CN103275878B - 一种利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌株（Neurospora sitophila）YYH101，已于2013年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013234。本发明的菌株是对木糖有单一发酵生产乙醇的天然菌株，该菌株发酵20g/L的木糖时，乙醇产量可达到7.51g/L，为理论值的81.6%，能够高效地转化五碳糖为乙醇，是优良的利用木质纤维素水解液的菌株。

Description

一种利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌株
技术领域
本发明涉及一种生产乙醇的方法，尤指一种能够利用木糖发酵生产乙醇的菌株，具体地指一种发酵木糖生产乙醇的好食脉孢菌（Neurospora sitophila）YYH101。
背景技术
随着世界人口的增长，用淀粉和糖类等粮食作物生产乙醇的发展受到限制，而木质纤维素是自然界中最为丰富的可再生资源，且大部分还未能被有效利用，因此，利用木质纤维素生产乙醇是有效利用可再生清洁能源的首选。在传统的生物乙醇生产中，以葡萄糖为主的六碳糖易于被微生物发酵生成乙醇，然而占总糖量40%的木糖却不易于被其利用。因此，木糖难以发酵生产乙醇的瓶颈问题制约着燃料乙醇的工业化发展。
木质纤维素是地球上储量最丰富的多糖类物质，是植物体的重要组成成份，主要由纤维素、半纤维素、木质素组成。在半纤维素被降解后，其水解产物中，90%以上是木糖。而木糖是木质纤维素原料水解产物中的一种五碳糖，是除了葡萄糖之外来自可再生生物质资源最为丰富的单糖，木糖的有效利用是木质纤维素物质转化生产乙醇的关键环节之一。因此，筛选有效利用木糖转化生产乙醇的菌株是实现木质纤维素燃料乙醇发酵工业化的必要条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种可代谢木糖的好食脉孢菌（Neurospora sitophila）YYH101，该菌能以木糖为底物单一发酵生产乙醇。
本发明所述的好食脉孢菌（Neurospora sitophila）YYH101菌株，已于2013年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013234。
本发明菌株YYH101具有如下性质：
形态特征：本发明菌株YYH101于30℃在PDA固体培养基平板上生长，菌落最初为白色、粉粒状（见图1A），逐渐变为淡黄色、绒毛状（见图1B）。菌丝蔓延生长，透明，有横隔，多核。在气生菌丝顶端形成链状分生孢子，分生孢子形成后菌丝成为淡黄色绒毛状，孢子串生，球形或卵圆形，呈桔红或橙红色。
在扫描电子显微镜下可以更加清晰观察到本发明菌株YYH101的个体形态，在成熟后分生孢子多聚成团块，覆盖在菌落上，可见孢子表面有皱摺（见图2）。
生理生化特征见下表1：
表1本发明菌株YYH101的生理生化特征结果表
Figure GDA0000462646040000021
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
用SDS法提取本发明菌株的总DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，扩增片段测序，得到的ITS序列通过BLAST比对从GenBank搜索与该菌株比较接近的菌株，采用Clustal X软件进行序列比对，利用MEGA4.1软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。结合形态和生理生化特征的检测结果以及ITS分析确定本发明菌株的种属关系，经筛选得到的本发明菌株为脉孢真菌，通过形态观察和生理生化特征反应和ITS序列分子鉴定，确定本发明菌株为好食脉孢菌（Neurospora sitophila）一个新种，命名为好食脉孢菌（Neurospora sitophila）YYH101（见图3）。
将本发明菌株YYH101以1%-2%的接种量接入木糖基础培养基中，可发酵木糖生产乙醇。从影响本发明菌株发酵乙醇的环境因子，即木糖浓度、发酵温度、发酵时间、转速等方面研究其发酵特性，得到木糖发酵的工艺条件为：木糖浓度10-20g/L、发酵温度25-35℃、发酵时间48-96h、转速120-140r/min。以木糖为唯一碳源进行乙醇发酵正交试验，优化发酵条件，确定发酵的最佳条件为：木糖浓度为20g/L、发酵温度为25℃、发酵时间为96h、转速为140r/min。
本发明菌株YYH101是对木糖有单一发酵能力的天然菌株，不仅很好地解决了木糖不可发酵性，从而降低生物质燃料乙醇转化成本，更可以为后续在此基础上进一步优化改良高效乙醇转化菌奠定基础，为直接利木质纤维素降解产物发酵生产乙醇提供了可能性，为解决目前木质纤维素原料生产燃料乙醇过程中纤维素和半纤维素的共利用提供了技术支持。
好食脉孢菌在以往的菌种资源描述中，仅描述了其发酵豆渣和麸皮产纤维素酶的功能，但没有说明其利用木糖转化乙醇的特性。因此，该性质的发现对该微生物的应用领域有了新有研究方向。
附图说明
图1是本发明菌株在PDA固体培养基上培养的菌落特征照片。
图2是本发明菌株的扫描电镜照片。
图3是本发明菌株的ITS序列系统发育树。
具体实施方式
下面对本发明作进一步地说明。
实施例1本发明菌株的制备
取从湖南省长沙市湖南省农业科学院周边采集的土样5g装入100mL灭菌的去离子水制成菌悬液，接入到5mL灭菌的去离子水中制成菌悬液，分别按10–1、10–2、10–3、10–4、10–5进行梯度稀释，分别涂布于PDA固体培养基上，30℃恒温培养。待其长成彼此独立的菌落，挑取菌落大、生长较快的单菌落，进一步进行平板划线分离，30℃下培养1-2d，如此反复直至菌种纯化，即可得到本发明菌株。
实施例2
将本发明菌株YYH101以1%的接种量接入100mL木糖基础培养基的三角瓶中，在30℃、120r/min条件下，经发酵48h后测定发酵液中乙醇的含量和木糖的残余量。
其中：
乙醇的测定：采用SP-6890型气相色谱测定发酵液中乙醇浓度，色谱柱：PEG-20M色谱柱；载气类型：N2；载气流速：10mL/min；检测器：FID；柱温：80℃，进样器温度：180℃；检测器温度：180℃；进样量：1μL；样品处理：10000r/m，离心10min，取上清液。标准曲线：使用无水乙醇，配制0.2%、0.4%、0.8%、1.6%标准样品，1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的标准溶液，在相同条件下进样。
木糖的测定：采用离子色谱仪测定发酵液中的残糖浓度，先将发酵液在10000r/m下离心10min，取上清液，然后用超纯水将其浓度稀释到1-10mg/L，再过0.22μm尼龙滤膜，直接进样测定。
离子色谱仪测定木糖浓度条件：Carbopac PA20分析柱，脉冲安培检测器，电极：Au电极，Ag-AgCl参比电极，梯度条件l：0-15min，NaOH3mM；15-20min，NaOH3-100mM；30-40min，NaOH100mM，NaOAc100mM；40-42min，NaOH200mM；43-46min，NaOH3mM；自动进样，进样的体积为10μL。
实施例3木糖发酵工艺条件的优化
以木糖为唯一碳源，分别以最适木糖浓度、发酵温度、发酵时间和转速为影响因子，设计四因素三水平的L9（43）正交优化试验(表2)，以发酵液乙醇含量为考察指标，确定发酵的最佳条件。正交试验结果见表3，根据极差值分析，影响本发明菌株发酵性能的关系分别为A＞D＞B＞C，对乙醇生成产生影响的因素从主到次依次为木糖浓度、转速、发酵温度、发酵时间，各因子的最佳组合是A3B1C3D2。因此，最佳发酵条件为：木糖浓度20g/L，温度25℃，发酵时间96h，转速140r/min，乙醇产量可达到7.51g/L，为理论值的81.6%。
表2优化发酵条件的正交试验设计表
表3发酵条件优化的正交试验结果表
Figure GDA0000462646040000052
本说明书中提及的本发明菌株培养与发酵所用的培养基如下：
PDA固体培养基：马铃薯200g/L、蔗糖30g/L、琼脂18g/L。
木糖基础培养基：木糖20g、蛋白胨15g、酵母粉10g、NH4SO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O1g、H2O1000mL。
纤维素琼脂培养基：琼脂18g、纤维素20g、蛋白胨15g、酵母粉10g、NH4SO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O1g、H2O1000mL。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌（Neurospora sitophila）YYH101菌株，于2013年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013234。
2.权利要求1所述的菌株在发酵木糖生产乙醇中的应用。
3.一种制备发酵木糖生产乙醇的发酵液的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的菌株以1%-2%的接种量接入木糖基础培养基中发酵培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，是采用木糖作为碳源，浓度为10-20g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木糖浓度为20g/L。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述木糖基础培养基的组成：木糖20g、蛋白胨15g、酵母粉10g、NH4SO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O1g及H2O1000mL。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度25-35℃、时间48-96h、转速120-140r/min。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度为25℃、时间为96h、转速为140r/min。
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