了农业秸秆的综合利用价值；由于克鲁维酵母代谢底物范围广，可以利用多种廉价底物；同时由于克鲁维酵母耐高温，可以进行高温发酵，在其耐热范围内能生存的微生物较少，可以降低染菌的风险，还可以降低发酵过程中设备维持低温发酵的冷却费；
2)活性炭脱色去除木糖醇母液中残留的一些大分子有机色素、糠醛和木质素等，去除率可达80％以上；
3)经过阴阳离子交换柱交换后，糖液中的阳离子和阴离子杂质、一些色素、有机酸与灰分等被树脂吸附，去除率可到90％以上；
4)浓缩时，将木糖醇母液糖浓度控制在500-800g/L，可以提高木糖醇的得率；
5)采用梯度程序降温结晶，通过终止结晶温度的控制，进一步提高了木糖醇的得率。
该方法可以摆脱木糖醇传统工业生产的条件束缚，降低木糖原料获取过程中对环境的污染和对设备的要求，同时发挥菌株高温发酵生产的优势，提高了农业秸秆的综合利用价值，同时木糖醇液之前经过微生物处理，去除了木糖、葡萄糖、半乳糖等杂糖对后期产品结晶的干扰，所得木糖醇晶体颜色纯净、晶体纯度高，克服了现有微生物发酵技术中原料来源污染大、木糖醇产品结晶不纯、颜色不正的缺点，结晶收率与传统的含有木糖、葡萄糖、半乳糖等杂糖的产品结晶收率相似，木糖醇收率为可达60％，晶体纯度95％。利用克鲁维酵母发酵生产木糖醇具有很好的前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，这些实施例仅仅用于说明本发明的内容而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明所作的各种等价形式的改动或修改，同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例用于说明克鲁维酵母的筛选纯化及鉴定方法。
申请人于2020年5月份采集海南海口红树林地区潮间带红薯植物的腐败落叶，运用下述方法分离得到12株克鲁维酵母，并筛选3株高产木糖醇的菌株。
(1)分离培养基的制备
GYPS培养基(g/L)：4葡萄糖、4YE、4蛋白胨、14琼脂、25海盐。115℃灭菌15分钟。灭菌结束后超净台内倒平板，即得克鲁维酵母的分离培养基。
(2)克鲁维酵母的分离纯化与鉴定
采集到的红树林植物腐败落叶抖去叶片上的泥沙，用75％乙醇擦拭剪刀将其剪成1cm的方形小片，用无菌海水冲洗1-2遍，平贴于GYPS平板上，再加入4mL无菌海水和少量无菌松花粉，28℃培养2-3天；挑取松花粉转接到新的GYPS平板培养基上，并在平板上进行划线分离。
观察平板上单菌落形态、大小等，显微镜下观察细胞大小、形态、繁殖方式，通过平板形态和显微形态初步鉴定，将类似克鲁维酵母的菌株筛选出来。
将初步筛选得到的菌株重新划线，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR，引物序列根据海洋真菌18S rRNA的基因保守区设计，具体为：
正向引物：5'-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3'
反向引物：5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'
反应体系如下：
Figure BDA0002854521840000071
Figure BDA0002854521840000081
扩增参数为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。采用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。跑出条带的PCR原液进行序列测定，测得菌株的18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
ACCTGCAACTCTCGTAATGTGACGGGCGGTATGTACAAAGCTGAGATTAAATTTCACCGCAACGTTCTTATTTGCGATTACTAACAATTCCATCTTCACAAAAATGAGTTGCAATTTTTGATCCGAACTAAGGCAAAGTTTTTTGTTTGCTCCGAGTTGCCTCATAGCTTCACGTTGTCTTTACCATTGTAGCACGCGTGCAGCCCAACTTATTAGGGTCATGATGATTTGACGTGATCCCCTCTTTCATCCTAATTGTCTTAGGCCATTTTGTAAACCAAAAAATGATATTTACAATGGGGGTTGCGCTCGTTAAAGGACTTAACCAGACATTTTACAACACGAGCTGACGACAACCATGCAACACCTGTTAAACAATAAAAGTCACTGTCAAAAGTTGGTAAGGTTTTCGCGTAATGTCGAATTAACCCGCATGCTCCACTGTCTTTAATCAGCTCCCGTCAATTCCTTTGAATTTCGGCCTTGCGGCGATACTCTCCAGGCGGCATGCTTAGTGTTAACTTAAACGCATAAAGACTCCTAAAAGACTTTTTGCGTTCAGCATGCATCGTTTACAGTTCAGACTACCGGGGTGTCTAATCCCGTTTGCTCCCTGAACTTTCGTTTCTCAGTGTCAGTTAAAACCAAGAGAGTTGCCTTCGCCATTGATATTCCTTCCAGAGTCAACCAATTTTAACTGTAAGCTGGAAATTCTACTCTCCTATTTAAAAACTCAAGTAACTTAGTTCTATTTATTTTGCATAGTTGAGCTATGCACTTTTATAAATAACAAAAGAAACCACCTACAAACGCTTTACGCCCAATAAATCCAAGTAATGCTTGCTCTCTACGTTTTACCGCGACTGCTGGCACGTAATTTGTCAGAACTTTTCTTTTTAGAATCATTTTTTCTAAAAATAAATGGGTTTTACAATTAAATAACAGTCATCACCCACGCAGAATTGCTGGATCAAGCTTGCGCTCATTGTCCAAGATTCCTCACTGCTGCCGAACGTCTGGACCATTCTCAATTCCAGTGTGGCAGATCGTTTTTTCAAACCTGCTAAAGATCAAAAGCTTGGTAAGCCATTACCTTACCAACAACTTATTCTTTGTTAAGCTTATCTTTCCGCTTTAAACGAAAAGGTAAATTCTTAACTATTACTCACCCGTTCGCCTAAAAATTAGAC
测序获得的所有菌株18s rDNA序列提交Genbank进行Blast同源性检测，结果表明其中十多株与克鲁维酵母的18S rDNA序列的同源性为100％，判定这些菌株属于克鲁维酵母。
(3)克鲁维酵母的培养与驯化
上述确定的克鲁维酵母使用本发明制备的秸秆糖进行培养与驯化。使用种子培养基先对克鲁维酵母进行种子液培养，随后接入含有秸秆糖的发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，在40～45℃下进行发酵，连续传代，通过测定生物量与木糖醇的含量挑选出几株最适合秸秆糖的且在高温下能进行发酵的克鲁维酵母。种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，海水晶25g/L，尿素0.7715g/L、磷酸氢二钾·3H2O 0.264g/L、MgSO4·2H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L，H3BO3 2.86mg/L、MnCl4·4H2O 1.86mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22mg/L、CuSO4·5H2O 0.08mg/L、Na2MoO4·2H2O0.39mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05mg/L；发酵培养基配方为：木糖浓度为18-30g/L的秸秆糖发酵尾液(初始浓度)、2g/L酵母粉、25g/L海盐。高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，保温15min。
上述得到的几株克鲁维酵母再用发酵尾液进行驯化。种子液的制备如前描述。测定小球藻尾液中的木糖的含量，通过旋蒸浓缩或稀释将木糖浓度调至18-30g/L，加入2g/L酵母粉，25g/L海盐，制得发酵培养基，高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，保温15min。将种子液接入含有发酵尾液的发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，在40～45℃下进行发酵，连续传代，通过测定生物量与木糖醇的含量挑选出1株最适合秸秆糖的且在高温下能进行发酵的克鲁维酵母，即为本发明保藏的菌株。
本发明的克鲁维酵母为暹罗克鲁维酵母(Kluyveromyces siamensisTHUZTY2041)，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期：2020年10月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20917。
实施例2
本实施例以谷氨酸棒状杆菌的小麦秸秆秸秆糖发酵尾液为原料生产木糖醇进行详细描述，本发明所述秸秆糖为葡萄糖和木糖的混合品。具体步骤如下：
(1)秸秆糖的制备
小麦秸秆糖的制备：将小麦秸秆原料洗净切碎，采用蒸汽爆破对小麦秸秆进行预处理，蒸汽爆破条件如下：饱和蒸汽温度为230℃，压力为0.2Mpa，保温时间为2min；经蒸汽爆破的小麦秸秆随后采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行处理，氢氧化钠重量：小麦秸秆原料绝干重为1:6，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:8，处理条件为：反应温度为150℃，时间为1h。充分脱除木质素后，提取小麦秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠(或同类具备缓冲效应的缓冲对)缓冲液中，投加纤维素酶，将纤维浆水解为高浓度糖溶液；水解条件如下：pH 5，固液比1:8，单位质量纤维的酶投加量10FPU(滤纸酶活单位)，反应温度50℃，反应时间48h，振荡速率200转/分钟；水解后，水解液中的葡萄糖浓度约为50g/L、木糖浓度为10g/L；采用离心或压滤的形式，将水解液与剩余残渣分开，每百毫升体积水解液加入0.8g活性炭，50℃、40转/分钟脱色处理20min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭，最终获得小麦秸秆秸秆糖。
(2)发酵尾液的制备收集与处理
以上述秸秆糖为碳源培养谷氨酸棒状杆菌，获得谷氨酸棒状杆菌的发酵尾液，配制克鲁维酵母发酵培养基，具体过程如下：
谷氨酸棒状杆菌种子液的制备：将谷氨酸棒状杆菌菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于30℃培养箱恒温培养，振荡速率为250转/分钟，培养3天；其中种子培养基配方：10g/L小麦秸秆秸秆糖(以制得的小麦秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，20g/L(NH4)2SO4，5g/L尿素，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.25g/L MgSO4·7H2O，10mg/L CaCl2，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·H2O，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4，0.02mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L原儿茶酸、42g/L MOPs。
谷氨酸棒状杆菌的发酵及尾液的收集：将上述所得种子液接入初始培养基中，接种量为10％(V/V)，培养温度30℃，搅拌速度为250转/分钟。当残糖浓度低于5g/L时，补加水解液，葡萄糖浓度按菌体葡萄糖消耗速率计算控制，发酵48h后补加50％的其他培养基成分，总葡萄糖消耗达120g/L时，离心固液分离，收集发酵尾液；其中初始发酵培养基配方为：10-20g/L小麦秸秆秸秆糖(以制得的小麦秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)(初始)，20g/L(NH4)2SO4，5g/L尿素，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.25g/L MgSO4·7H2O，10mg/L CaCl2，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·H2O，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuSO4，0.02mg/LNiCl2·6H2O，30mg/L原儿茶酸、42g/L MOPs。
测定发酵尾液中木糖、葡萄糖、氮、磷、木质素含量分别为26g/L、1.6g/L、400mg/L、60mg/L、87.8mg/L；无需处理，直接采用高温高压法杀灭发酵尾液中的细菌和孢子，将发酵尾液加入2g/L酵母粉和25g/L海盐制成发酵培养基；灭菌条件为115℃，保温15min。
(3)克鲁维酵母种子液的制备：将克鲁维酵母菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于30℃培养箱恒温培养，振荡速率为200转/分钟，培养24h；其中种子培养基配方：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，海水晶25g/L，尿素0.7715g/L、磷酸氢二钾·3H2O 0.264g/L、MgSO4·2H2O 0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L，H3BO3 2.86mg/L、MnCl4·4H2O 1.86mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22mg/L、CuSO4·5H2O 0.08mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05mg/L；采用高温高压法杀灭种子培养基中的细菌和孢子，灭菌条件为115℃，保温15min。
(4)发酵生产木糖醇：将上述所得种子液接入含有3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，进行单批次发酵；接种量为10％(V/V)，在42℃条件下培养，振荡(或搅拌)速率为200转/分钟，充分曝气，待克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分后(即木糖残糖量低于1g/L)，通过离心或过滤的方式去除菌体，得到木糖醇母液。
(5)木糖醇母液活性炭脱色：采用活性炭进行木糖醇母液的脱色处理，按每百毫升体积加入0.8g活性炭，50℃、40转/分钟脱色处理20min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭。
(6)木糖醇脱色液脱盐：木糖醇母液脱色后，泵入阴阳离子树脂串联柱，进行离子吸附后使用去离子水洗脱，收集洗脱液料液。其中进料量为树脂柱床体积的10倍，进料与洗脱速度为每小时1.5倍柱床体积；树脂串联为D202强碱性阴离子树脂和HD-8强酸性阳离子树脂串联。
(7)木糖醇的蒸发浓缩：将洗脱液料液在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，蒸发温度为55℃，压力为-0.1Mpa，浓缩至糖浓度为750～800g/L之间即可。
(8)木糖醇的结晶：对浓缩后的木糖醇采用梯度程序降温进行结晶，初始温度为80℃，终止温度为-8℃、降温采取每小时下降2℃，下降到3℃时，加入0.1％(w/w)的木糖醇作为晶种，在终止温度下进行养晶，养晶时间为24h。
本实施例最终获得的木糖醇收率为60％，晶体纯度为95％。
实施例3
本实施例对以小球藻的水稻秸秆秸秆糖发酵尾液为原料生产木糖醇进行详细描述，本发明所述秸秆糖为葡萄糖和木糖的混合品。具体步骤如下：
(1)秸秆糖的制备：
水稻秸秆糖的制备：将水稻秸秆原料洗净切碎，采用蒸汽爆破对水稻秸秆进行预处理，蒸汽爆破条件如下：饱和蒸汽温度为210℃，压力为1.2Mpa，保温时间为8min；经蒸汽爆破的小麦秸秆随后采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行处理，氢氧化钠重量：水稻秸秆原料绝干重为1:10，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:5，处理条件为：反应温度为160℃，时间为1h。充分脱除木质素后，提取水稻秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠(或同类具备缓冲效应的缓冲对)缓冲液中，投加纤维素酶，将纤维浆水解为高浓度糖溶液；水解条件如下：pH 5，固液比1:8，单位质量纤维的酶投加量10FPU(滤纸酶活单位)，反应温度50℃，反应时间48h，振荡速率200转/分钟；水解后，水解液中的葡萄糖浓度约为60g/L；采用离心或压滤的形式，将水解液与剩余残渣分开，每百毫升体积水解液加入0.8g活性炭，50℃、40转/分钟脱色处理20min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭，最终获得水稻秸秆秸秆糖。
(2)发酵尾液的制备收集与处理：
以上述秸秆糖为碳源培养蛋白核小球藻，获得蛋白核小球藻的发酵尾液，配制克鲁维酵母发酵培养基，具体过程如下：
蛋白核小球藻种子液的制备：将蛋白核小球藻菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于25℃培养箱恒温培养，振荡速率为120转/分钟，培养4天；其中种子培养基配方：每升基础培养基加入10g水稻秸秆秸秆糖(以制得的水稻秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)，其中基础培养基(mg/L)：771.5尿素、264磷酸氢二钾·3H2O、75MgSO4·2H2O、36CaCl2·2H2O、6柠檬酸、6柠檬酸铁铵、2.86H3BO3、1.86MnCl4·4H2O、0.22ZnSO4·7H2O、0.08CuSO4·5H2O、0.39Na2MoO4·2H2O、0.05CO(NO3)2·6H2O。
蛋白核小球藻的发酵及尾液的收集：将上述所得种子液接入初始培养基中，接种量为10％(V/V)，培养温度25℃，搅拌速度为100转/分钟。当残糖浓度低于5g/L时，补加水解液，葡萄糖浓度按菌体葡萄糖消耗速率计算控制，发酵48h后补加50％的其他培养基成分，当总葡萄糖消耗达100g/L时，离心固液分离，收集发酵尾液，其中初始发酵培养基配方为：每升基础培养基加入10-20g水稻秸秆秸秆糖(以制得的水稻秸秆秸秆糖中葡萄糖浓度计)(初始)，2g酵母粉，25g海水晶；其中基础培养基(mg/L)：771.5尿素、264磷酸氢二钾·3H2O、75MgSO4·2H2O、36CaCl2·2H2O、6柠檬酸、6柠檬酸铁铵、2.86H3BO3、1.86MnCl4·4H2O、0.22ZnSO4·7H2O、0.08CuSO4·5H2O、0.39Na2MoO4·2H2O、0.05CO(NO3)2·6H2O。
测定发酵尾液中木糖、葡萄糖、氮、磷、木质素含量分别为18g/L、0.8g/L、300mg/L、30mg/L、61mg/L；发酵尾液采用反渗透膜进行浓缩，至木糖浓度为30g/L。处理结束后加入2g/L酵母粉和25g/L海盐，采用高温高压法杀灭发酵尾液中的细菌和孢子，，制成发酵培养基；发灭菌条件为115℃，保温15min。
(3)克鲁维酵母种子液的制备：将克鲁维酵母菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于30℃培养箱恒温培养，振荡速率为200转/分钟，培养24h；其中种子培养基配方：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，海水晶25g/L，尿素0.7715g/L、磷酸氢二钾·3H2O 0.264g/L、MgSO4·2H2O 0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L，H3BO3 2.86mg/L、MnCl4·4H2O 1.86mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22mg/L、CuSO4·5H2O 0.08mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05mg/L；采用高温高压法杀灭种子培养基中的细菌和孢子，灭菌条件为115℃，保温15min。
(4)发酵生产木糖醇：将上述所得种子液接入含有3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，进行单批次发酵；接种量为10％，在45℃条件下培养，振荡(或搅拌)速率为150转/分钟，充分曝气，待克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分后(即木糖残糖量低于1g/L)，通过离心或过滤的方式去除菌体，得到木糖醇母液。
(5)木糖醇母液活性炭脱色：采用活性炭进行木糖醇母液的脱色处理，按每百毫升体积加入0.5g活性炭，55℃、40转/分钟脱色处理40min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭。
(6)木糖醇脱色液脱盐：木糖醇母液脱色后，泵入阴阳离子树脂串联柱，进行离子吸附后使用去离子水洗脱，收集洗脱液料液。其中进料量为树脂柱床体积的10倍，进料与洗脱速度为每小时1倍柱床体积；树脂串联为D293强碱性阴离子树脂和HD-8强酸性阳离子树脂串联。
(7)木糖醇的蒸发浓缩：将洗脱液料液在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，蒸发温度为55℃，压力为-0.1Mpa，浓缩至糖浓度为750～800g/L之间即可。
(8)木糖醇的结晶：对浓缩后的木糖醇采用梯度程序降温进行结晶，初始温度为60℃，终止温度为-12℃、降温采取每小时下降1-2℃，下降到3℃时，加入0.1％(w/w)的木糖醇作为晶种，在终止温度下进行养晶，养晶时间为24h。
本实施例最终获得的木糖醇收率为50％，晶体纯度为94.8％。
实施例4
本实施例对以小球藻的玉米秸秆秸秆糖发酵尾液为原料生产木糖醇进行详细描述，本发明所述秸秆糖为葡萄糖和木糖的混合品。具体步骤如下：
(1)发酵尾液的收集与处理：
玉米秸秆秸秆糖的制备：将玉米秸秆原料洗净切碎，采用蒸汽爆破对玉米秸秆进行预处理，蒸汽爆破条件如下：饱和蒸汽温度为250℃，压力为0.6Mpa，保温时间为5min；经蒸汽爆破的玉米秸秆随后采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行处理，氢氧化钠重量：玉米秸秆原料绝干重为1:8，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:8，处理条件为：反应温度为150℃，时间为2h。充分脱除木质素后，提取玉米秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠(或同类具备缓冲效应的缓冲对)缓冲液中，投加纤维素酶，将纤维浆水解为高浓度糖溶液；水解条件如下：pH 4，固液比1:5，单位质量纤维的酶投加量20FPU(滤纸酶活单位)，反应温度55℃，反应时间48h，振荡速率200转/分钟；水解后，水解液中的葡萄糖浓度约为45g/L；采用离心或压滤的形式，将水解液与剩余残渣分开，每百毫升体积水解液加入0.8g活性炭，50℃、40转/分钟脱色处理20min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭，最终获得玉米秸秆秸秆糖；
以上述秸秆糖为碳源培养蛋白核小球藻，发酵具体步骤与实施例3相同，当总葡萄糖消耗达150g/L时结束发酵，离心固液分离，收集发酵尾液，测定木糖、葡萄糖、氮、磷、木质素含量分别为29g/L、1.0g/L、220mg/L、25mg/L、60mg/L；无需处理，加入2g/L酵母粉和25g/L海盐，采用高温高压法杀灭发酵尾液中的细菌和孢子，制成发酵培养基；灭菌条件为115℃，保温15min。
(2)克鲁维酵母种子液的制备：将克鲁维酵母菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中，置于30℃培养箱恒温培养，振荡速率为200转/分钟，培养24h；其中种子培养基配方：葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，海水晶25g/L，尿素0.7715g/L、磷酸氢二钾·3H2O 0.264g/L、MgSO4·2H2O 0.075g/L、CaCl2·2H2O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L，H3BO3 2.86mg/L、MnCl4·4H2O 1.86mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22mg/L、CuSO4·5H2O 0.08mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05mg/L；采用高温高压法杀灭种子培养基中的细菌和孢子，灭菌条件为115℃，保温15min。
(3)发酵生产木糖醇：将上述所得种子液接入含有3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，进行半连续发酵；接种量为10％，在45℃条件下培养，振荡(或搅拌)速率为250转/分钟，充分曝气，待克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分后(即木糖残糖量低于1g/L)，放出2-3L发酵液，补充相同体积的新鲜培养基继续发酵。放出的发酵液通过离心或过滤的方式去除菌体，得到木糖醇母液；一个发酵周期总木糖消耗量不大于100g/L。
(4)木糖醇母液活性炭脱色：采用活性炭进行木糖醇母液的脱色处理，按每百毫升体积加入1.0g活性炭，45℃、40转/分钟脱色处理30min，采用离心或过滤的方式去除水解液中的活性炭。
(5)木糖醇脱色液脱盐：木糖醇母液脱色后，泵入阴阳离子树脂串联柱，进行离子吸附后使用去离子水洗脱，收集洗脱液料液。其中进料量为树脂柱床体积的10倍，进料与洗脱速度为每小时1.5倍柱床体积；树脂串联为D202强碱性阴离子树脂和HD-8强酸性阳离子树脂串联。
(6)木糖醇的蒸发浓缩：将洗脱液料液在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，蒸发温度为55℃，压力为-0.1Mpa，浓缩至糖浓度为750～800g/L之间即可。
(7)木糖醇的结晶：对浓缩后的木糖醇采用梯度程序降温进行结晶，初始温度为70℃，终止温度为-6℃、降温采取每小时下降1-2℃，下降到3℃时，加入0.1％(w/w)的木糖醇作为晶种，在终止温度下进行养晶，养晶时间为24h。
本实施例最终获得的木糖醇收率为58％，晶体纯度为95％。
以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
SEQ ID NO. 1
ACCTGCAACTCTCGTAATGTGACGGGCGGTATGTACAAAGCTGAGATTAA
ATTTCACCGCAACGTTCTTATTTGCGATTACTAACAATTCCATCTTCACA
AAAATGAGTTGCAATTTTTGATCCGAACTAAGGCAAAGTTTTTTGTTTGC
TCCGAGTTGCCTCATAGCTTCACGTTGTCTTTACCATTGTAGCACGCGTG
CAGCCCAACTTATTAGGGTCATGATGATTTGACGTGATCCCCTCTTTCAT
CCTAATTGTCTTAGGCCATTTTGTAAACCAAAAAATGATATTTACAATGG
GGGTTGCGCTCGTTAAAGGACTTAACCAGACATTTTACAACACGAGCTGA
CGACAACCATGCAACACCTGTTAAACAATAAAAGTCACTGTCAAAAGTTG
GTAAGGTTTTCGCGTAATGTCGAATTAACCCGCATGCTCCACTGTCTTTA
ATCAGCTCCCGTCAATTCCTTTGAATTTCGGCCTTGCGGCGATACTCTCC
AGGCGGCATGCTTAGTGTTAACTTAAACGCATAAAGACTCCTAAAAGACT
TTTTGCGTTCAGCATGCATCGTTTACAGTTCAGACTACCGGGGTGTCTAA
TCCCGTTTGCTCCCTGAACTTTCGTTTCTCAGTGTCAGTTAAAACCAAGA
GAGTTGCCTTCGCCATTGATATTCCTTCCAGAGTCAACCAATTTTAACTG
TAAGCTGGAAATTCTACTCTCCTATTTAAAAACTCAAGTAACTTAGTTCT
ATTTATTTTGCATAGTTGAGCTATGCACTTTTATAAATAACAAAAGAAAC
CACCTACAAACGCTTTACGCCCAATAAATCCAAGTAATGCTTGCTCTCTA
CGTTTTACCGCGACTGCTGGCACGTAATTTGTCAGAACTTTTCTTTTTAG
AATCATTTTTTCTAAAAATAAATGGGTTTTACAATTAAATAACAGTCATC
ACCCACGCAGAATTGCTGGATCAAGCTTGCGCTCATTGTCCAAGATTCCT
CACTGCTGCCGAACGTCTGGACCATTCTCAATTCCAGTGTGGCAGATCGT
TTTTTCAAACCTGCTAAAGATCAAAAGCTTGGTAAGCCATTACCTTACCA
ACAACTTATTCTTTGTTAAGCTTATCTTTCCGCTTTAAACGAAAAGGTAA
ATTCTTAACTATTACTCACCCGTTCGCCTAAAAATTAGAC

Claims (10)

1.一种克鲁维酵母，其特征在于所述克鲁维酵母为暹罗克鲁维酵母（Kluyveromyces siamensis THUZTY2041），保藏日期： 2020年10月19日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 20917。
2.根据权利要求1所述的克鲁维酵母，其特征在于所述克鲁维酵母为克鲁维酵母的18srDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.权利要求1所述的克鲁维酵母在生产木糖醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述克鲁维酵母以含有秸秆糖发酵尾液的培养基发酵生产木糖醇。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述克鲁维酵母通过如下步骤进行木糖醇的发酵生产：
（1）克鲁维酵母发酵培养基的制备：以秸秆糖为碳源发酵培养不具备木糖代谢能力的微生物，发酵结束后固液分离，测定尾液中木糖的浓度，根据木糖的浓度浓缩或稀释发酵尾液，使发酵尾液中木糖初始浓度为18-30 g/L，添加2 g/L酵母粉与25 g/L海盐，制得克鲁维酵母发酵发酵培养基；
（2）种子液的制备：将克鲁维酵母的菌种斜面制成菌悬液接入种子培养基中培养，制得种子液；
（3）发酵生产木糖醇：将上述所得种子液接入发酵培养基克鲁维酵母发酵培养基中，接种量为10% v/v，待克鲁维酵母充分利用发酵尾液中的糖分积累木糖醇后，离心或板框压滤去除菌体得到发酵清液，即木糖醇母液；
（4）木糖醇母液依次经脱色、脱盐、蒸发浓缩、结晶与离心，得到木糖醇产品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤（1）中，克鲁维酵母发酵发酵培养基配方为：木糖初始浓度为18-30 g/L的秸秆糖发酵尾液、2 g/L酵母粉、25 g/L海盐；灭菌条件为115℃，保温15 min；
所述发酵尾液中葡萄糖浓度不高于2 g/L、木糖浓度为28-30 g/L、氮的浓度为220-500mg/L、磷的浓度为25-60 mg/L、木质素浓度低于100 mg/L；
所述不具备木糖代谢能力的微生物为谷氨酸棒状杆菌、小球藻、酿酒酵母中的一种；
所述秸秆糖为小麦秸秆糖、玉米秸秆糖、水稻秸秆糖中的一种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤（1）中，不具备木糖代谢能力的微生物以秸秆糖为碳源，经种子培养、发酵得到秸秆糖发酵尾液，浓缩或稀释使所得秸秆糖发酵尾液中木糖初始浓度为18-30 g/L。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤（2）的培养条件为：30℃恒温培养24 h，振荡速率为200 转/分钟；其中种子培养基配方为：葡萄糖10 g/L，酵母粉2 g/L，海水晶25 g/L，尿素0.7715 g/L、 磷酸氢二钾·3H2O 0.264 g/L、MgSO4·2H2O 0.075 g/L、CaCl2·2H2O 0.036 g/L、柠檬酸 0.006 g/L、柠檬酸铁铵 0.006 g/L，H3BO3 2.86 mg/L、MnCl4·4H2O 1.86 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·2H2O0.39 mg/L、CO(NO3)2·6H2O 0.05 mg/L；高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，保温15 min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤（3）中，木糖醇的发酵条件为：在40~45℃条件下采用单批次发酵或半连续发酵培养，振荡或搅拌速率为150~250 转/分钟；
采用半连续发酵时，将种子液接入发酵培养基中培养，当菌体充分利用木糖至木糖浓度低于1 g/L时，放出大部分发酵液，补加相同体积的新鲜发酵培养基，保持罐内体积不变，一个半连续发酵周期总木糖消耗量不大于100 g/L。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤（4）中，脱色过程为：每百毫升木糖醇母液的活性炭投加量为0.5-1.0 g，脱色温度45-55℃，脱色时间20-40 min，充分去除有色物质；采用离心或过滤方式去除木糖醇母液中的活性炭，得到木糖醇脱色液；脱盐过程为：用强碱性阴离子树脂与强酸性阳离子树脂串联对木糖醇脱色液进行离子吸附，用去离子水洗脱，收集洗脱液料液，得到木糖醇脱色脱盐液，其中进料量为树脂柱床体积的10倍，进料与洗脱速度为每小时1~1.5 倍柱床体积；蒸发浓缩条件为：采用旋转蒸发仪在55℃，-0.1 Mpa进行浓缩，至糖浓度为500-800 g/L即可；结晶与离心过程为：浓缩后的木糖醇采用梯度降温程序结晶，温度降至-12～-6℃时，加入0.1%木糖醇晶体作为晶种，养晶24 h；结晶结束后离心分离，获得木糖醇母液，晶体用乙醇洗涤后干燥得到结晶木糖醇产品；
所述强碱性阴离子树脂为D202或D293强碱性阴离子树脂，所述强酸性阳离子树脂为HD-8强酸性阳离子树脂；
梯度程序降温的步骤为：初始温度为60-80℃，终止温度为-12～-6℃，降温采取每小时下降1-2℃的方式，下降到3℃时，加入0.1% w/w的木糖醇作为晶种，在终止温度下进行养晶，养晶时间为24 h。
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