JP6322187B2 - セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法 - Google Patents
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Description
〔1〕セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を、発酵槽内へのエア供給速度が0.0001〜100L/時/g乾燥菌体重量となる条件下で、カンジダ・インターメディア(Candida intermedia)に属する酵母を用いて発酵させることを特徴とするエタノールの生産方法。
〔2〕発酵が、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を0.0002〜2L/時/g乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給する連続法である、〔1〕記載のエタノールの生産方法。
〔3〕カンジダ・インターメディア(Candida intermedia)に属する酵母が、4−6−4T2と命名されFERM BP−11509として寄託された酵母である〔1〕又は〔2〕記載のエタノールの生産方法。
本発明のエタノールの生産方法では、カンジダ・インターメディア(Candida intermedia)に属する酵母が用いられる。該酵母としてはカンジダ・インターメディア(Candida intermedia)に属する酵母であれば特に限定されず、例えば、独立行政法人 製品評価技術基盤機構(NITE)から入手可能なカンジダ・インターメディア「NBRC10601」等であってもよいし、カンジダ・インターメディアの突然変異株であってもよい。その中でも、本発明者がカンジダ・インターメディア「NBRC10601」を親株として常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得したカンジダ・インターメディア「4−6−4T2」と命名し、「FERM BP−11509」として独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE)(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託した酵母(原寄託日,2011年9月6日)を用いることが特に好ましい。
また、4−6−4T2は、グルコース及びキシロースを含有する原料液体から短時間で効率良くエタノールを生産するが、このとき副生成物としてのキシリトールがほとんど生成されない。また、4−6−4T2は、このような糖からのエタノールの生産能力以外については親株と同等の性質を有する。
本発明のエタノールの生産方法においては、セルロース系バイオマス加水分解物を炭素源として含有する。
ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースとヘミセルロースを含むバイオマスをいう。斯かるバイオマス中のセルロースが加水分解されることでグルコースが得られ、一方、ヘミセルロースが加水分解されることでグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースが得られる。なお、セルロース系バイオマス加水分解物中の各糖類の含有比率はセルロース系バイオマスの種類によって異なるが、いずれもグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースを含有する。
また、フルフラールやHMF等のフラン化合物であれば発酵用液中に0.01mol/L程度存在しても通常では著しくエタノール生産効率を低下させるが、本発明のエタノールの生産方法を用いた場合には、発酵阻害物質としてフラン化合物が0.01mol/L以上存在していても、エタノール生産効率にはほとんど影響せず、さらには0.02mol/L以上存在していても問題なく効率のよいエタノール生産を行うことができる。一方、0.10mol/Lを超えるとエタノール生産効率に影響しやすくなるため、0.10mol/L以下であることが好ましく、0.070mol/L以下であることがより好ましく、0.040mol/L以下であることが特に好ましい。なお、上記含有量は全てのフラン化合物の合計の含有量である。
従って、本発明のエタノール生産方法は、当然、弱酸やフラン化合物を含有しない条件下でも良好にエタノールを生産できるが、発酵阻害物質の存在にもかかわらずセルロース系バイオマス加水分解物から良好にエタノールを生産できるという効果を享受しやすいという観点からは、発酵用液中に弱酸が0.02mol/L〜0.15mol/L及び/又はフラン化合物が0.01mol/L〜0.10mol/L含有することが好ましい。さらに発酵用液中に弱酸が0.04mol/L〜0.12mol/L及び/又はフラン化合物が0.02mol/L〜0.07mol/L含有することがより好ましい。
本発明のエタノール生産方法においては、エア供給速度を0.0001〜100L/時/g乾燥菌体重量とする必要がある。この範囲を外れると、エタノール生産効率が低下してしまう。エア供給速度は、0.005〜100L/時/g乾燥菌体重量が好ましく、0.005〜10L/時/g乾燥菌体重量がより好ましく、0.005〜1.0L/時/g乾燥菌体重量が好ましい。また、回分発酵法の場合のエア供給速度は0.005〜1.0L/時/g乾燥菌体重量が好ましく、0.005〜0.5L/時/g乾燥菌体重量がより好ましく、0.005〜0.10L/時/g乾燥菌体重量がさらに好ましく、0.005〜0.05L/時/g乾燥菌体重量が特に好ましい。連続発酵法の場合のエア供給速度は0.05〜100L/時/g乾燥菌体重量が好ましく、0.05〜10L/時/g乾燥菌体重量がより好ましく、0.10〜1.0L/時/g乾燥菌体重量がさらに好ましく、0.10〜0.5L/時/g乾燥菌体重量が特に好ましい。ここでエアとは、大気であり、酸素供給量に換算すれば、その1/5である。
しかし、本発明のエタノール生産方法によれば、酵母の増殖と増殖した酵母によるエタノール発酵とのバランスを有効にとれ、連続発酵中に酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することができる。
すなわち、増殖および発酵工程において、酵母はセルロース系バイオマス加水分解物中に存在する糖以外に発酵阻害物質であるフルフラールやHMFもいっしょに取り込む。取り込まれたこれらの物質は増殖あるいは発酵過程で酵母の細胞内の酵素により、酸化および/または還元され無毒化される。その際、酵素は補酵素(NADHあるいはNADPH)を必要とするが、補酵素は増殖または発酵過程にともない生成する(非特許文献1)。そのため、増殖およびエタノール生産濃度が変動する回分発酵は、セルロース系バイオマス加水分解物を用いる酵母によるエタノール発酵には適さない場合がある。これに対し、連続発酵では、増殖およびエタノール生産濃度がほぼ一定に保たれるため、補酵素の生成濃度も一定となり、これら補酵素の供給に過不足が生じないため、発酵阻害物質の影響が受けにくく、効率的にエタノールを生産することが可能となるためである。
エタノール生産中の酵母濃度は、乾燥菌体重量で0.5〜5質量%に調整することが好ましい。回分発酵法においては、エタノール発酵工程前の増殖工程においてこの濃度に調整すればよい。連続発酵法においては、培養開始前に前培養した酵母をこの濃度の範囲となるように植菌するか、植菌後、酵母濃度を2倍程度の増殖をともなってもよく、エタノール生産中はセルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液の供給速度(すなわち発酵液抜き出し速度)や酸素濃度等の培養条件を調整しこの濃度の範囲となるように調整すればよい。
以下の手順に従い、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE)に保存されている酵母カンジダ・インターメディア(Candida intermedia)「NBRC10601」を親株として、馴養及び自然変異により4−6−4T2株を取得した。
次いで、上記と同様にしてpHを5.0に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ1質量%含有する酢酸水溶液と液体培地を50%ずつ混合し、この混合液10mLに上記3日間培養した培養液を100μL添加し、更に7日間培養した。更に、上記と同様にしてpHを5.0に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ1質量%含有する酢酸水溶液80%と培地20%を混合し、この混合液10mLに上記7日間培養した培養液を100μL加え30日間更に培養し、馴養株液とした。
上記馴養株液を1000倍希釈し、YNB寒天培地(グルコース:5%、酵母エキス:1%、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース:2%、寒天:2%)の培地に塗布し、25℃で4日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
カンジダ・インターメディア NBRC10601または、カンジダ・インターメディア 4−6−4T2(FERM BP−11509)を、YNB培地(グルコース2質量%およびキシロース1質量%、2%酵母ニトロゲンベース(アミノ酸不含)、1%酵母エキス)に添加し、48時間、温度30℃、pH5.5〜6(調整なし)で前培養を行った。その後、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3質量%、キシロース2質量%、酢酸0.5質量%(0.08mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)に2質量%(乾燥菌体重量相当)となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が0.01L/h/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図1に示す。
なお、実施例1の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を0L/時/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
カンジダ・インターメディア NBRC10601または、カンジダ・インターメディア 4−6−4T2(FERM BP−11509)を、実施例1と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3%、キシロース2%、酢酸0.3質量%(0.05mol/L)、フルフラール0.1質量%(0.010mol/L)、5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)0.1質量%(0.008mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)に、2質量%(乾燥菌体重量相当)となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が0.01L/h/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図2に示す。
なお、実施例2の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸、フルフラール、HMFを含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を0L/時/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
カンジダ・インターメディア NBRC10601または、カンジダ・インターメディア 4−6−4T2(FERM BP−11509)を、実施例1と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3質量%、キシロース2質量%、酢酸0.3質量%(0.050mol/L)、レブリン酸0.3質量%(0.026mol/L)、ギ酸0.2質量%(0.043mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)に2質量%(乾燥菌体重量相当)となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が0.01L/h/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図3に示す。
なお、実施例3の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸、レブリン酸、ギ酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を0L/時/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
カンジダ・インターメディア 4−6−4T2(FERM BP−11509)を、実施例1と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3質量%、キシロース2質量%、フルフラール0.22質量%(0.023mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)に2質量%(乾燥菌体重量相当)となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が0.01L/h/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。また、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液中のフルフラール0.22質量%に代えて5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)0.68質量%(0.054mol/L)を含有させた発酵用液、比較としてこれら発酵阻害物質を含有しない発酵用液をそれぞれ用い、これ以外は同じ条件にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図4に示す。
なお、実施例4の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としてはフルフラールまたはHMFを含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を0L/時/g乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
カンジダ・インターメディア NBRC10601を、実施例1と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3質量%、キシロース2質量%、酢酸0.5質量%(0.08mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)0.36Lに、2質量%(7.2g(乾燥菌体重量))となるように添加した。これを用い、発酵用液の供給速度を0.015L/時、発酵用液の抜き出し速度を0.015L/時とし、エア供給量を0L/時/g乾燥菌体重量、0.17L/時/g乾燥菌体重量または1.7L/時/g乾燥菌体重量のいずれかとし、連続発酵法にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図5に示す。
なお、実施例5の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
カンジダ・インターメディア 4−6−4T2(FERM BP−11509)を、実施例1と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液(グルコース3質量%、キシロース2質量%、酢酸0.5質量%(0.08mol/L)、0.05Mリン酸緩衝液、pH5.5)0.36Lに、2質量%(7.2g乾燥菌体重量相当)となるように添加した。これを用い、発酵用液の供給速度を0.015L/時、発酵用液の抜き出し速度を0.015L/時とし、エア供給量を0L/時/g乾燥菌体重量、0.17L/時/g乾燥菌体重量または1.7L/時/g乾燥菌体重量のいずれかとし、連続発酵法にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図6に示す。
なお、実施例6の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
Claims (3)
- 弱酸およびフラン化合物からなる群より選択される発酵阻害物質を含有する、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を、発酵槽内へのエア供給速度が0.0005〜10L/時/g乾燥菌体重量となる条件下で、カンジダ・インターメディア(Candida intermedia)に属し、カンジダ・インターメディアに属する酵母が4−6−4T2と特定され、FERM BP−11509として寄託された酵母を用いて発酵させることを特徴とするエタノールの生産方法。
- 発酵が、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を0.005〜2L/時/g乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給する連続発酵である請求項1のエタノールの生産方法。
- 前記発酵が回分発酵又は連続発酵である請求項1記載のエタノール生産方法。
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