CN110055184B - 酿酒酵母、包含其的微生物制剂及使用其生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株用于乙醇发酵的酿酒酵母菌株、包含其的微生物制剂以及使用该酿酒酵母菌株生产乙醇的方法。本发明在保藏编号为CGMCC No.15103的重组酿酒酵母0918MUT的基础上，经过一系列驯化，得到了高度适应于目前乙醇发酵物料及工艺的C5/C6糖共发酵酿酒酵母菌株S.C X630。使用所述重组酿酒酵母S.C X630对工业上生产乙醇使用的纤维素类原料进行发酵，相比于C6糖单独发酵可实现乙醇发酵增产约30％，能够节约成本，具有良好的工业化和商业化应用前景。

Description

酿酒酵母、包含其的微生物制剂及使用其生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。具体而言，本发明涉及一株用于乙醇发酵的酿酒酵母菌株、包含其的微生物制剂及其在乙醇发酵领域中的应用。
背景技术
生物质能源由于具有储量大、分布广、可再生等特点而被人们开发为煤、石油、天然气等化石燃料的替代能源，其中，将木质纤维素转化为燃料乙醇是生物质能源开发利用的一个重要方向。木质纤维素一般是指以木质素、纤维素以及半纤维素作为主要组成成分的生物质，相比淀粉和糖类等传统乙醇生产原料而言，木质纤维素十分廉价且容易获得，因而成为了目前生物质能源研究的主要材料。
目前，利用含木质纤维素的原料生产乙醇通常采用生物化学转化的工艺，此类生物化学转化工艺一般包括预处理、水解、发酵和回收等步骤。纤维素、半纤维素和木质素之间通过共价键和非共价键结合形成致密的结构，阻碍了酶对木质纤维素的降解，因此在将木质纤维素水解发酵之前通常需要进行预处理，经过预处理，提高了酶和木质纤维素原料的可接近性，从而提高了原材料的可利用性及水解效率。水解(包括酶解)后，半纤维素主要分解为五碳糖(C5糖，例如木糖)，而纤维素主要分解为六碳糖(C6糖，例如葡萄糖)。由于半纤维素的无定型结构，其更容易被水解为C5糖。在大多数木质纤维素水解物中，木糖是含量仅次于葡萄糖的一种单糖，因而，如果能够充分利用木质纤维素水解物中的木糖来发酵生产乙醇，将会大大提高木质纤维素的利用率及乙醇生产效率(由此得到的乙醇通常称为“纤维素乙醇”)。
在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径，包括经由木糖异构酶的途径以及经由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的途径。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa))等中，通过木糖异构酶的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。
在纤维素乙醇菌株开发中，菌株对木糖的利用及转化为乙醇的能力是最为关键的。利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖来生产乙醇的重组菌株成为研究热点。就此而言，一方面，在现有的共发酵菌株中，一般是通过向酵母中引入木糖代谢途径来实现C5糖和C6糖的共发酵。另一方面，新型木糖异构酶的开发和分子改造也尤为重要。源于真菌及嗜热细菌的木糖异构酶能够在酵母中表达并显示出活性，并参与酵母木糖代谢途径的构建。基于木糖异构酶特定的催化机理进行理性设计并提高其催化效率，对构建新型高效利用木糖的重组酵母而言具有重要的应用意义和价值。
在专利申请CN201711485502.8中，本发明的发明人通过研究发现，通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建了含有该木糖异构酶突变体的重组酿酒酵母菌株0918MUT，保藏编号为CGMCC No.15103。该菌株可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。但是该菌株在以秸秆酶解液等纤维素类原料为工业实际物料的乙醇发酵工艺(也称为“纤维素乙醇发酵工艺”)的应用上，还存在菌株在工业实际物料发酵体系中的发酵性能差、生产性能随物料差异波动较大、乙醇得率不稳定等问题，主要表现在该重组酿酒酵母菌株虽能同时利用C5糖和C6糖共发酵产乙醇，但对工业实际物料的适配性能差。因此在应用于使用纤维素类原料发酵生产乙醇的工艺中还具有很大的菌株优化空间。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人基于前期构建获得的C5/C6糖共发酵酿酒酵母菌株0918MUT(保藏编号为CGMCC No.15103)，进一步采用工业共发酵生产乙醇中所用的实际物料及实际生产条件对该菌株进行连续适应性驯化，以期获得一株能高度适应于目前乙醇发酵物料及工艺的C5/C6糖共发酵酿酒酵母菌株。
因此，在第一方面，本发明提供了一种酿酒酵母菌株S.C X630，其分类学名称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16832。
在第二方面，本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂包含第一方面所述的酿酒酵母菌株S.C X630。
在第三方面，本发明提供了第一方面所述的酿酒酵母菌株S.C X630或第二方面所述的微生物制剂在乙醇生产中的用途。
在第四方面，本发明提供了一种生产乙醇的方法，所述方法包括使用第一方面所述的酿酒酵母菌株S.C X630或第二方面所述的微生物制剂对生物质进行发酵来生产乙醇。
有益效果
本发明的酿酒酵母菌株S.C X630在使用工业乙醇生产中的实际工业物料(例如秸秆酶解液和木薯酒糟酶解液)进行C5糖和C6糖共发酵生产乙醇时，葡萄糖-木糖混合糖转化为乙醇的转化率(以下称为“糖醇转化率”)和木糖利用率均可达到90％以上。此外，在中试基地(30m3发酵罐)上进行的多次秸秆酶解液发酵试验中，本发明的酿酒酵母菌株S.C X630发酵效果良好，相比于单独C6糖发酵的酿酒酵母菌株，实现了纤维素乙醇发酵增产约30％，使每吨纤维素乙醇原料生产成本下降约15-25％，直接节约生产成本约1000-1200元/吨，超过多种可商业化使用的C5/C6糖共发酵菌株，具有良好的工业化和商业化应用前景。因此，本发明的酿酒酵母菌株S.C X630可进一步节省纤维素乙醇的生产成本，推动纤维素乙醇工业化进程。
附图说明
图1是本发明的S.C X630酿酒酵母菌株在中试(30m3发酵罐)发酵过程中木糖、葡萄糖、乙醇的浓度随时间变化的曲线图。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供了一种酿酒酵母菌株S.C X630，于2018年11月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.16832。本发明的酿酒酵母菌株以保藏编号为CGMCC No.15103的重组酿酒酵母菌株0918MUT为出发菌经过一系列驯化获得。
在本发明中，所述C5/C6糖共发酵酿酒酵母菌株S.C X630通过如下步骤获得：
1)以保藏编号为CGMCC No.15103的重组酿酒酵母菌株0918MUT为出发菌制备种子液，以10v/v％的接种量接种于5mL含10g/L木糖的YEPX液体培养基中，于30℃、200rpm下连续培养，每72h以10v/v％的体积比转接至等量的新鲜含10g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养，在转接6次后继续培养72h，然后将培养液涂抹在YEPX固体培养基上，于30℃下培养56小时挑选菌落直径大于1cm的单菌落；
2)将步骤1)中获得的单菌落分别在5mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基中于30℃、200rpm下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至等量的新鲜含40g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养，转接49次后继续培养24h，选择培养液中OD600值最高的C-11菌株，将其命名为ABX0601；
3)将步骤2)获得的ABX0601菌株的种子液以10v/v％的接种量在5mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基中于30℃、150rpm微氧环境(在密闭的西林瓶的密封塞上扎1个注射器针头，以达到微氧环境)下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至等量的新鲜含40g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养，共转接28次，将转接第28次并继续培养24h后的培养液在YEPX固体培养基上进行划线培养56h(30℃培养)，挑选菌落直径大于1cm的单菌落；然后，将该单菌落接种在5mL含40g/L木糖的YNBX液体培养基中，于30℃、150rpm的相同微氧环境下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至等量的新鲜含40g/L木糖的YNBX液体培养基中继续培养，转接18次获得OD600值明显升高的菌株，将其命名为ABX0918；
4)将步骤3)获得的ABX0918菌株的种子液以10v/v％的接种量接种在玉米秸秆气爆料挤出液(含有40g/L木糖和500ppm尿素)中，于30℃、150rpm微氧环境(微氧环境同步骤(3))下连续培养，每48h以10v/v％的体积比转接至等量的新鲜玉米秸秆气爆料挤出液中，转接95次后获得了本发明的酿酒酵母菌株S.C X630。
其中，所述保藏编号为CGMCC No.15103的重组酿酒酵母菌株0918MUT记载于专利申请CN201711485502.8中，以引用的方式将其全部内容并入本文。
在本发明中，本发明所述的酿酒酵母菌株S.C X630可使用本领域已知的各种培养基以及培养条件进行培养，只要所述培养基和培养条件适于酵母生长和/或繁殖即可。例如，将S.C X630菌株在YEPD液体培养基中，于30℃下、200rpm下培养16h-20h。
可按照本领域的标准方法对本发明的酿酒酵母菌株S.C X630进行保存和储藏，例如甘油管冷冻保藏、斜面保藏、石蜡油封藏、沙土管保藏等。对于保藏的酿酒酵母菌株S.CX630，在使用时，通常先对保藏的酿酒酵母菌株S.C X630进行活化，例如将-80℃保藏的菌株S.C X630的甘油管菌种接种至新鲜的含40g/L木糖的YEPX液体培养基中，于30℃下、200rpm下培养12-24h，再将所得的培养液以一定的比例(例如2v/v％或等效接种OD为1)接种至新鲜的YEPD液体培养基中继续进行培养或者直接接种至发酵培养基(例如秸秆酶解液等)中进行发酵。
在一个实施方式中，本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂包含本发明所述的酿酒酵母菌株S.C X630。其中，所述微生物制剂优选为活菌制剂。
在一些优选的实施方式中，所述微生物制剂进一步包括工业上可使用的添加剂，例如各种抗生素、抗氧化剂、防霉剂或黏结剂等。本领域技术人员可以根据实际需要选择添加剂的种类和添加剂的量，这一点并不会对本发明进行限制。
在一些优选的实施方式中，所述微生物制剂可为冻干菌剂，优选处于干粉状的冻干菌剂。制备所述冻干菌剂的方法是本领域技术人员已知的，例如将发酵液经离心后收集菌体/菌泥，采用真空冷冻干燥技术制备得到。在一些实施方式中，在采用冷冻干燥技术之前还包括向菌体/菌泥中加入冻干保护剂。所述冻干保护剂可使用本领域熟知的那些物质，例如包括但不限于麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸。
在一些实施方式中，所述微生物制剂还可包含乙醇发酵工序所需的其它多种成分或其它有益微生物，例如可产生纤维素酶或淀粉酶的微生物(如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))。
在另一实施方式中，本发明提供了本发明所述的酿酒酵母菌株S.CX630或本发明所述的微生物制剂在乙醇生产中的用途。
在又一实施方式中，本发明提供了一种生产乙醇的方法，所述方法包括使用本发明所述的酿酒酵母菌株S.C X630或本发明所述的微生物制剂对生物质进行发酵来生产乙醇。
在本发明中，所述生物质可为工业乙醇发酵常用的生物质。本发明所述的酿酒酵母菌株S.C X630为C5/C6糖共发酵酿酒酵母菌株，不仅适用于淀粉类原料发酵工艺，同时也适用于纤维素类原料发酵工艺。因此，在一些实施方式中，所述生物质可为纤维素类原料或淀粉类原料，或它们的组合。
在本文中，术语“纤维素类原料”是指来源于富含纤维素的生物质的原料。例如，所述纤维素类原料可来源于富含纤维素的农作物及其加工产物，其中农作物秸秆是常见的一类纤维素类原料。所述秸秆通常是指小麦、玉米、水稻、棉花、高粱、大豆、花生、甘蔗等农作物收获子实后的茎、叶、皮(壳)、蔓藤等残留物，可作为工业上的稳定的廉价原料来源，所述秸秆例如但不限于：玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、谷子秸秆、高粱秸秆、水稻秸秆、大豆秸秆、甘薯秆、花生秸秆、花生壳、蔗渣或香蕉杆。
在本文中，术语“淀粉类原料”是指来源于富含淀粉的生物质的原料。所述淀粉类原料可来源于玉米、小麦、木薯和马铃薯等常规的可用于乙醇发酵的植物材料。例如，淀粉质原料主要来源于薯类如木薯、甘薯和马铃薯等；谷类如玉米、小麦、高粱、水稻等；野生植物如葛根、蕨根等。工业上以淀粉类原料为物料进行C6糖发酵生产乙醇后通常产生大量的酒糟，例如木薯酒糟。这些酒糟是在淀粉类原料降解产生的糖(主要是C6糖)经酵母发酵后，蒸馏提取酒精后对废醪液进行固液分离而获得的固体物质，其中主要包含未被利用的半纤维素和纤维素等物质，因此这些酒糟也可作为纤维素类原料用于本发明的乙醇发酵。因此，在一些实施方式中，所述纤维素类原料还可为由淀粉类原料生产的酒糟，例如但不限于木薯酒糟、甘薯酒糟、马铃薯酒糟、玉米酒糟、小麦酒糟、高粱酒糟、水稻酒糟、葛根酒糟或蕨根酒糟等。
在实际工业乙醇生产中，为了使纤维素类原料中的纤维素充分释放出来，还包括对所述原料进行预处理，例如汽爆、蒸煮、挤出、膨化和/或酶降解。对本发明的纤维素类原料进行汽爆、蒸煮、挤出、膨化和/或酶降解的方法是本领域技术人员已知的。例如将秸秆切碎后加水，在190℃下维持1.25MPa压力3分钟，泄压完成蒸汽爆破获得秸秆汽爆料。在一些实施方式中，可对本发明的纤维素类原料进行多种预处理，例如对物料(例如秸秆)进行汽爆后得到的汽爆物料再进行纤维素酶降解。例如向汽爆物料中加入8wt％-15wt％的纤维素酶，在50℃，pH 5.0下进行酶水解72h，获得酶解液。在本文中，经预处理得到的产物(如酶解液、挤出液)也包括在“纤维素类原料”这一术语的范围内。在优选的实施方式中，所述纤维类原料选自秸秆酶解液、酒糟酶解液、秸秆挤出液、酶解成熟醪液、汽爆料酶解液等。
在本发明中，所述酿酒酵母菌株S.C X630或所述微生物制剂的接种量可为常规的数量。例如，相对于每升发酵体系，菌体细胞干重为0.4-0.5g。
在本发明中，所述酿酒酵母菌株S.C X630或所述微生物制剂可采用常规的方法接种，例如向生物质中加入5-15v/v％的种子液。所述种子液可为所述酵母菌液或由所述微生物制剂制成的水溶液，也可为所述微生物制剂的活化培养液。种子液的制备方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
在本发明中，所述乙醇发酵的条件可为常规的乙醇发酵条件。例如发酵时间可为48h-96h，发酵温度可为30-35℃，pH值可为4-5.5，发酵条件可为厌氧发酵。
根据本发明提供的生产乙醇的方法，可得到乙醇含量较高的成熟发酵液。成熟发酵液中的乙醇可用常规的方法和步骤，根据不同工业产品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的纯度达到99％以上)进行分离、精制，如蒸馏、浓缩、除水等步骤。
实施例
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。YNB货号为：HB7040，购自海博生物，酵母粉和蛋白胨货号分别为：LP021、LP0042，购自OXOID；酶制剂：Ctec3纤维素酶，购自诺维信；下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，全部试剂购自上海生工。
实施例中使用的试剂：
含10g/L木糖的YEPX液体培养基：10g/L木糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨，水补齐体积，116℃灭菌15min；
含40g/L木糖的YEPX液体培养基：40g/L木糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨，水补齐体积，116℃灭菌15min；
YEPX固体培养基：40g/L木糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、15g/L琼脂粉，水补齐体积，116℃灭菌15min；
含40g/L木糖的YNBX液体培养基：0.67w/v％YNB，40g//L木糖；
YEPD液体培养基：80g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨，水补齐体积，116℃灭菌15min；
玉米秸秆气爆料制备：将玉米秸秆切成不超过1.5cm×0.4cm×1.0cm的小段，储存在暂存仓内，随时备用；在20m3的酶解装置中将秸秆段水浸5分钟后(玉米秸秆与水的重量比为1:25)，在190℃下维持1.25MPa压力3分钟，泄压完成蒸汽爆破获得玉米秸秆汽爆料。
玉米秸秆气爆料挤出液制备：在烧杯中加入玉米秸秆气爆料和水(总重量比为玉米秸秆气爆料:水＝1000:663)，混合均匀后，10000rpm离心15min，用0.45μm和0.22μm无菌滤膜过滤除菌获得玉米秸秆气爆料挤出液。
玉米秸秆酶解液制备：在酶解反应器中加入需要量的玉米秸秆气爆料、Ctec3纤维素酶酶制剂和水(总重量比为秸秆气爆料：Ctec3纤维素酶酶制剂：水＝531:11:458)，进行1Kg体系酶解，pH5.0、温度50℃、100rpm反应条件下，酶解反应72h后获得玉米秸秆酶解液。
木薯酒糟酶解液制备：硫酸负荷7g/kg干木薯酒糟，蒸汽爆破维持压力1.01MPa，维压时间8.6min，进行汽爆制备得到木薯酒糟汽爆物料；使用氢氧化钠将木薯酒糟气爆物料(其中干物质固体含量为26.8wt％)pH调至5.0；进行1Kg体系酶解，在酶解反应器加入需要量的预处理物料(932.8g pH调节后的木薯酒糟气爆物料)、Ctec3纤维素酶酶制剂(4.4gCtec3纤维素酶酶制剂)和水(补水至1000g)，在50℃、100rpm反应条件下，酶解反应72h获得木薯酒糟酶解液。
以下实施例中酵母菌株发酵液、玉米秸秆气爆料挤出液、玉米秸秆酶解液和木薯酒糟酶解液中木糖、葡萄糖和乙醇的浓度均通过HPLC来检测，使用的HPLC反应条件和样品制备具体如下：
HPLC分析条件：色谱仪：Agilent Technologies 1260Infinity II；检出器：RID；分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；流动相：0.05M硫酸；流量：0.5mL/min；进样量：20μL。
标品：葡萄糖、木糖，来自Sigma-Aldrich，色谱级；乙醇，来自ThermoF-isher，色谱级。
样品制备：取酵母菌株发酵液、玉米秸秆气爆料挤出液、玉米秸秆酶解液和木薯酒糟酶解液1.5mL，12000rpm离心15min，用0.45μm和0.22μm无菌滤膜过滤后，过滤液装液相小瓶等待HPLC检查分析。
利用HPLC分析玉米秸秆气爆料挤出液、玉米秸秆酶解液和木薯酒糟酶解液中的葡萄糖和木糖浓度，结果是，玉米秸秆气爆料挤出液中葡萄糖浓度为7.09g/L，木糖浓度为28.15g/L；玉米秸秆酶解液中葡萄糖浓度为69.85g/L，木糖浓度为28.21g/L；木薯酒糟酶解液中葡萄糖浓度为55.98g/L，木糖浓度为12.59g/L。
实施例1：S.C X630菌株的制备
将前期基因工程改造的能利用木糖和葡萄糖的C5/C6共发酵重组酿酒酵母菌株0918MUT(参见专利申请CN201711485502.8)作为出发菌株，将出发菌株的种子液以10v/v％的接种量接种于含有5mL含10g/L木糖的YEPX液体培养基的试管中，于30℃、200rpm下连续培养，每72h以10v/v％的体积比转接至5mL新鲜的含10g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养，转接6次后，将第6次转接后继续培养72h的培养液涂布于YEPX固体培养基上，在30℃下培养56小时，挑选菌落直径大于1cm的单菌落，得到编号分别为C-9、C-10、C-11和C-14的四个单菌落。
将上述获得的单菌落分别接种于含有5mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基的试管中，于30℃、200rpm培养下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至5mL新鲜的含40g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养。通过分光光度计检测每次转接后培养24h的培养液的OD600值，转接49次后，选择OD600值最高的C-11菌株进行后续实验，并将其命名为ABX0601。
将ABX0601菌株的种子液以10v/v％的接种量接种于5mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基中，于30℃、150rpm微氧环境(在密闭的西林瓶的密封塞上扎1个注射器针头，以达到微氧环境)下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至5mL新鲜的含40g/L木糖的YEPX液体培养基中继续培养。通过分光光度计测量每次转接后培养24h的培养液的OD600，转接28次后培养液的OD600值明显升高，进而在YEPX固体培养基上进行划线培养(30℃培养56h)，待长出单菌落后，挑选菌落直径大于1cm的单菌落。
将上述获得的单菌落接种至5mL的含40g/L木糖的YNBX液体培养基中，于30℃、150rpm微氧环境(与上述微氧条件相同)下连续培养，每24h以10v/v％的体积比转接至5mL新鲜的含40g/L木糖的YNBX液体培养基中继续培养。通过分光光度计测量每次转接后培养24h的培养液的OD600值，发现转接第18次的菌液的OD600明显升高，将该菌株命名为ABX0918。
将ABX0918菌株以10v/v％的接种量接种至5mL的玉米秸秆气爆料挤出液(其中还含有40g/L木糖和500ppm尿素)中，于30℃、150rpm微氧环境(与上述微氧条件相同)下连续培养，每48h以10v/v％的体积比转接至5mL新鲜的玉米秸秆挤出液中继续培养，转接95次。
采用HPLC检测每代菌株培养24h的发酵液中的木糖、葡萄糖和乙醇的含量，并利用以下公式计算出木糖利用率和糖醇转化率：
木糖利用率(％)＝(总木糖-相应时间消化木糖)/总木糖×100
糖醇转化率(％)＝相应时间的乙醇/(木糖+葡萄糖)/0.511×100
如表1所示，通过使用玉米秸秆气爆料挤出液连续转接95次后，相比于菌株ABX0918，转接95次的菌株(命名为ABX0630)的木糖利用率和糖醇转化率都有了较大幅度的提升，说明对玉米秸秆汽爆料挤出液的适应性较高。
表1：玉米秸秆气爆料挤出液连续驯化过程中不同菌株的木糖利用率和糖醇转化率的结果
Figure BDA0001926568200000111
由此，本发明获得了一株具有乙醇工业物料适配性的C5/C6共发酵酿酒酵母菌株ABX0630，将其命名为S.C X630，并于2018年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16832。
实施例2：对S.C X630的发酵性能评价
分别以工业实际物料玉米秸秆酶解液和木薯酒糟酶解液为原料来评价实施例1获得的S.C X630菌株的发酵性能，即测量其发酵液中木糖、葡萄糖和乙醇的量随时间的变化，并由此计算出糖醇转化率、木糖利用率等参数。以玉米秸秆酶解液为底物评价S.C X630菌株的发酵性能的具体过程如下：
1)种子液制备：取1mL-80℃保藏的S.C X630甘油管接种至含有100mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基的摇瓶中，于30℃下，200rpm下培养16h，测量OD600；取1mL培养液转接至含有200mL YEPD液体培养基的500mL摇瓶中，于30℃下、200rpm下培养20h，获得种子液，并计算细胞干重DCW。
2)发酵过程：发酵采用3摇瓶平行样，摇瓶体系为500mL，装料200mL玉米秸秆酶解液(其中还含有终浓度为0.5g/L的尿素、50mg/L的青霉素和10mg/L的链霉素)。取种子液20mL在8000rpm下离心10min，用生理盐水洗涤菌体一次，用1mL生理盐水悬浮菌体后接种，初始接种量控制为0.45g干细胞/L发酵液(等效接种OD为1)。接种后即时(0h)取样，在30℃、150rpm下，通过保鲜膜包扎进行厌氧发酵，发酵过程中每隔12h取样。样品统一进行HPLC分析。
结果如表2所示，利用S.C X630菌株对玉米秸秆酶解液进行发酵，发酵48h木糖利用率达到85％以上，糖醇转化率达到93％以上；发酵72h木糖利用率可达到92％以上，糖醇转化率可达到94％以上，说明本发明的S.C X630菌株能很好的以玉米秸秆酶解液为底物进行C5/C6糖共发酵生产乙醇。
表2 S.C X630菌株以玉米秸秆酶解液为底物的发酵性能
Figure BDA0001926568200000121
进一步评价S.C X630菌株对木薯酒糟酶解液的发酵性能。并且以出发菌株0918MUT作为对照。
1)种子液制备：取1mL-80℃保藏的S.C X630甘油管接种至含有100mL含40g/L木糖的YEPX液体培养基的摇瓶中，于30℃下、200rpm下培养16h，测量OD600；取1mL培养液转接至含有200mL YEPD液体培养基的500mL摇瓶中，于30℃下、200rpm下培养20h，获得种子液，并计算细胞干重DCW。
2)发酵过程：发酵采用3摇瓶平行样，摇瓶体系为500mL，装料200mL木薯酒糟酶解液(其中还含有200ppm尿素、50mg/L青霉素和10mg/L链霉素，pH 5.5)。取种子液20mL在8000rpm下离心10min，用生理盐水洗涤菌体一次，用1mL生理盐水悬浮菌体后接种，初始接种量控制为0.45g干细胞/L发酵液(等效接种OD为1)。接种后即时(0h)取样，在30℃、150rpm条件下，通过保鲜膜包扎进行厌氧发酵，发酵过程中每隔12h取样。样品统一进行HPLC分析。
表3 0918MUT菌株和S.C X630菌株以木薯酒糟酶解液为底物的发酵性能对比
Figure BDA0001926568200000131
结果如表3所示，相对于出发菌株0918MUT，利用本发明的酿酒酵母菌株S.C X630对木薯酒糟酶解液进行发酵，木糖利用率明显提高，说明驯化后的菌株S.C X630对木薯酒糟酶解液的适应能力也显著提高。证明本发明的酿酒酵母菌株S.C X630不仅适合秸秆生物炼制，也可为木薯酒糟生物炼制提供优良发酵性能，可适用于纤维素乙醇发酵工艺，具有用于工业化生产乙醇的前景。
实施例3：对S.C X630的中试发酵验证
在中粮肇东中试基地对本发明的S.C X630菌株进行秸秆酶解液发酵试验，以评价S.C X630在中试(30m3发酵罐)纤维素乙醇发酵过程中的效果，评估其在纤维素乙醇发酵工艺中的应用。
秸秆酶解液制备过程：将玉米秸秆切成不超过1.5厘米×0.4厘米×1.0厘米的小段，储存在暂存仓内，随时备用；在20m3的酶解装置中将秸秆段水浸5分钟后(玉米秸秆与水的重量比为1:25)，在190℃下维持1.25MPa压力3分钟，泄压完成蒸汽爆破，获得玉米秸秆蒸汽爆破料；调节蒸汽爆破料含水量至53wt％，并加入72wt％的硫酸溶液混合拌匀；加入8wt％的诺维信二代纤维素酶，在50℃，pH 5.0下进行酶水解72h，获得酶解成熟醪液，其中纤维素酶将物料中的纤维素与半纤维素进一步降解成可发酵性糖。
在30m3纤维素乙醇中试发酵中，采用实施例1所得的菌株S.C X630(接种量控制为0.45g干细胞/L发酵液)对装液量为约16m3酶解成熟醪液进行乙醇发酵，将葡萄糖转化成为乙醇和二氧化碳。发酵时间为56h，发酵条件：温度32℃，不通气，pH约为4.5，青霉素添加量为90g。每8小时取样测定发酵液中的木糖、葡萄糖和乙醇浓度，结果如图1所示。
从图1中可见，发酵至16h时，葡萄糖消耗殆尽，此时乙醇浓度为3.9g/100ml；发酵起始时，木糖浓度为2.5g/100ml，发酵结束时木糖浓度为0.17g/100ml，木糖利用率为93.2％；综合糖醇转化率为92.5％，说明本次试验达到较好的发酵效果，并且相比于单独C6糖发酵的酿酒酵母菌株，本发明的S.C X630菌株进行发酵可实现乙醇发酵增产约30％，生产每吨乙醇原料成本可下降约30％，直接节约生产成本约为1000-1200元/吨，已具备工业化应用条件。
使用本发明的菌株S.C X630进行乙醇发酵，发酵时间较短、乙醇转化率和木糖利用率较高，可有效节约成本和时间，在用于乙醇发酵方面具有良好的商业化应用前景。

Claims (8)

1.一种微生物制剂，所述微生物制剂包含酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株S.C X630，保藏编号为CGMCC No. 16832，所述微生物制剂为冻干菌剂。
2.如权利要求1所述的微生物制剂在乙醇生产中的用途。
3.一种生产乙醇的方法，所述方法包括用包含酿酒酵母菌株S.C X630的微生物制剂对生物质进行发酵来生产乙醇，所述酿酒酵母菌株S.C X630的保藏编号为CGMCC No. 16832。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述生物质选自纤维素类原料或淀粉类原料，或它们的组合。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述纤维素类原料来源于农作物秸秆或酒糟；所述淀粉类原料来源于木薯、甘薯、马铃薯、玉米、小麦、高粱、水稻、葛根或蕨根。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述农作物秸秆选自玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、谷子秸秆、高粱秸秆、水稻秸秆、大豆秸秆、甘薯秆、花生秸秆、花生壳、蔗渣或香蕉杆，或它们的组合。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述酒糟选自木薯酒糟、甘薯酒糟、马铃薯酒糟、玉米酒糟、小麦酒糟、高粱酒糟、水稻酒糟、葛根酒糟或蕨根酒糟，或它们的组合。
8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中，所述发酵的时间为48h-96h，发酵温度为30-35℃，pH值为4-5.5，发酵条件为厌氧发酵。
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