CN101372700A - 从木糖母液以及生物质酸水解液中提取l-阿拉伯糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L－阿拉伯糖的方法，主要步骤如下：第一步：木糖母液和生物质预处理；第二步：培养德巴利酵母菌Y161(Debaryomyces，spp)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2480；第三步：将培养好的酵母菌接种到木糖母液或者水解液中进行培养；第四步：发酵液脱色，并将脱色后的发酵液进行离子交换；第五步：将发酵液浓缩到含糖量大于70％；第六步：加入无水乙醇和L－阿拉伯糖晶种进行结晶；第七步：用95％的乙醇洗涤晶体，干燥得到L－阿拉伯糖纯品。本发明的方法具有无污染、成本低以及耗能少的优点，适合L－阿拉伯糖的大规模工业化生产。

Description

从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的糖的提取方法，具体地，涉及一种从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法。

背景技术

L-阿拉伯糖又称果胶糖，以L-阿拉伯聚糖、L-阿拉伯-木聚糖、L-阿拉伯-半乳聚糖等半纤维素的形式大量存在于植物果浆、半纤维素、果胶酸中，很少以游离的形式存在。L-阿拉伯糖属于新型的功能性糖，目前大量研究证明它具有抑制机体肠道内蔗糖酶的活性，能够大大减低对摄入蔗糖的吸收以及减低胰岛素的分泌从而减低肥胖以及糖尿病发生，在蔗糖里添加3-4％的L-阿拉伯糖即能在食后30分钟内极显著的减低血糖的含量(Metabolism，Vol 45，No 11，1996：pp1368-1374；Journal of Nutrition，Vol 131，No 3，2001：pp796-799；Journal ofJapanese Society of Nutrition and Food Science，Vol 53，No 6,2000：pp243-247)。日前由哥本哈根大学与世界糖醇最大生产商Danisco公司联合进行的人体临床试验表明，食入含有一定量L-阿拉伯糖的富含蔗糖的饮料能极显著的降低血糖的浓度与胰岛素的分泌(The Effects of Increasing Doses of L-Arabinose in a SucroseRich Meal on Intestinal Sucrase Activity in Man，2005年9月开始进行该项试验，临床试验批准号为NCT00302302)。

除了在食品中具有重要的功能外，L-阿拉伯糖还在医药上具有重要的作用。L-阿拉伯糖可以用来合成多种核苷酸类似物等抗病毒药物，用于治疗白血病、癌症的化疗药物。由韩国Bukwang公司研发的抗乙肝病毒新药克拉夫定(Clevudine，1-(2-fluoro-5-methyl-beta-L-arabino-furanosyl)uracil，2′-氟代-5-甲基-β-L-阿糖呋喃糖基尿嘧啶，L-FMAU)的合成即用到L-阿拉伯糖(Antivir Ther，Vol 3(suppl 3)，1998：pp 113-121；Journal of Medical Chemestry，Vol 40，1997：pp2750-2754)。L-FMAU能够大大减低乙肝病毒在体内的水平。L-FMAU作为抗乙肝病毒新药已经在世界范围内申请了专利保护(中国专利号CN03821877.1、国际公布W02004/006843)。除了L-FMAU外，目前已经合成了许多含阿糖的衍生物均表现出很好的抗病毒能力，比如衍生物2’-deoxy-2’-fluoro-β-L-arabinofuranosylcytosine(L-FAC)、5-iodocytosine衍生物(L-FIAC)、9-(2-deoxy-2-fluoro-β-L-arabinofuranosyl)purine等都被证明具有很好的抗乙肝病毒的活性(Journal of Medical Chemestry，Vol 40，1997：pp 2750-2754)。含L-阿拉伯糖的核苷类似物除了具有良好的抗乙肝病毒活性外，还具有良好的抗EB病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒的活性(Journal of Medical chemistry，Vol 43，No 13，2000：pp 2538-2546；Journal of Agricuture Food Chemistry，Vol 55，No 25，2007：pp10194-10199)。L-核糖也是一种重要的医药中间体，可以由L-阿拉伯糖在含钼化合物(MoO₃、H₂MoO₄，(NH4)₂MoO₄等)的催化下异构合成(专利WO/2000/029417、Organic Letters，Vol 1，No 10，1999：pp 1517-1519)。

经对现有技术文献的检索发现，美国专利US4816078(1989年公开)与US6506897(2003年公开)描述了从甜菜粕中分别采用碱提取含阿拉伯聚糖的半纤维素，然后采用稀酸水解半纤维素的方法使得L-阿拉伯糖游离出来。在前者的实施例一中采用氢氧化钙在高温下(140℃)将含阿拉伯糖的半纤维素溶出，用硫酸中和，浓缩到含干物质45％，再通过钙离子螯合的阳离子吸附树脂将阿拉伯聚糖分离出来，再用硫酸将阿拉伯聚糖水解，再用碳酸钙中和，过滤，再将澄清的滤液浓缩到含干物质45％，再通过钙离子螯合的阳离子吸附树脂将L-阿拉伯糖分离，进一步浓缩，结晶干燥得到纯度95％的L-阿拉伯糖。后者的实施例一中采用的方法基本与前者相同，只是碱提取阿拉伯聚糖的温度为100℃而不是140℃，采用的吸附树脂为钠型而不是钙型。该方法都需要经过水解的方法，由于水解除了游离出L-阿拉伯糖外还有很多其它的单糖(比如葡萄糖、半乳糖、木糖等)也游离出来，采用色谱分离具有难度大，需要经过几步色谱分离才能将L-阿拉伯糖与其它单糖分离开来使得生产成本高。

英国专利GB2408262(2005年公开)描述了另一种从甜菜粕中提取L-阿拉伯糖的方法，同样用氢氧化钙进行高温蒸煮，得到含阿拉伯聚糖的碱液，再通入CO₂生成碳酸钙沉淀，过滤去除不溶性盐以及杂质并浓缩，加入硫酸水解该阿拉伯聚糖，超滤并中和，再通过阴阳离子交换去除离子，结晶，可得到纯度97％以上的L-阿拉伯糖。该方法虽然不用色谱分离，但对碱提取的要求高，若控制不当，除了阿拉伯聚糖被提取外，阿拉伯木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖也会被提取，影响后续酸水解L-阿拉伯糖的纯度，进而影响产品的纯度。

上述方法都需要分别采用碱液蒸煮以及硫酸水解，耗能大，污染大，不适合大规模工业化生产。

由日本三和兴产株式会社申请的中国发明专利CN99805686.3(2001年公开)公布了一种只采用酸水解的方法，使植物纤维与酸接触，使包含于植物纤维中的L-阿拉伯糖在选择性条件下水解释放。但在实施例中，除了L-阿拉伯糖被游离释放外，尚有含量为L-阿拉伯糖10-80％的木糖被游离释放。在0.05N的硫酸水解条件下，虽然水解游离出的L-阿拉伯糖要远大于木糖，但在这样低的酸浓度下水解效率很低，但当将硫酸浓度提高到0.2N以上时有约超过L-阿拉伯糖含量10％以上的木糖也游离释放出来。在实际生产时较难控制酸的浓度与水解时间，而且要得到高纯度的L-阿拉伯糖，同样需要经过色谱分离的方法，大大增加了生产成本。

上面所述方法都需要采用高温水解的方法来游离释放L-阿拉伯糖，需要消耗大量的能源，而采用酶水解的方法则不需要。由日本尤尼蒂卡株式会社申请的中国发明专利CN01800804.6(2002年公开)公布了一种采用酶处理阿拉伯聚糖、阿拉伯-木聚糖以及阿拉伯-半乳聚糖的方法，采用果胶酶、纤维素酶或者蔗糖酶将含有上述聚糖的果渣、甜菜粕、玉米粕等废弃物酶解，使L-阿拉伯糖从中游离释放出来。但是该方法存在酶的成本高以及酶水解的效率低下的缺点，而且酶解过程中木糖与葡萄糖也会同时被酶解释放出来，后续分离纯化比较困难，难以工业化生产。

中国发明专利CN200710119843.3(2008年公开)公布了一种采用淀粉酶处理、酸水解以及酵母发酵相结合的方法从玉米皮中提取L-阿拉伯糖的方法。该方法先用淀粉酶将玉米皮中的含有的淀粉水解以去除大部分葡萄糖，再采用1-5％的硫酸、盐酸或者乙酸水解淀粉酶处理过的玉米皮，再中和以及通过离子交换柱去除离子，再在上述水解液中接种面包酵母或者啤酒酵母将木糖、葡萄糖以及半乳糖等杂糖消耗，结晶得到纯度97％以上的L-阿拉伯糖。该方法由于需要采用淀粉酶预先处理，增加了操作步骤与生产成本，而且水解后存在一定量的木糖，所使用的面包酵母或者啤酒酵母本身不能代谢消耗木糖。但是，该发明中并没有注明所使用的面包或者啤酒酵母是否为能代谢木糖的基因工程面包酵母。

总之，依靠现有技术来生产L-阿拉伯糖都存在生产成本过高，对环境不友好以及提取纯度不高的缺点，因此开发一种经济高效的提取方法对降低生产成本非常重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法。本发明的方法通过特定酵母消耗除L-阿拉伯糖以外的杂糖，从木糖母液以及生物质酸水解液中高效提取L-阿拉伯糖。本发明的提取方法无污染、生产成本低，适合工业规模化生产的从生产木糖的木糖母液以及生物质酸水解液中分离提取L-阿拉伯糖。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明菌株的获得：本发明所用的酵母菌菌株由酵母菌菌种库中经过筛选分离并经过驯化而得到。分离方法为：将保存在石蜡油里面的酵母菌先接种到YPD固体平板上活化，然后逐一接种含1％木糖的YNB、1％L-阿拉伯糖的YNB、1％半乳糖的YNB、1％木糖醇的YNB固体平板上，得到一株除了不能在含1％L-阿拉伯糖的YNB上生长但能在其它三种培养基上旺盛生长的酵母Y161，经鉴定为微生物菌株德巴利酵母属(Debaryomyces，spp)的酵母。

本发明包括以下步骤：

第一步、木糖母液和生物质的预处理：

(1)木糖母液的预处理：将木糖母液用蒸馏水稀释3-10倍，加入氮源和无机盐，氮源的添加质量为稀释后木糖母液质量的0.2％到3％；无机盐的添加质量为稀释后木糖母液质量的0.05％到0.3％；

(2)生物质的预处理：将生物质用体积百分比为0.5％-4％的酸液进行水解；将水解液中和至pH4.5-6.0，收集上清液；将上清液通过离子交换树脂以脱除水解液里的阴阳离子；然后将脱除离子后的水解液浓缩至折光率大于15；加入氮源和无机盐，氮源的添加质量为生物质酸水解液质量的0.2％到3％；无机盐的添加质量为生物质酸水解液质量的0.05％到0.3％；

第二步、将经过预处理的木糖母液和生物质酸水解液进行蒸汽湿热灭菌制成无菌培养基；

第三步、制备酵母一级种子液：将保存在试管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480细胞接种到液体发酵培养基的试管中，在26-36℃下进行培养，按照150-350rpm的搅拌速度，培养12-36小时；

第四步、制备酵母二级种子液：将一级种子液全部加入到含一定量液体发酵培养基的500ml摇瓶中，接种量按照5-20％的比率。培养条件同第三步；

第五步、制备酵母三级种子液：将二级种子液全部加入到含一定量的液体发酵培养基的2000ml的摇瓶中，接种量按照5-20％的比率。培养条件同第三步；

第六步、将第五步中制备的酵母三级种子液接种到第二步中得到的无菌发酵培养基中发酵培养，酵母三级种子液的接种量按照体积比为5-20％，发酵温度为25-35℃，发酵时间为36-120小时，发酵搅拌电机转速在100转/分-600转/分；发酵过程中每间隔一定时间取样并且检测发酵液里各种糖的含量与相对纯度，当L-阿拉伯糖的相对纯度大于80％时即可停止发酵；

第七步、发酵结束后去除酵母菌，发酵上清液进行活性炭或者大孔树脂进行脱色、离子交换树脂进行脱盐、浓缩处理，得到澄清无色的发酵液；

第八步、在净化后的发酵液中加入无水乙醇，加入无水乙醇的体积为净化后发酵液体积的2-8倍，再加入L-阿拉伯糖晶种后在4℃-30℃下结晶，L-阿拉伯糖晶种的添加质量为净化后发酵液的质量的10％；

第九步、将含晶悬液离心，用体积百分比为95％的乙醇洗涤晶体，干燥后得到L-阿拉伯糖晶体。

所述第一步中的木糖母液用蒸馏水稀释是指：为了提高酵母的发酵效率，使得酵母能在最少的时间内将除L-阿拉伯糖以外的单糖代谢，需要对木糖母液进行一定倍数的稀释，本发明优选对木糖母液稀释4-6倍。如果稀释倍数过低，酵母发酵时间长，而且杂糖代谢不完全；稀释倍数过高，虽然能减少发酵时间，杂糖代谢完全，但是增加了后续浓缩的倍数，增加了能源的消耗。

所述第一步中的氮源为酵母粉、酵母膏、酵母抽提物、豆饼粉、玉米浆、棉籽粉、硫酸铵、尿素。但是由于酵母膏与玉米浆颜色深而且本身除了含有氮源外还含有很多其它杂质，而且粘度大增加了操作的难度，增加了后续分离纯化的负荷。在本发明中优选酵母粉、酵母抽提物、豆饼粉以及棉籽粉添加适量的硫酸铵。

所述第一步中的无机盐为硫酸镁以及磷酸氢二钾，其中硫酸镁的添加质量为生物质酸水解液质量的0.01-0.04％，磷酸氢二钾的添加质量为生物质酸水解液质量的0.05-0.2％。

所述第一步中的生物质包括玉米皮、麦麸、玉米芯、甘蔗渣、稻壳、棉籽壳、甜菜粕、酒糟等富含阿拉伯聚糖任何植物纤维。由于玉米皮、甜菜粕、稻壳中阿拉伯聚糖含量比较高(可以达到15％以上)，所以优选玉米皮、甜菜粕与稻壳，而且这些原料来源广泛。先将上述生物质用清水洗净除去表面的灰分，用0.2％的硫酸在115℃条件下预水解60分钟，放出预水解液。然后在2％的硫酸或者盐酸在120℃条件下继续水解2小时，将水解液中和至pH4.5以上。过滤得到透明淡黄色的水解液。对于玉米芯、甘蔗渣、酒糟等预水解是必需的，能够降低后续水解液的杂质的成分含量，提高后续发酵的效率。

所述第一步中的离子交换树脂为钠型离子交换树脂，可以交换去除水解液中绝大部分钙离子，因为采用的中和剂是氧化钙，中和后钙离子在水解液中的含量达到饱和，大量的钙离子存在会严重抑制酵母的发酵效率，所以必须经过离子交换将大部分钙离子去除。经过一步钠型阳离子交换树脂去除钙离子，可以再经过阴离子交换树脂去除硫酸根离子。

所述第一步中的氮源可以是单一的氮源，也可以是两种以上的氮源的混合，比如同时添加酵母粉和棉籽粉、同时添加酵母粉、豆饼粉和硫酸铵，也可以只添加酵母粉，但是混合氮源的发酵效果要好于单一氮源。混合氮源的质量比为：酵母粉和棉籽粉的质量比为1：1；酵母粉、豆饼粉和硫酸铵的质量为1：1：0.2。

所述第一步中的无机盐是指硫酸镁与磷酸二氢钾，其含量分别是0.02％与0.2％。

所述第二步中的灭菌方法采用蒸汽湿热灭菌，在108℃下灭菌20分钟，不宜采用115℃以上的温度，否则含高浓度糖的发酵液容易焦化，影响酵母发酵效率。

所述第七步中的离心是指发酵结束后采用小型压滤机将酵母细胞过滤或者采用低速离心(4000rpm)将酵母细胞离心下来。在澄清的发酵液中加入粉末型活性炭或者将发酵液通入脱色树脂进行脱色。所用的脱色树脂的型号为D301(山东东大化工股份有限公司生产)，脱色树脂的参数为：直径为4cm，高度为60cm，其中柱床高50cm，流速控制在每分钟100毫升以内。采用活性炭脱色时，在澄清发酵液中加入质量百分比为2-5％的粉末型活性炭，在90℃下以150转速搅拌，脱色60-120分钟。再将脱色好的发酵液经过阳离子-阴离子-阳离子交换树脂，直到电导率低于20μs/cm。再浓缩到折光率为60％以上。加入2-8倍的无水乙醇，充分混匀，再加入质量百分比为5-10％的L-阿拉伯糖晶种，缓慢搅拌，在4-30℃下结晶20-30小时。离心分离晶体，加入2倍质量的体积百分比为95％的乙醇洗涤2-3次，干燥晶体，得到纯度大于98％的L-阿拉伯糖白色粉末晶体。

本发明所述的一种消耗杂糖的酵母菌株CGMCC 2480的生物学特性如下：

1、形态特征：该菌株为细胞圆形或卵圆形，出芽生殖。

2、培养特征：该菌株在YPD培养基上培养形成菌落，菌落圆形，边缘光滑，乳白色，表面微湿润。

3、菌株的生理生化特性：能利用葡萄糖，半乳糖、木糖，木糖醇，山梨醇，甘露醇，不利用L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇。最适培养温度为30-34℃，最适生长pH值为5.0-7.5。

4、菌株具有良好的稳定性：将该菌株置于-20℃含30％的甘油中保存，传代20次以上后仍然保持菌株的活性稳定。

本发明选用消耗杂糖的酵母菌株，通过发酵培养可以将木糖母液或者生物质酸水解液中除L-阿拉伯糖以外的其它糖类代谢消耗，从而达到从木糖母液和生物质酸水解液中高效提取L-阿拉伯糖的目的。本发明所利用的酵母菌能利用由木糖转变而成的木糖醇，能将98％以上的木糖醇代谢消耗。除了能高效的利用母液或者水解液里的木糖醇外，该酵母菌株还能高效利用半乳糖以及甘露糖。发酵结束后其它杂糖的含量少于10％。同时，该酵母菌株虽然也能将部分L-阿拉伯糖转变为L-阿拉伯糖醇，但是转变的量很少，小于5％，对后续分离纯化影响很小。而且该酵母的耐受性好，木糖母液不需要经过脱色以及脱毒前处理即能直接用水稀释一定倍数进行发酵，而不会影响其生长与发酵的效率。本发明所的提取L-阿拉伯糖的方法不需要用到层析的步骤即能制备纯度大于98％的L-阿拉伯糖，大大减少了分离纯化的成本与步骤。采用本发明提供的方法尤其是从木糖母液中提取L-阿拉伯糖的方法，耗能少，污染低，能够变废为宝，很好的解决了目前困扰木糖生产厂家木糖母液处理的问题。

本发明所使用的菌株为：

菌株分类命名：德巴利酵母(Debaryomyces，spp)，

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，

保藏日期：2008年5月4日，

保藏号：CGMCC 2480。

附图说明

图1发酵前木糖母液的HPLC分析图。

图2从木糖母液发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖晶体的HPLC分析图。

图3木糖母液发酵后的HPLC分析图。

图4生物质酸水解液发酵后的HPLC分析图。

图5从生物质酸水解液中分离纯化的L-阿拉伯糖晶体的HPLC分析图。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

量取1000ml木糖母液(来自山东福田药业有限公司)，此母液为用玉米芯水解液结晶木糖后残留下的淡褐色粘稠液体，该母液含有木糖50-70％，L-阿拉伯糖15-20％，葡萄糖10-15％，半乳糖3-8％以及7％以下的其它杂糖(均按干物质的质量百分比计)，该母液的HPLC分析如图1所示：木糖母液里面的成分很复杂，其中木糖占50％以上，L-阿拉伯糖占20％左右，葡萄糖占15％左右，半乳糖占10％左右。加入质量百分比为1％的酵母粉(OXOID公司生产)、质量百分比为0.01％的无水硫酸镁和质量百分比为0.1％的磷酸二氢钾，用去离子水稀释到2.7L(母液稀释3倍)，充分溶解，转入10L的发酵罐，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌20分钟。将保存在试管斜面上的德巴利酵母CGMCC 2480接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在26℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养24小时得到一级种子液；将一级种子液5ml全部加入到含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在32℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；将二级种子液60ml全部加入到含300ml发酵培养基的2000ml的摇瓶中，在30℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养24小时得到三级种子液；再将此三级种子液按照10％的体积比全部接种到发酵罐中进行发酵，在32℃，300rpm条件下发酵120小时。离心分离酵母菌体，在澄清发酵液中加入粉末活性炭30克，80℃脱色60分钟，转速为150转/分，滤布过滤除去活性炭，重复脱色3次。无色的发酵液再进行离子交换处理：依次通过D001型阳离子交换柱，D201型阴离子交换柱以及D001型阳离子交换柱，滤液通过交换柱的流速为每分钟100毫升。检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于20μs/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓缩到原来体积的三分之一，加入6倍体积的无水乙醇，缓慢加入L-阿拉伯糖含量的10％的L-阿拉伯糖种晶(此处加入10克晶种)，然后，轻轻搅拌，20℃放置24小时充分结晶，离心得到白色晶体，再用体积比为95％的乙醇洗涤二次，然后干燥，称重得到78克干燥的L-阿拉伯糖晶体。经HPLC分析，结果如图2所示：从木糖母液发酵液中分离纯化的L-阿拉伯糖晶体的HPLC的纯度可以达到98％。

实施例2

量取1000ml木糖母液(来自山东福田药业有限公司)，加入质量百分比为0.1％的酵母粉(OXOID公司生产)、0.1％豆饼粉以及0.01％无水硫酸镁与0.04％磷酸二氢钾，用去离子水稀释到4500ml(母液稀释5倍)，充分溶解，转入10升的发酵罐，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌30分钟。将保存在试管斜面的上的德巴利酵母CGMCC 2480接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在36℃下进行培养，按照150rpm的搅拌速度，培养12小时得到一级种子液；将一级种子液2.5ml全部加入到含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在35℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；将二级种子液25ml全部加入到含500ml发酵培养基的2000ml的摇瓶中，在35℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养24小时得到三级种子液；再将此三级种子液按照5％的体积比全部接种到发酵罐中进行发酵，在35℃，600rpm条件下发酵48小时，此时对发酵液进行HPLC分析检测L-阿拉伯糖的纯度，结果如图3所示：木糖母液经过酵母Y161发酵36-120小时后，发酵液里L-阿拉伯糖占绝大多数，纯度可以达到总糖的95％以上，L-阿拉伯糖的保留时间为10.898min。。离心分离酵母菌体，在澄清发酵液中加入粉末活性炭30克，80℃脱色60分钟，转速为150转/分，滤布过滤除去活性炭，重复脱色3次。无色的发酵液再进行离子交换处理：依次通过D001型阳离子交换柱，D201型阴离子交换柱以及D001型阳离子交换柱(山东大大化工股份有限公司生产)，滤液通过交换柱的流速为每分钟100毫升。检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于10μs/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓缩到原来体积的五分之一，加入2倍体积的无水乙醇，缓慢加入10克L-阿拉伯糖晶种，然后，轻轻搅拌，30℃放置24小时充分结晶，离心得到白色晶体，再用95％乙醇洗涤二次，然后干燥，得到88克干燥的L-阿拉伯糖晶体。经HPLC分析，结果如图2所示：此晶体中L-阿拉伯糖的纯度在98％以上。

实施例3

量取700ml木糖母液(来自山东昌邑佳和糖业有限公司)，此母液为用玉米芯水解液结晶木糖后残留下的深褐色粘稠液体，该母液含有木糖45-70％，L-阿拉伯糖10-20％，葡萄糖10-20％，半乳糖3-8％以及7％以下的其它杂糖(均按干物质质量百分比计)。加入质量百分比为3％的酵母粉(湖北安琪股份有限公司生产)以及0.1％无水硫酸镁与0.2％磷酸二氢钾，用去离子水稀释到6.3升(母液稀释10倍)，充分溶解，转入10升的发酵罐，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌20分钟。将保存在试管斜面的上的德巴利酵母CGMCC 2480接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在30℃下进行培养，按照350rpm的搅拌速度，培养36小时得到一级种子液；将一级种子液10ml全部加入到含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在28℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；将二级种子液50ml全部加入到含350ml发酵培养基的2000ml的摇瓶中，共两瓶700ml种子液，在28℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养24小时得到三级种子液；再将此三级种子液按照20％的体积比全部接种到发酵罐中进行发酵，在25℃，100转电机搅拌条件下发酵36小时。离心分离酵母菌体，在澄清发酵液中加入粉末活性炭50克，80℃脱色60分钟，转速为150转/分，滤布过滤除去活性炭，再将活性炭脱色液经过D301脱色树脂进一步脱色。无色的发酵液再进行离子交换处理：依次通过001^*7型阳离子交换柱，201^*7型阴离子交换柱以及001^*7型阳离子交换柱(上海树脂厂有限公司生产)，滤液通过交换柱的流速为每分钟100毫升。检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于10μs/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓缩到原来体积的十分之一，加入8倍体积的无水乙醇，缓慢加入15克晶种，然后，轻轻搅拌，4℃放置24小时充分结晶，离心得到白色晶体，再用95％乙醇洗涤二次，然后干燥，得到57克干燥的L-阿拉伯糖晶体。经HPLC分析，此晶体中L-阿拉伯糖的纯度在98％以上。

实施例4

量取500ml木糖母液(来自吉林江南糖醇有限公司)，此母液为用玉米芯水解液结晶木糖后残留下的深褐色粘稠液体，该母液含有木糖50-75％，L-阿拉伯糖10-20％，葡萄糖10-20％，半乳糖3-8％以及7％以下的其它杂糖(均按干物质质量百分比计)。加入质量百分比为1.0％的酵母粉(湖北安琪股份有限公司生产)、0.5％棉籽粉以及0.02％无水硫酸镁与0.2％磷酸二氢钠，用去离子水稀释到6.75升(母液稀释15倍)，充分溶解，转入10升的发酵罐，离位灭菌，灭菌条件为115℃下灭菌30分钟。将保存在试管斜面的上的德巴利酵母CGMCC2480接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在32℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养24小时得到一级种子液；将一级种子液5ml全部加入到含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在32℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；将二级种子液50ml全部加入到含375ml发酵培养基的2000ml的摇瓶中，共两瓶750ml种子液，在32℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养24小时得到三级种子液；再将此三级种子液按照10％的体积比全部接种到发酵罐中进行发酵，在32℃，400转电机搅拌条件下发酵36小时。下面的分离纯化过程同实施例3，得到47克干燥的L-阿拉伯糖晶体。经HPLC分析，此晶体中L-阿拉伯糖的纯度在98％以上。

实施例5

称取200克干酒糟，用自来水洗净灰尘与杂质，将水滤干，加入1200ml 0.2％浓度的硫酸在115℃预水解60分钟(在高压灭菌器中水解)，去除水解液，在预水解过的酒糟中加入800ml的体积比为2％的硫酸，在120℃下水解120分钟。压滤得到淡黄色的水解液1000ml。将水解液用CaO中和至pH4.5以上，过滤除去沉淀得到澄清的水解液。将水解液通过Na型阳离子交换柱(D001)和钠型离子交换树脂(FDL-18)(山东东大化工股份有限公司生产)除去绝大多数Ca²⁺离子，再通过Cl型阴离子交换柱将SO₄ ^2-离子除去。所用的离子交换柱的参数为：直径为4cm，高为60cm，流速每分钟50毫升。浓缩过程中不断取样并且使用折光仪(阿贝折光仪，上海光学仪器五厂生产)测量折光率，浓缩至折光率为20％。得到200ml浓缩的水解液，折光率为21.45％。在此水解液中加入质量百分比为1.5％的酵母粉(安琪酵母)、0.02％的硫酸镁以及0.1％的磷酸二氢钾，充分混匀溶解，115℃下灭菌20分钟。将保存在试管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在28℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养24小时得到一级种子液；将一级种子液5ml全部加入到含50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在28℃下进行培养，按照250rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；取50ml二级种子液加入到上述灭菌的发酵培养基中。此处发酵培养基的成分为：折光率为20％的水解液100毫升，加入1克酵母粉(安琪酵母)，0.01％硫酸镁，0.2％磷酸二氢钾，溶解，灭菌。在250rpm，32℃下发酵培养60小时，离心分离酵母菌得到澄清的发酵液。加入5克粉末活性炭，在85℃下搅拌脱色(100rpm)60分钟，重复直到发酵液颜色基本无色或者淡黄色。再经过D001、D201以及D001离子交换树脂去除盐离子得到洁净的发酵液，浓缩到折光率70％，加入5倍体积的无水乙醇，混匀，然后加入1克L-阿拉伯糖晶种，混匀，在4℃下结晶。离心分离晶体，用体积百分比为95％的乙醇洗涤一次，干燥得到5.7克L-阿拉伯糖白色粉末结晶。

实施例6

称取200克干甘蔗渣，用自来水洗净灰尘与杂质，将水滤干，加入1200ml体积百分比为0.5％的盐酸溶液，在115℃下预水解60分钟(在高压灭菌器中水解)，去除水解液，加入800ml体积百分比为1.5％的盐酸溶液，在120℃下水解120分钟。压滤得到淡黄色的水解液1000ml。将水解液用CaO中和至pH5.0以上，过滤除去沉淀得到澄清的水解液。将水解液通过Na型阳离子交换柱(D001)和钠型离子交换树脂(FDL-18)(山东东大化工股份有限公司生产)除去绝大多数Ca²⁺离子，再通过Cl型阴离子交换柱将SO₄ ^2-离子除去。所用的离子交换柱的参数为：直径为4cm，高为60cm，流速每分钟50毫升。浓缩过程中不断取样并且使用折光仪(阿贝折光仪，上海光学仪器五厂生产)测量折光率，浓缩至折光率为20％。得到200ml浓缩的水解液，折光率为21.45％。在此水解液中加入质量百分比为0.1％的酵母粉(OXOID公司生产)、0.1％豆饼粉、0.01％无水硫酸镁与0.04％磷酸二氢钾，充分混匀溶解，115℃下灭菌20分钟。下面的步骤同实施例5。干燥得到11.6克L-阿拉伯糖白色粉末结晶。

实施例7

称取200克干玉米芯，用自来水洗净灰尘与杂质，将水抽滤干，加入1200ml体积百分比为4％的硫酸溶液，在115℃下预水解60分钟(在高压灭菌器中水解)，去除淡黄色水解液，再用清水洗涤一次，抽滤干水分。在加入800ml体积百分比为2％的盐酸溶液，在120℃下水解120分钟。压滤得到淡黄色的水解液750ml。将水解液用CaO中和至pH6.0以上，过滤除去沉淀得到澄清的水解液。将水解液通过Na型阳离子交换柱(D001)和钠型离子交换树脂(FDL-18)(山东东大化工股份有限公司生产)除去绝大多数Ca²⁺离子，再通过Cl型阴离子交换柱将SO₄ ^2-离子除去。所用的离子交换柱的参数为：直径为4cm，高为60cm，流速每分钟50毫升。浓缩过程中不断取样并且使用折光仪(阿贝折光仪，上海光学仪器五厂生产)测量折光率，浓缩至折光率为20％。得到200ml浓缩的水解液，折光率为21.45％。在此水解液中加入质量百分比为1.5％的酵母粉(安琪酵母)、0.1％无水硫酸镁与0.2％磷酸二氢钾，充分混匀溶解，115℃下灭菌20分钟。下面的步骤同实施例5。水解液发酵结束后取样HPLC分析其L-阿拉伯糖的纯度，结果如图4所示：玉米芯水解液经过酵母Y161发酵36-120小时后，发酵液里L-阿拉伯糖占绝大多数，纯度可以达到总糖的90％以上。干燥得到9.6克L-阿拉伯糖白色粉末结晶，HPLC分析其纯度，结果如图5所示：从玉米芯水解液中分离纯化的L-阿拉伯糖晶体的HPLC的纯度可以达到99％。。

实施例8

称取200克干玉米皮，加入1500ml体积百分比为1％的盐酸溶液，在120℃下水解120分钟。压滤得到淡黄色的水解液1200ml。下面的中和、脱色、发酵与纯化步骤同实施例5。干燥得到17.5克L-阿拉伯糖白色粉末结晶。

Claims (9)

1.一种从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、木糖母液和生物质的预处理：

(1)木糖母液的预处理：将木糖母液用蒸馏水稀释3-10倍，加入氮源和无机盐，氮源的添加质量为稀释后木糖母液质量的0.2％到3％，无机盐的添加质量为稀释后木糖母液质量的0.05％到0.3％；

(2)生物质的预处理：将生物质用体积百分比为0.5％-4％的酸液进行水解，将水解液中和至pH4.5-6.0，收集上清液，将上清液通过离子交换树脂以脱除水解液里的阴阳离子，然后将脱除离子后的水解液浓缩至折光率大于15，加入氮源和无机盐，氮源的添加质量为生物质酸水解液质量的0.2％到3％，无机盐的添加质量为生物质酸水解液质量的0.05％到0.3％；

第二步、将经过预处理的木糖母液和生物质酸水解液进行蒸汽湿热灭菌制成无菌培养基；

第三步、制备酵母一级种子液：将保存在试管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480细胞接种到液体发酵培养基的试管中，在26-36℃下进行培养，按照150-350rpm的搅拌速度，培养12-36小时；

第四步、制备酵母二级种子液：将一级种子液全部加入到含一定量液体发酵培养基的500ml摇瓶中，接种量按照5-20％的比率。培养条件同第三步；

第五步、制备酵母三级种子液：将二级种子液全部加入到含一定量的液体发酵培养基的2000ml的摇瓶中，接种量按照5-20％的比率，培养条件同第三步；

第六步、将第五步中制备的酵母三级种子液接种到第二步中得到的无菌发酵培养基中发酵培养，酵母三级种子液的接种量按照体积比为5-20％，发酵温度为25-35℃，发酵时间为36-120小时，发酵搅拌电机转速在100转/分-600转/分，发酵过程中每间隔一定时间取样并且检测发酵液里各种糖的含量与相对纯度，当L-阿拉伯糖的相对纯度大于80％时即可停止发酵；

第七步、发酵结束后去除酵母菌，发酵上清液进行活性炭或者大孔树脂进行脱色、离子交换树脂进行脱盐、浓缩处理，得到澄清无色的发酵液；

第八步、在净化后的发酵液中加入无水乙醇，加入无水乙醇的体积为净化后发酵液体积的2-8倍，再加入L-阿拉伯糖晶种后在4℃-30℃下结晶，L-阿拉伯糖晶种的添加质量为净化后发酵液的质量的10％；

第九步、将含晶悬液离心，用体积百分比为95％的乙醇洗涤晶体，干燥后得到L-阿拉伯糖晶体。

2.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述生物质包括玉米皮、麦麸、玉米芯、甘蔗渣、稻壳、棉籽壳、甜菜粕、酒糟等富含阿拉伯聚糖的植物纤维。

3.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第一步中的氮源选自酵母膏、酵母粉、酵母抽提物、玉米浆、大豆饼粉、棉籽粉，硫酸铵、尿素中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第一步中的无机盐选自无水硫酸镁、七水硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的至少一种。

5.根据权利要求1或4所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第一步中的无机盐为硫酸镁和磷酸氢二钾，其中硫酸镁的添加质量为生物质酸水解液质量的0.01-0.04％，磷酸氢二钾的添加质量为生物质酸水解液质量的0.05-0.2％。

6.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第二步中的灭菌方法为蒸汽湿热灭菌，在108℃下灭菌20分钟。

7.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第一步中的离子交换树脂为钠型离子交换树脂。

8.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第七步中采用脱色树脂进行脱色，脱色树脂的参数为：直径为4cm，高度为60cm，其中柱床高50cm，流速控制在每分钟100毫升以内。

9.根据权利要求1所述的从木糖母液以及生物质酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特征是：所述第七步中采用活性炭脱色，在澄清发酵液中加入粉末型活性炭，其质量为发酵液质量的2％-5％，在90℃下以150转速搅拌，脱色60-120分钟。

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