CN108841736A - 一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用 - Google Patents

一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明以Candida glycerinogenes WL2005‑1为出发菌株，以亚硝基胍诱变，通过摇瓶发酵筛选获得乙醇高产菌株，其分类命名为Candida glycerinogenes ZG17。该菌株是具有多重耐受性，浓醪发酵乙醇产量高、转化率高的乙醇生产菌株。该菌株能够耐受600g/L葡萄糖、9g/L乙酸、4g/L糠醛、45℃高温，且可以利用甘油正常生长。利用该菌株发酵生产乙醇，乙醇产量最高达到100g/L，发酵产率最高达到3.12g/L/h，发酵周期为32h，可应用于工业生产并大幅度缩短发酵周期，提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。

Description

一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
木质纤维素预处理过程中，由于强烈的化学和物理作用，除生成糖类外还会因过度反应产生各类抑制物，对后续酶解和菌种发酵产生抑制作用。其中，乙酸和糠醛是半纤维素糖浆的毒性的重要贡献因子，并增加其它化合物的毒性。在乙酸和糠醛的胁迫下，酵母细胞的代谢过程受到强烈的抑制，生长停滞期延长，导致产物得率降低。其中糠醛作为电子受体，与乙醛进行竞争，导致乙醛积累，从而推迟乙酸和乙醇的生成，并且糠醛的存在会抑制乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱氢酶(PDH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的活性。此外，乙酸和糠醛还可以诱发酵母细胞内总活性氧(ROS)水平的大量积累，引起细胞内线粒体、空泡、肌动蛋白、染色体的损伤，从而造成细胞死亡。目前主要利用Saccharomyces cerevisiae、Zymomonasmobilis、Pichia stipitis、Canddida shehatae、Escherichia coli这几种微生物发酵木质纤维素材料水解液来生产乙醇。其中S.cerevisiae在耐受终浓度乙醇、葡萄糖转化率以及耐受抑制物方面具有的优势，使得S.cerevisiae在第二代燃料乙醇领域一直是研究的热点。不同的酿酒酵母菌株之间具有不同的乙酸和糠醛耐受能力，工业二倍体酿酒酵母的生长活力都要明显大于实验室菌株，比如在含1.75g/L甲酸、2.25g/L乙酸1.45g/L糠醛、1.9g/L 5-HMF、0.075g/L肉桂酸以及0.09g/L松柏醛的合成培养基条件下，Baker’s yeast和Y294(MATα)发酵24h后的乙醇得率分别0.42g/g和0g/g；此外有研究发现在云杉、小麦秸秆水解液中也有类似的结果。酿酒酵母一般能耐受0.5-2.0g/L的糠醛浓度。
乙酸和糠醛耐受能力的强弱，是酵母发酵木质纤维素材料生产乙醇的重要指标之一，耐受较高浓度乙酸和糠醛的乙醇生产酵母可以大大缩短细胞生长的延滞期，提前结束发酵，进而提高发酵效率和节省成本。此外，高温发酵对于乙醇生产具有重要意义，提高发酵温度可以降低设备冷却能耗，减少冷却水用量，从而有效降低乙醇生产成本。
假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2005-1)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗和高抗逆性的特点。C.glycerinogenes WL2005-1能够耐受一定浓度的乙酸和糠醛，但在高浓度乙酸、糠醛条件下，细胞生长存在较长的延滞期，从而影响菌株乙醇生产的发酵效率。因此，现在亟需一种耐受高浓度乙酸、糠醛，可用于高温发酵的酵母乙醇生产菌株。
发明内容
本发明的第一个目的是一株假丝酵母Candida glycerinogenes ZG17菌株，分类学命名为Candida glycerinogenes ZG17，已于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.15118。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株C.glycerinogenes ZG17的诱变筛选方法是：将出发菌株C.glycerinogenes WL2002-5，经亚硝基胍诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得乙醇产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出乙醇产量高的目标菌株C.glycerinogenes ZG17。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂，所述菌剂包含菌株C.glycerinogenesZG17。
本发明的第三个目的是提供一种发酵生产乙醇的方法，所述方法应用菌株C.glycerinogenes ZG17进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产乙醇的方法的具体步骤如下：
(1)将权利要求1所述菌种C.glycerinogeness ZG17接种于种子培养基中，温度为35-39℃，转速为150-200r/min的条件下培养16-20h得到种子液；
(2)将种子液按接种量5-8％接种到含有发酵培养基的发酵罐中，在温度为35-39℃，转速为100-200r/min的条件下发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中发酵罐的通气量为0.30-0.32v/v·min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中发酵罐的装液量为40-50％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的接种量为8％。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的配方按质量分数为：甘油2-3％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为水。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方按质量分数为：葡萄糖18-35％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为水。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方按质量分数为：酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为纤维素水解液。
在本发明的一种实施方式中，所述纤维素水解液的组分按质量分数为：葡萄糖18-35％，乙酸≤0.9％，糠醛≤0.4％。
本发明的有益效果：
本发明采用亚硝基胍诱变，最终筛选获得一株具有多重耐受性的乙醇高产菌株Candida glycerinogenes ZG17，该菌株能够耐受600g/L葡萄糖、9g/L乙酸、4g/L糠醛、45℃高温，且可以利用甘油正常生长。进一步克服了利用木质纤维素水解液进行发酵，发酵过程中乙酸、糠醛等有害物对菌株的毒害作用，有利于该菌株在乙醇工业生产中的应用以及降低发酵过程中冷却以及后期蒸馏所需的能耗，提高经济效益。此外，该菌株在浓醪发酵过程中乙醇产量最高达到100g/L，发酵产率最高达到3.12g/L/h，发酵周期为32h。
生物材料保藏
假丝酵母Candida glycerinogenes ZG17菌株，分类学命名为Candidaglycerinogenes ZG17，已于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.15118。
附图说明
图1是Candida glycerinogenes ZG17分别在在600g/L葡萄糖，9g/L乙酸、4g/L糠醛、45℃高温条件下点种生长情况；
图2是Candida glycerinogenes ZG17合成乙醇的过程曲线；
图3是Candida glycerinogenes ZG17纤维素水解液乙醇合成的过程曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
实施例1将Candida glycerinogenes WL2002-5进行诱变的方法。
以实验室保存的C.glycerinogenes WL2002-5为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：
(1)为了获得乙醇高产菌株，选用亚硝基胍诱变菌株的方法。从在液体培养基中的C.glycerinogenes WL2002-5培养物中获得待诱变的细胞混悬液。在30℃和200rpm下，将107细胞/ml的细胞混悬液在含250ug/ml NTG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液中。
(2)将诱变细胞在液体培养中，30℃和200rpm下培养6h。
(3)将步骤(2)诱变得到的培养液接入种子培养基，所述培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，余量为水。在培养温度30℃，转速200rpm条件下扩大培养16h后，按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基。所述培养基为：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，余量为水。37℃，100rpm培养48h，取1.5ml，离心去上清，经过HPLC分析进行乙醇含量的检测。取发酵乙醇含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(1)-(3)，直至筛选出乙醇产量高的目标菌株C.glycerinogenes ZG17。
实施例2高产菌株Candida glycerinogenes ZG17的耐受性。
分别挑取1环C.glycerinogenes WL2002-5、Saccharomyces cerevisiae ZWA46和C.glycerinogenes ZG17接入种子培养基中，所述培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，余量为水，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子稀释至OD600＝1，然后逐步梯度稀释至10-4.按3ul的点种量分别点种于含有9g/L乙酸，4g/L糠醛的固体培养基中，30℃培养72h。将稀释获得的种子液点种于YEPD固体培养基中，分别进行30℃和45℃培养。如附图1所示，与C.glycerinogenes WL2002-5和S.cerevisiae ZWA46在600g/L葡萄糖、9g/L乙酸、4g/L糠醛、45℃高温条件都无法生长，而Candida glycerinogenes ZG17在600g/L葡萄糖、9g/L乙酸、4g/L糠醛、45℃高温条件下能够正常生长。
实施例3高产菌株Candida glycerinogenes ZG17发酵生产乙醇
挑取1环假丝酵母接入C.glycerinogenes ZG17种子培养基中，在37℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按8％(v/v)的接种量接入含2.5L发酵培养基的5L发酵罐中。
种子培养基的配方按质量分数为：甘油3％，酵母粉2％，蛋白胨2％，余量为水。
发酵培养基为：葡萄糖22％，酵母粉10％，蛋白胨20％，余量为水，控制发酵温度为37℃，转速为100r/min，通气量为0.32v/v·min，时间为32h，发酵结束。
发酵液中乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)分析，具体如下：将发酵液10,000r/min离心，离心后再用0.45μm微孔滤膜过滤处理，采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器：Agilent高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱柱：Bio-RAD Aminex HPX-87H column 300mm×7.8mm；流动相：5mmol/L硫酸；流速：0.6mL/min，柱温：60℃，示差检测器，进样10μL。
利用C.glycerinogenes ZG17浓醪发酵生产乙醇，最高产量达100g/L，发酵时间为32h，乙醇产量最高可达到3.12g/L/h(附图2)。
实施例4高产菌株Candida glycerinogenes ZG17纤维素水解液发酵生产乙醇
挑取1环假丝酵母C.glycerinogenes ZG17接入YEPD种子培养基中，在37℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按8％(v/v)的接种量接入含2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，所述发酵培养基为：酵母粉10％，蛋白胨20％，余量为纤维素水解液(含葡萄糖20％)，控制发酵温度为37℃，转速为100r/min，通气量为0.32v/v·min，时间为32h，发酵结束。乙醇的测定方法如实施例3。
利用C.glycerinogenes ZG17纤维素水解液发酵生产乙醇，最高产量达80g/L，发酵时间为40h，乙醇产量最高可达到2g/L/h(附图3)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株假丝酵母，其特征在于，所述假丝酵母为甘油假丝酵母突变体Candidaglycerinogenes ZG17菌株，分类学命名为Candida glycerinogenes ZG17，已于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.15118。
2.权利要求1所述假丝酵母在乙醇制备方面的应用。
3.一种发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
(1)将权利要求1所述菌种Candida glycerinogenes ZG17接种于种子培养基中，温度为35-39℃，转速为150-200r/min的条件下培养16-20h得到种子液；
(2)将种子液按接种量5-8％接种到含有发酵培养基的发酵罐中，在温度为35-39℃，转速为100-200r/min的条件下发酵。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵罐的通气量为0.30-0.32v/v·min。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵罐的装液量为40-50％。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子培养基的配方按质量分数为：甘油2-3％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为水。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基的配方按质量分数为：葡萄糖18-35％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为水。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基的配方按质量分数为：酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，余量为纤维素水解液。
9.应用权利要3-8任一所述方法制备得到的乙醇。
10.应用权利要求1所述假丝酵母制备的菌剂。
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