WO2013027282A1 - ブタノールの新規な生産方法 - Google Patents

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WO2013027282A1
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butanol
clostridium
arabinose
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園元　謙二
剛士 吉田
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住友商事株式会社
国立大学法人九州大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the production of biobutanol. More specifically, the present invention relates to a method for producing biobutanol by effectively using non-food biomass.
  • Biobutanol produced by Clostridium microorganisms is attracting attention as post-bioethanol.
  • Biobutanol production by microorganisms belonging to the genus Clostridium is also referred to as acetone / butanol / ethanol fermentation (ABE fermentation) because it simultaneously produces acetone and some ethanol.
  • Butanol has advantages in terms of physical properties such as energy density, low corrosiveness, and low hygroscopicity compared to ethanol.
  • Butanol is not only used as a raw material for various chemically synthesized substances such as isoprene, isobutene and butene, but can also be added not only to gasoline fuel but also to diesel fuel.
  • Non-patent Document 1 ABE fermentation has a complicated and unique metabolic pathway in which metabolites vary greatly depending on the state of the bacteria.
  • butanol inhibits the growth of production microorganisms, fermentation productivity is very low compared with ethanol, and there are many technical problems for improving productivity.
  • the present inventors have produced a production system by pH-stat fed-batch culture using butyric acid as a substrate by proliferating cells (Non-patent Document 2), and a high-efficiency production system by stationary cells (Non-Patent Document 3). ) Etc. have been reported.
  • non-food biomass is used by lactic acid bacteria in the lactic acid fermentation process.
  • non-food biomass it is desirable that non-food biomass can be used in the ABE fermentation process.
  • the present inventors cultured Clostridium microorganisms using a mixed substrate of arabinose or xylose, which can be obtained by saccharification of lignocellulosic biomass, one of non-food biomass, and glucose,
  • a mixed substrate with lactic acid was compared for various fermentation parameters.
  • a mixed substrate of arabinose or xylose and lactic acid was used, butanol production concentration and lactic acid consumption showed higher values than when a mixed substrate of glucose and lactic acid was used.
  • the system using arabinose showed higher values than the system using glucose in all the fermentation parameters used.
  • the present inventors have completed the present invention based on such findings.
  • the present invention provides the following: [1] Microorganisms belonging to the genus Clostridium that can produce butanol, A method for producing butanol, comprising a step of producing butanol in a medium containing arabinose and / or xylose and lactic acid as a substrate. [2] The production method according to 1, wherein the microorganism belonging to the genus Clostridium is Clostridium saccharoperbutylacetonicum , Clostridium beijerinckii , or Clostridium acetobutylicum. . [3] The production method according to 1 or 2, wherein the environment contains arabinose and lactic acid as substrates.
  • lactic acid is a mixture of L-lactic acid and D-lactic acid.
  • the method according to any one of 1 to 4 wherein the arabinose and / or xylose is derived from non-food biomass.
  • Lactic acid is produced from non-food biomass by lactic acid bacteria capable of homo-type lactic acid fermentation and capable of producing L-lactic acid and D-lactic acid, or lactic acid bacteria capable of hetero-type lactic acid fermentation, 1 6.
  • the butanol production method according to any one of 1 to 5.
  • a method for producing butanol-containing fuel comprising a step for producing butanol according to any one of 1 to 6, and a step of adding the obtained butanol to diesel fuel.
  • non-food biomass can be used not only in the lactic acid fermentation process but also in the ABE fermentation process. According to the present invention, non-food biomass can be effectively used in biobutanol production.
  • Certain embodiments of the present invention can increase the maximum butanol production concentration in biobutanol production, and can also increase the butanol production rate (expressed in g / l / h as the difference in butanol concentration in the medium per unit time). Can also be raised).
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of substrate re-addition in pH-uncontrolled fed-batch culture using arabinose and lactic acid as substrates. Arabinose and lactic acid were added 6 hours after the start of culture.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of substrate re-addition in pH-uncontrolled fed-batch culture using arabinose and lactic acid as substrates. Arabinose and lactic acid were added at 6 and 12 hours after the start of culture.
  • microorganism belonging to the genus Clostridium that can produce butanol refers to a microorganism belonging to the genus Clostridium that can be fermented with ABE or butanol / isopropanol unless otherwise specified.
  • Clostridium Saccharomyces Pell butylacetamidinato two-cam Clostridium saccharoperbutylacetonicum
  • Clostridium based Jefferies Rinki Clostridium beijerinckii
  • Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum
  • Clostridium Saccharomyces aceto Breakfast Chile cam (Clostridium saccharoacetobutylicum )
  • Clostridium Ouran Restorative Chile cam (Clostridium aurantibutyricum), including Clostridium Pasutsuriaumu (Clostridium pasteurianum), Clostridium Suporogenzu (Clostridium sporogenes), Clostridium Kadaberisu (Clostridium cadaveris), Clostridium Te Tano morph Interview um (Clostridium tetanomorphum). Clostridium aceto
  • Clostridium saccharoperbutylacetonicum Clostridium beijerinckii or strain belonging to Clostridium acetobutylicum, for example, high butanol producing strain in which Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 strain (ATCC 13564) and, NCIMB8052 strain Clostridium beijerinckii the whole genome is deciphered And Clostridium acetobutylicum IFO13498 strain can be preferably used.
  • Each is commercially available.
  • the “microorganism belonging to the genus Clostridium capable of producing butanol” of the present invention is a microorganism obtained by transforming a wild-type microorganism belonging to the genus Clostridium by gene manipulation or the like, but can also produce butanol. Or as long as it has a metabolic pathway with acetic acid as an intermediate product. For example, by constructing an expression vector in which a denatured protein is restored to a plasmid that can be replicated in an acetone-butanol-ethanol producing bacterium and the molecular chaperone gene that restores its function is cloned, overexpression of the chaperone gene results in butanol production.
  • the amount is reported to increase (Tomas CA, Welker NE, Papoutsakis ET., Appl Environ Microbiol. 69 (6): 4951-4965 (2003)).
  • the “microorganism belonging to the genus Clostridium capable of producing butanol” of the present invention includes such a thing.
  • the “microorganism belonging to the genus Clostridium capable of producing butanol” of the present invention is also a gene encoding an enzyme having acetyl-CoA acetyltransferase activity derived from a microorganism belonging to the genus Clostridium , an enzyme having ⁇ -hydroxybutyl-CoA dehydrogenase activity , A gene encoding an enzyme having 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase activity, a gene encoding an enzyme having butyryl-CoA dehydrogenase activity, a gene encoding an enzyme having butyrylaldehyde dehydrogenase activity, and butanol Transformants obtained by introducing a gene encoding an enzyme having dehydrogenase activity into various host microorganisms (JP 2009-39031 A), and a) acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA, b) acetoacetyl-CoA
  • a recombinant microbial host cell comprising a DNA molecule, wherein said at least one DNA molecule is heterologous to said microbial host cell, said microbial host cell producing 1-butanol (WO2007 / 041269 (Special Table 2009-509541)).
  • Known methods can be used for genetic manipulation. For example, methods for introducing and expressing various microorganism vectors and foreign genes are described in various experimental documents (Sambrook, J. & Russel, DW Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition) CSHL Press, 2001). Or Ausubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987, etc.), vector selection, gene introduction, and expression can be performed accordingly.
  • butanol refers to 1-butanol unless otherwise specified.
  • butanol may be produced with acetone and / or ethanol.
  • the environment for butanol production of the present invention includes arabinose and / or xylose and lactic acid as substrates.
  • the term “medium” refers to a culture medium or reaction medium for artificial maintenance, growth or growth of microorganisms, unless otherwise specified. To do.
  • “arabinose” may be L-form, D-form, or a mixture thereof unless otherwise specified. The same applies to xylose and glucose. In the present invention, L-arabinose and / or D-xylose can be preferably used.
  • the term “as a substrate” includes that component in an amount (concentration) that the microorganisms can serve as a nutrient source, unless otherwise specified. It means that.
  • arabinose and xylose as substrates may be obtained by saccharification of hemicellulose contained in non-food biomass.
  • Non-food biomass will be described later.
  • Means for saccharification of hemicellulose can be broadly divided into (1) saccharification by acid hydrolysis (sulfuric acid, dilute acid, etc.), (2) saccharification by enzyme, and (3) saccharification by supercritical water. Any of them can be applied to the present invention.
  • the environment may contain carbohydrates other than arabinose and / or xylose.
  • carbohydrates are glucose, mannose, fructose, galactose, trehalose, mannitol, lactose, maltose, salicin, cellobiose, rhamnose, ribose, starch (soluble starch, sago starch, tapioca starch, corn starch, potato starch, wheat Mention may be made of various edible and non-edible saccharides having hexoses or pentoses as constituent units, such as starch, sorghum starch, dextrin, xylan and the like.
  • lactic acid lactic acid, IUPAC name is 2-hydroxypropanoic acid. Also referred to as ⁇ -hydroxypropanoic acid)”, unless otherwise specified, D-lactic acid, L-lactic acid, and mixtures thereof
  • the term “mixture” of D-form and L-form refers to optical purity (also referred to as enantiomeric excess unless otherwise specified). Lactic acid is less than 99% (subtracting the amount of the smaller substance from the amount of the one and dividing by the total amount of the substance) . The mixture includes racemic, which is an equal mixture of D-lactic acid and L-lactic acid. Body (optical purity 0).
  • the merits of adding lactic acid compared to the addition of butyric acid are 1) low price, and 2) lactic acid is more expensive than butyric acid from fermentation production. Since it is obtained at a concentration, it can be easily handled as a raw material for biobutanol.
  • the merit of adding lactic acid compared to the addition of butyric acid is that when a microorganism belonging to the genus Clostridium metabolizes lactic acid, the reducing power necessary for butanol synthesis can be supplied at the same time.
  • the concentration of arabinose in the initial environment is, for example, 2.5 to 50 g / l, preferably 5 to 40 g / l. More preferably, it is 10 to 30 g / l.
  • the lactic acid concentration in the initial medium is, for example, 0.5-30 g / l, preferably 1-20 g / l, more preferably 2.5-15 g / l.
  • the molar ratio of arabinose to lactic acid is, for example, 20: 0.5-20, preferably 20: 1-18, and more preferably 20: 3-15.
  • the xylose concentration in the initial environment is, for example, 2.5 to 50 g / l, preferably 5 to 40 g / l, more preferably 10 to 30 g / l.
  • the concentration of lactic acid in the initial medium is, for example, 0.5 to 30 g / l, preferably 1 to 15 g / l, more preferably 2.5 to 7.5 g / l.
  • the molar ratio of xylose and lactic acid is, for example, 20: 0.5-20, preferably 20: 1-15, more preferably 20: 2-10.
  • Clostridium microorganisms may contain various other nutrients in addition to arabinose and / or xylose and lactic acid.
  • the following can be used as a culture medium or reaction solution for Clostridium microorganisms.
  • PG medium Add about 1L of distilled water to 200g of chopped potatoes, boil on low heat for 30-40 minutes, and filter with double gauze. Glucose is added to the filtrate to 20 g / l, and then made up to 1 L with distilled water.
  • TYA medium glucose 4%, monopotassium phosphate 0.05%, magnesium sulfate heptahydrate 0.03%, iron sulfate heptahydrate 0.001%, ammonium acetate 0.3%, yeast extract 0.2%, tryptone 0.6%
  • TY medium Bactotryptone 1%, Bacto yeast extract 1%, Sodium chloride 0.5%, pH 7.0
  • the cultivation of Clostridium microorganisms for butanol production in the present invention is not particularly limited in the supply method of the medium solution, and the fed-batch method is also applied by a batch method (nutrients are first added to the environment and thereafter are not replenished).
  • a batch system a liquid containing a medium component is fed continuously or intermittently without extracting the medium.
  • the maximum butanol production concentration was increased by fed-batch culture.
  • those skilled in the art can appropriately design various conditions such as components to be added during the culture, the amount thereof, and the timing of addition.
  • one or more of the substrates can be added one to several times over the culture period in an amount sufficient to return to the initial concentration.
  • the pH of the environment may be controlled.
  • the pH can typically be set within the range of 4.5 to 6.5, preferably 5.0 to 6.0.
  • sodium hydroxide (NaOH), sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ), sodium carbonate (Na 2 CO 3 ), potassium hydroxide (KOH), which are easily dissolved in water And potassium carbonate (K 2 CO 3 ) and the like can be used.
  • pH-stat culture when controlling the pH of the environment, pH-stat culture (when the pH of the environment exceeds or falls below a certain value, a predetermined solution is supplied and the pH is controlled by 7.0 °) may be used.
  • a mixed solution of lactic acid and sugar may be used.
  • the culture temperature can be 30 ° C. to 37 ° C., which is usually the optimum temperature for Clostridium microorganisms, and the culture time can be several hours to several days, for example, 1 to 3 days. If necessary, the stirring operation may be performed in an incubator.
  • the lactic acid in the present invention may be a lactic acid fermentation product using lactic acid bacteria and / or an acetic acid fermentation product using acetic acid bacteria.
  • lactic acid bacteria in the present invention, unless otherwise specified, produces a large amount of lactic acid (fermented carbohydrate and 50% or more of the acid produced), and propagates well in a medium containing carbohydrate, Gram-positive It refers to a group of fungi that are not motile and do not produce spores.
  • the lactic acid bacteria referred to in the present invention are microorganisms belonging to the genus Lactobacillus , microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium , microorganisms belonging to the genus Enterococcus , microorganisms belonging to the genus Lactococcus , and pediococcus. It includes microorganisms obtained from the genus ( Pediococcus ) and microorganisms belonging to the genus Leuconostoc .
  • Lactic acid bacteria include a homolactic fermentation type that produces lactic acid according to a homofermentation formula for glucose and a heterolactic fermentation type that produces lactic acid and acetic acid according to a heterofermentation formula, both of which can be applied to the present invention. it can.
  • the homo-fermentation type it is preferable to apply one that ferments lactic acid, which is a mixture of D-form and L-form.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention comprises a step of producing lactic acid and / or acetic acid using a lactic acid bacterium capable of homo-type lactic acid fermentation and capable of producing L-lactic acid and D-lactic acid, or a lactic acid bacterium capable of hetero-type lactic acid fermentation; glucose
  • butanol is produced by culturing microorganisms belonging to the genus Clostridium in a medium containing lactic acid and / or acetic acid as a substrate.
  • a practical butanol production system from non-food biomass can be constructed by combining lactic acid fermentation and the butanol production method of the present invention.
  • the present inventors have found microorganisms that produce lactic acid from cellooligosaccharides, xylan that is the main component of hemicellulose, xylooligosaccharides, microorganisms that produce lactic acid and acetic acid from xylose, and the lactic acid fermentation product butanol of these microorganisms. Expected to be used for production.
  • biomass refers to a recyclable organic resource derived from living organisms excluding fossil resources, unless otherwise specified.
  • any biomass raw material that can be used as a raw material for lactic acid fermentation can be used without being limited to the place of occurrence, the current use situation and the form.
  • biomass raw materials include sugar cane, rice, corn, sweet potato, rapeseed, peanut, soybean, bacus, leaf stem, rice straw, rice husk, wheat straw, golf course, etc. , Oil palm trees, sawmill waste (e.g.
  • millwood, sawdust, bark construction waste (wood waste), waste paper, animal manure, slaughterhouse residue, fishery processing residue, biomass organic sludge generated as waste, pulp waste liquid, Includes food processing residues, used food oil, food waste, sewage sludge, shellfish, kelp, and phytoplankton.
  • food biomass meal means a biomass raw material that can be used as human or livestock food, unless otherwise specified.
  • Food biomass includes sugar cane, rice, corn, and sweet potatoes.
  • non-food biomass refers to biomass raw materials other than food unless otherwise specified. In the present invention, it is preferable to apply a non-food biomass raw material.
  • Non-food biomass that includes hemicellulose and generates arabinose and / or xylose by saccharification can be applied to the present invention. Examples of such non-food biomass are woody and lignocellulosic biomass.
  • Lactic acid fermentation from xylose K. Tanaka, A. Komiyama, K. Sonomoto, A. Ishizaki, SJ Hall and PF Stanbury.: Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1, Appl.Microbiol.Biotechnol., 60 (1-2), 160-167 (2002.10)
  • Lactic acid fermentation from xylooligosaccharides Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis, J.
  • Yamamoto and K. Yamasato. Halolactibacillus halophilus gen. Nov., Sp. Nov. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria containing a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 2427-2439 (2005) Regarding acetic acid fermentation from non-biomass raw materials, the following documents can be referred to.
  • Cai S, Dong X . Cellulosilyticum ruminicola gen. Nov., Sp.
  • the present invention in which lactic acid is added as a substrate for butanol production is a method of continuously extracting butanol by a gas-stripping method in a continuous fermentation method (Bioprocess and Biosystems Engineering, 27, 207-214., 2005), Clostridium bacteria method for producing an immobilized to butanol (Pakistan Journal of Biological Sciences, 9 , 1923-1928, 2006, and Applied Biochemistry and Biotechnology, 113-116, 887-898 , 2004), high of Clostridium bacteria in the continuous fermentation It can also be applied to a technology for recycling bacterial cells (Journal of Biotechnol, 120, 197-206, 2005) using concentrated bacterial cells.
  • the butanol obtained by the present invention can be used by adding to gasoline or diesel fuel.
  • diesel fuel refers to a type of light oil refined from crude oil and used for diesel engine fuels unless otherwise specified. Diesel fuel may simply be labeled “light oil”.
  • the butanol obtained by the present invention can be isomerized into iso-butanol and tert-butanol, and can be used as a raw material for various chemically synthesized substances such as isoprene, isobutene and butene.
  • the culture medium / reaction solution composition used in the examples is shown.
  • PG medium composition Potato 150 g / l, ammonium sulfate 0.50 g / l, glucose 10 g / l, calcium carbonate 3.0 g / l
  • TYA medium composition yeast extract 2 g / l, tryptone 6.0 g / l, ammonium acetate 3.0 g / l, iron sulfate heptahydrate 10 mg / l, potassium dihydrogen phosphate 0.50 g / l, magnesium sulfate 7 water Japanese 0.30 g / l TY medium composition (see Non-Patent Document 2): Yeast extract 2 g / l, tryptone 6.0 g / l, ammonium sulfate 2.5 g / l, iron sulfate heptahydrate 10 mg / l, potassium dihydrogen phosphate 0.50 g / l, magnesium sulf
  • Method Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) was used as an ABE-producing bacterium, and culture was performed by the following method.
  • (1) Refreshed with PG medium for 24 hours (specifically, PG medium inoculated with 3 g of spore-containing sand was boiled in a boiling water bath for 1 minute to germinate the spores. The cells were cultured for 24 hours at 30 ° C. under the same conditions as in the following examples).
  • 10% of the culture solution of (1) was inoculated into TYA medium and pre-cultured for 15 hours.
  • 10% of the culture solution of (2) was inoculated into TYA medium, and after 19 hours of main culture, the cells were collected to obtain high-density cells.
  • Example 1 Examination of mixed substrate of monosaccharide derived from non-food biomass and lactic acid
  • Culture was performed using a mixed substrate of monosaccharide (arabinose or xylose) obtained from non-food biomass and lactic acid, and compared with the case where a mixed substrate of glucose and lactic acid was used.
  • monosaccharide arabinose or xylose
  • Method Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) was used as an ABE-producing bacterium, and culture was performed by the following method. (1) Refreshed with PG medium for 24 hours. (2) 10% of the culture solution of (1) was inoculated into TYA medium and pre-cultured for 15 hours. (3) 10% of the culture solution of (2) was inoculated into TYA medium, and after 19 hours of main culture, the cells were collected to obtain high-density cells.
  • Example 2 fed-batch culture using non-food biomass-derived monosaccharides
  • Method Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564) was used as an ABE-producing bacterium, and culture was performed by the following method. (1) Refreshed with PG medium for 24 hours. (2) 10% of the culture solution of (1) was inoculated into TYA medium and pre-cultured for 15 hours. (3) 10% of the culture solution of (2) was inoculated into TYA medium, and after 19 hours of main culture, the cells were collected to obtain high-density cells.
  • FIG. 1 shows the results of the system in which the substrate was added once
  • FIG. 2 shows the results of the system in which the substrate was added twice.
  • lactic acid remains considerably in the culture after the first addition of the substrate. Therefore, the addition of the second time causes the lactic acid concentration in the medium to become too high, and the production of butanol is inhibited. It was considered (data not shown). Therefore, the superiority of the system using arabinose which did not show such a course was shown.
  • Example 3 Study on synergistic effect of lactic acid and arabinose
  • Lactic acid alone, arabinose alone, and arabinose + lactic acid were used as substrates, and butanol production was attempted under the same conditions as in Example 1 except for the substrate.
  • non-food biomass can be used not only in the lactic acid fermentation process but also in the ABE fermentation process. According to the present invention, non-food biomass can be effectively used in biobutanol production.
  • butanol production that effectively uses arabinose derived from non-food biomass, which does not depend on glucose, a typical monosaccharide derived from food biomass, sufficient utilization of lactic acid that can be produced from non-food biomass, and simpler Butanol production by simple equipment can be achieved by the present invention.

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Abstract

　本発明は、ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、アラビノース及び／又はキシロース、並びに乳酸及び／又は酢酸を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、ブタノールの生産方法を提供する。本発明の方法により、乳酸を生産する工程のみならず、本来的なブタノールを生産する工程において、非食糧バイオマスが利用可能である。　アラビノースを用いることにより、培地(溶液)中に生産されるブタノールの濃度を高めることができ、またブタノールの生産速度を高めることができる。本発明により、高価な酵素や遺伝子操作のような高度な技術を必要としない、実用的な非食糧バイオマスからのブタノール生産システムを構築することができる。

Description

ブタノールの新規な生産方法
　本発明は、バイオブタノールの生産に関する。より詳細には、非食糧バイオマスを有効に利用して、バイオブタノールを生産する方法に関する。
　Clostridium属微生物により生産されるバイオブタノールは，ポストバイオエタノールとして注目されている。Clostridium属微生物によるバイオブタノール生産は、同時にアセトン及び若干のエタノールも生成することから、アセトン・ブタノール・エタノール発酵(ABE発酵)とも呼ばれる。ブタノールは、エタノールと比較して、エネルギー密度や、低腐食性、低吸湿性であるという物性面での利点を有している。またブタノールは、イソプレン、イソブテン、ブテンなどのさまざまな化学合成物質の原材料となるだけでなく、ガソリン燃料のみならずディーゼル燃料へも添加することができ、用途も幅広い。
　一方でABE発酵は、菌の状態によって代謝物が大きく変化する複雑かつ特異な代謝経路を有している(非特許文献1)。またブタノールが、生産微生物の生育を阻害するために、発酵生産性がエタノールと比較して非常に低く、生産性向上のための技術的課題が多い。本発明者らは、バイオブタノール生産に関し、増殖菌体による酪酸を基質としたpH-stat流加培養による生産システム(非特許文献2)、及び静止菌体による高効率生産システム(非特許文献3)等について報告してきた。
　一方、微生物によるバイオ燃料やバイオマテリアル生産のために、トウモロコシやサトウキビ等の食糧バイオマスを原料として用いると、食糧生産と競合して価格高騰を引き起こすことが問題となっている。これを解決するために、非食糧バイオマスを原料とした物質生産が注目されている。本発明者らは、非食糧バイオマスの利用技術が開発されつつある乳酸発酵に着目し、乳酸発酵とABE発酵とを組み合わせることにより、高価な酵素や遺伝子操作のような高度な技術を必要としない、非食糧バイオマスからの実用的なブタノール生産システムについて報告してきた（非特許文献4～6、並びに特許文献1）。このシステムでは、基質として、グルコースと、乳酸及び／又は酢酸とが用いられる。
特許第4665066号
Jones, D. T. and Woods, D. R. :  Microbiol. Rev., 50, 484-524 (1986) Tashiro, Y. et al. :  J. Biosci. Bioeng., 98, 263-268 (2004) Tashiro, Y. et al. :  J. Biosci. Bioeng., 104, 238-240 (2007) 大城麦人ら、第61回日本生物工学会大会講演要旨集（2009年8月25日）、168頁（講演番号：1Lp19） 田代幸寛ら、生物工学第87巻10号（平成21年10月25日）、484-486頁 Oshiro, M. et al.:  Appl. Microbiol. Biotechnol., 87 (3), 1177-1185 (2010)
　本発明者らのグルコースと乳酸とを用いたブタノール生産システムでは、非食糧バイオマスは乳酸発酵工程で乳酸菌により利用される。しかしながら、ブタノール生産の将来の実用化を見据えた場合、非食糧バイオマスがABE発酵工程でも利用可能となることが望ましい。
　そこで、本発明者らは、非食糧バイオマスの一つ、リグノセルロース系バイオマスの糖化により得られうるアラビノース又はキシロースと、乳酸との混合基質を用いてClostridium属微生物の培養を行い、これとグルコースと乳酸との混合基質を用いた場合とを、種々の発酵パラメータについて比較した。その結果、アラビノース又はキシロースと乳酸との混合基質を用いた場合、ブタノール生産濃度及び乳酸消費量が、グルコースと乳酸との混合基質を用いた場合よりも高い値を示した。特に、アラビノースを用いた系では、用いたすべての発酵パラメータにおいて、グルコースを用いた系よりも高い値を示した。本発明者らは、このような知見に基づき、本発明を完成した。
　本発明は、以下を提供する：
[1]　ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、
　アラビノース及び／又はキシロース、及び乳酸を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、ブタノールの生産方法。
[2]　Clostridium属に属する微生物が、Clostridium saccharoperbutylacetonicum(クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム)、 Clostridium beijerinckii(クロストリジウム・ベージェリンキー)、又はClostridium acetobutylicum(クロストリジウム・アセトブチリカム)である、1に記載の生産方法。
[3]　環境が、アラビノース及び乳酸を基質として含む、1又は2に記載の生産方法。
[4]　乳酸が、L-乳酸とD-乳酸との混合物である、1～3のいずれか一に記載の生産方法。
[5]　アラビノース及び／又はキシロースが、非食糧バイオマスに由来するものである、1～4のいずれか一に記載の方法。
[6]　乳酸が、非食糧バイオマスから、ホモ型乳酸発酵可能であってL-乳酸とD-乳酸とを生産可能な乳酸菌、又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌により生産されたものである、1～5のいずれか一に記載のブタノールの生産方法。
[7]　1～6のいずれか一に記載のブタノールの生産のための工程、及び
　得られたブタノールをディーゼル燃料へ添加する工程を含む、ブタノール含有燃料の生産方法。
　本発明により、非食糧バイオマスが、乳酸発酵工程のみならず、ABE発酵工程でも利用可能であることが示された。本発明により、非食糧バイオマスをバイオブタノール生産において有効に利用することができる。
　本発明の特定の態様により、バイオブタノール生産において、最大ブタノール生産濃度を向上させることができ、またブタノール生産速度(単位時間当たりの培地中のブタノール濃度の差分として、g/l/hで表してもよい。)を上昇させることができる。
図1は、アラビノースと乳酸とを基質としたpH非制御流加培養における基質再添加の効果を示したグラフである。アラビノース及び乳酸を、培養開始後6時間目に添加した。 図2は、アラビノースと乳酸とを基質としたpH非制御流加培養における基質再添加の効果を示したグラフである。アラビノース及び乳酸を、培養開始後6時間目及び12時間目に添加した。
　［Clostridium属微生物］
　本発明で「ブタノール生産可能なクロストリジウム(Clostridium)属に属する微生物」というときは、特に記載した場合を除き、ABE発酵又はブタノール・イソプロパノール発酵可能な、Clostridium属に属する微生物をいう。「Clostridium属に属する微生物」は、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、クロストリジウム・ベージェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サッカロアセトブチリカム(Clostridium saccharoacetobutylicum)、クロストリジウム・オウランティブチリカム(Clostridium aurantibutyricum)、クロストリジウム・パスツーリアウム(Clostridium pasteurianum)、クロストリジウム・スポロゲンズ(Clostridium sporogenes)、クロストリジウム・カダベリス(Clostridium cadaveris)、クロストリジウム・テタノモルフュウム(Clostridiumtetanomorphum)を含む。Clostridium acetobutylicumは、標準株であるClostridium acetobutylicumATCC824株を含む。
　本発明には、公知のClostridium属に属する微生物を利用することができる。本発明には、公知のClostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium beijerinckii又はClostridium acetobutylicumに属する菌株、例えば、高ブタノール生産株であるClostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4株(ATCC 13564) や、全ゲノムが解読されているClostridium beijerinckii NCIMB8052株、及びClostridium acetobutylicum IFO13498株を好適に用いることができる。それぞれ市販されている。
　本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」は、野生型のClostridium属に属する微生物を、遺伝子操作等により形質転換して得られた微生物も、ブタノールを生成可能であり、乳酸及び／又は酢酸を中間生産物とする代謝経路を有する限り、含む。例えば、アセトン-ブタノール-エタノール生産菌で複製可能なプラスミドに、変性したタンパク質を修復し、機能を回復させる分子シャペロンの遺伝子をクローニングした発現ベクターを構築し、シャペロン遺伝子を過剰発現させると、ブタノール生産量が増加することが報告されている(Tomas CA, Welker NE, Papoutsakis ET., Appl Environ Microbiol. 69(6) : 4951-4965(2003))。本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」はこのようなものも含む。
　本発明の「ブタノール生産可能なClostridium属に属する微生物」はまた、Clostridium属に属する微生物由来の、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及びブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を、種々の宿主微生物に導入した形質転換体(特開2009-39031号公報)、並びに
a)アセチル-CoAからアセトアセチル-CoAへ、b)アセトアセチル-CoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへ、c)3-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトニル-CoAへ、d)クロトニル-CoAからブチリル-CoAへ、e)ブチリル-CoAからブチルアルデヒドへ、及びf)ブチルアルデヒドから1-ブタノールへ、よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのDNA分子を含む組み換え微生物宿主細胞であって、少なくとも1つのDNA分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞が1-ブタノールを生成する、上記組み換え微生物宿主細胞(WO2007／041269(特表2009-509541))も、含む。遺伝子操作には公知の方法を用いることができる。例えば種々の微生物のベクターや外来遺伝子の導入法及び発現法は、種々の実験書に記載されているので(Sambrook, J. & Russel, D. W. Molecular Cloning： A Laboratory Manual(3rd Edition)CSHL Press, 2001、又はAusubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987等)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行なうことができる。
　本発明で「ブタノール」というときは、特に記載した場合を除き、1-ブタノールを指す。本発明においては、ブタノールはアセトン及び／又はエタノールとともに生産されてもよい。
　［ブタノール生産のための環境］
　本発明のブタノール生産のための環境は、基質として、アラビノース及び／又はキシロース、並びに乳酸を含む。
　本発明で「環境(medium, media)」というときは、特に記載した場合を除き、微生物を人工的に維持、発育又は増殖させるための、培地(culture medium)又は反応液(reaction medium)を意味する。
　本発明で「アラビノース」というときは、特に記載した場合を除き、L体であってもよく、D体であってもよく、それらの混合物であってもよい。キシロース及びグルコースについても同様である。本発明へは、L-アラビノース及び／又はD-キシロースを好適に用いることができる。
　本発明で、Clostridium属微生物のための環境に含まれる成分に関し、「基質として」というときは、特に記載した場合を除き、その微生物が栄養源として可能な量(濃度)で、その成分が含まれていることをいう。
　本発明においては、基質となるアラビノース及びキシロースは、非食糧バイオマスに含まれるヘミセルロースの糖化により得られたものであってもよい。非食糧バイオマスについては、後述する。ヘミセルロースの糖化のための手段は、(1)酸加水分解（硫酸、希酸等）による糖化法、(2)酵素による糖化法、及び(3)超臨界水による糖化法に大別できるが、本発明へはいずれも適用することができる。
　環境は、アラビノース及び／キシロース以外の糖質を含んでいてもよい。このような糖質の例は、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンニトール、ラクトース、マルトース、サリシン、セロビオース、ラムノース、リボース、デンプン(可溶性デンプン、サゴデンプン、タピオカデンプン、コーンデンプン、ジャガイモデンプン、小麦デンプン、コウリャンデンプン)、デキストリン、キシラン等、様々な食用及び非食用の、六炭糖又は五炭糖を構成単位とする糖質(saccharides)を挙げることができる。
　本発明で「乳酸(lactic acid、IUPAC名は2-ヒドロキシプロパン酸。α-ヒドロキシプロパン酸ともいう。」というときは、特に記載した場合を除き、D-乳酸、L-乳酸、及びこれらの混合物からなる群から選択されるいずれかを指す。本発明で乳酸に関し、D体とL体との「混合物」というときは、特に記載した場合を除き、光学純度(鏡像体過剰率ともいう。多い方の物質量から少ない方の物質量を引き、全体の物質量で割った値)が99％未満である乳酸をいう。混合物には、D-乳酸及びL-乳酸の等量混合物であるラセミ体(光学純度0)が含まれる。
　なお、Clostridium属微生物を用いたブタノール生産において、酪酸を添加する場合に比較した乳酸添加のメリットは、1) 価格が安価であること、2) 発酵生産からは、酪酸より、乳酸の方が高濃度で得られるため、バイオブタノールの原料として扱い易いことが挙げられる。特に、酪酸添加に比較した乳酸添加のメリットとしては、Clostridium属微生物が乳酸を代謝する場合に、ブタノール合成に必要な還元力も同時に供給できることが挙げられる。
　本発明においては、初発環境(培養又は反応開始時の環境。微生物により成分のいずれも消費されていない。)中のアラビノース濃度は、例えば2.5～50g/lであり、好ましくは5～40g/l、より好ましくは10～30g/lである。初発培地の乳酸濃度は、例えば0.5～30g/lであり、好ましくは1～20g/l、より好ましくは2.5～15g/lである。
　本発明においては、アラビノースと乳酸とのモル比は、例えば20 : 0.5～20であり、好ましくは20 : 1～18であり、より好ましくは20 : 3～15である。
　本発明者らの検討によると、本明細書の実施例で示した条件のほか、アラビノース：乳酸が、20 : 7及び20 : 10の場合にも、ブタノ－ル対糖収率において高い値が得られたことがあった。すなわち、アラビノースを用いる系では、グルコースを用いる系に比較して、乳酸がより消費される傾向がみられることがある。アラビノースを用いる系における乳酸の濃度・比率は、このような傾向を参酌して定めてもよい。
　本発明においては、初発環境中のキシロース濃度は、例えば2.5～50g/lであり、好ましくは5～40g/l、より好ましくは10～30g/lである。初発培地の乳酸濃度は、例えば0.5～30g/lであり、好ましくは1～15g/l、より好ましくは2.5～7.5g/lである。
　本発明においては、キシロースと乳酸とのモル比は、例えば20 : 0.5～20であり、好ましくは20 : 1～15であり、より好ましくは20 : 2～10である。
　なお、アラビノース、キシロース以外のClostridium属微生物が資化可能な糖質を用いる場合には、当業者であれば、グルコース（前掲特許文献1等参照）、アラビノース、キシロースの場合の好適な濃度及び乳酸との比を参考にして、その糖質の環境における適切な濃度及び乳酸との比を、適宜決定することができる。
　Clostridium属微生物のための環境は、アラビノース及び／又はキシロース、並びに乳酸以外に、他の各種栄養素を含んでもよい。Clostridium属微生物のための培地又は反応液としては、下記を使用することができる。
PG培地：細断したジャガイモ200gに、約1Lの蒸留水を加えて30分～40分弱火で煮沸し、二重のガーゼでろ過する。ろ液にグルコースを20g/lとなるように加えた後、蒸留水で1Lとする。
TYA培地：グルコース4％、リン酸一カリウム0.05％、硫酸マグネシウム7水和物0.03％、硫酸鉄7水和物0.001％、酢酸アンモニウム0.3％、酵母エキス0.2％、トリプトン0.6％
TY培地：バクトトリプトン1%、バクトイーストエクストラクト1%、塩化ナトリウム0.5%、pH 7.0
無窒素メディウム(リン酸メディウム)：グルコース2％、リン酸一カリウム0.05％、硫酸鉄7水和物0.001％
　本発明におけるブタノール生産のためのClostridium属微生物の培養は、培地液の供給方式にも特に制限はなく、回分式(栄養分を最初に環境に加え、以後は補給しない。)によっても、流加式(回分式において、培地を抜き出すことなく、培地成分を含む液を連続又は間欠的にフィードする。)によっても実施することができる。本発明者らの検討によると、アラビノースを用いた系では、流加培養により、最大ブタノール生産濃度が上昇した。
　流加培養を行う場合、培養途中で添加する成分、その量、添加の時期等の諸条件は、当業者であれば適宜設計することができる。例えば、培養期間を通じ、基質の1種又はそれ以上を、初発濃度に戻す程度の量、1～数回、添加することができる。
　本発明のブタノール生産においては、環境のpHを制御してもよい。本発明において環境のpH制御を実施する場合、pH は、典型的には4.5～6.5、好ましくは5.0～6.0の範囲内で設定されうる。
　本発明において環境のpHの制御を行う場合、一般的に微生物の培養に用いられる従来技術のpH制御手段を用いることができる。
　酸性側に傾いた環境pH を中和する際には、水に溶解しやすい水酸化ナトリウム（NaOH）、炭酸水素ナトリウム（NaHCO3 ）、炭酸ナトリウム（Na2 CO3 ）、水酸化カリウム（KOH）及び炭酸カリウム（K2CO3 ）等を用いることができる。
　本発明において環境のpHの制御を行う場合、pH-stat培養（環境のpH が一定値を超えた／下回った場合に、所定の溶液を供給し、pHを7.0 制御する）としてもよい。pH-stat培養におけるpH調整のためには、乳酸と糖との混合溶液を用いてもよい。
　本発明者らのこれまでの検討によると、アラビノースと乳酸との混合基質を用いる場合は、設備投資がかかるpH-stat流加培養とするまでもなく、効率的にブタノールを生産しうることが分かっている。また、pH制御（pH 5.5）での流加培養とpH非制御での流加培養との比較では、グルコースを用いた系では前者の結果が優れていたが、アラビノースを用いた系では後者の結果が優れていた。これはおそらく、グルコースの場合、ブタノール生成への代謝転換pHが5.5であるのに対し、アラビノースの場合の代謝転換pHがそれとは異なるからであろう。当業者であれば、このような事項を参酌し、ブタノールの効率生産のための環境pHを適宜設計することができる。
　本発明の実施のための、上記の基質以外の条件に関しては、当業者であれば、従来のClostridium属微生物によるブタノール生産ための条件を応用して、適宜設定することができる。培養温度は、Clostridium属微生物にとって通常最適な温度である、30℃～37℃とすることができ、培養時間は、数時間～数日、例えば、1日～3日とすることができる。必要に応じ、培養器内で攪拌操作を行ってもよい。
　［乳酸発酵等との組み合わせ］
　本発明における乳酸は、乳酸菌を用いた乳酸発酵産物及び／又は酢酸菌を用いた酢酸発酵産物であってもよい。
　本発明で「乳酸菌」というときは、特に記載した場合を除き、多量に乳酸を生産(炭水化物を発酵し、生成する酸の50％以上)すると共に、炭水化物を含む培地によく繁殖し、グラム陽性で、運動性がなく、胞子をつくらない菌群をいう。本発明でいう乳酸菌は、ラクトバシラス(Lactobacillus) 属に属する微生物、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する微生物、エンテロコッカス(Enterococcus) 属に属する微生物、ラクトコッカス (Lactococcus) 属に属する微生物、ペディオコッカス (Pediococcus)属に得する微生物、及びロイコノストック(Leuconostoc)属に属する微生物を含む。
　乳酸菌には、グルコースに対してホモ発酵式に従って乳酸を生成するホモ乳酸発酵型とヘテロ発酵式に従って乳酸及び酢酸を生成するヘテロ乳酸発酵型とがあるが、本発明にはいずれも適用することができる。ホモ発酵型に関しては、D体及びL体の混合物である乳酸を発酵するものを、適用することが好ましい。
　本発明の特に好ましい態様は、ホモ型乳酸発酵可能であってL乳酸とD乳酸とを生産可能な乳酸菌又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌を用いて、乳酸及び／又は酢酸を生産する工程；グルコース、並びに得られた乳酸及び／又は酢酸を基質として含む培地で、Clostridium属に属する微生物を培養してブタノールが生産される。
　乳酸発酵においては非食糧バイオマスの利用技術が開発されつつあるので、乳酸発酵と本発明のブタノール生産方法とを組み合わせることにより、実用的な非食糧バイオマスからのブタノール生産システムを構築することができる。本発明者らは、セロオリゴ糖から乳酸を生産する微生物、ヘミセルロースの主要成分であるキシラン、キシロオリゴ糖、キシロースから乳酸と酢酸を生産する微生物等を見いだしており、これらの微生物の乳酸発酵産物のブタノール生産への利用が期待できる。
　本発明で「バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものをいう。本発明には、発生場所、現在の利用状況及び形態に制限されず、乳酸発酵のための原料として用いることができるあらゆるバイオマス原料を用いることができる。バイオマス原料の例は、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいも、菜種、落花生、大豆、バカス、葉茎、稲わら、もみ殻、麦わら、ゴルフ場などで大量に発生する刈芝、林地残材、間伐材、オイルパーム樹木、製材所の廃材(例えば、端材、おが屑、樹皮)、建設廃材(木屑)、古紙、畜糞尿、屠場残渣、水産加工残渣、廃棄物として発生するバイオマス有機汚泥、パルプ廃液、食品加工残渣、使用済み食糧油、生ごみ、下水汚泥、魚貝類、昆布類、植物プランクトンが含まれる。
　本発明で「食糧バイオマス (原料)」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト又は家畜食糧とすることもできるバイオマス原料をいう。食糧バイオマスは、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいもを含む。
　本発明で「非食糧バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、食糧以外のバイオマス原料をいう。本発明には、非食糧バイオマス原料を適用することが好ましい。本発明へは、非食糧バイオマスのうち、ヘミセルロースを含み、糖化によりアラビノース及び／又はキシロースを生じる非食糧バイオマスを適用することができる。このような非食糧バイオマスの例は、木質系のもの、リグノセルロース系バイオマスである。
　非食糧バイオマス原料からの乳酸発酵に関しては、当業者は、本発明者らの下記の文献を参考にすることができる。
(1) キシロースからの乳酸発酵：K. Tanaka, A. Komiyama, K. Sonomoto, A. Ishizaki, S.J. Hall and P.F. Stanbury. :  Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60(1-2), 160-167 (2002.10)
(2) キシロオリゴ糖からの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto. :  Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis, J. Biosci. Bioeng., 101(5), 415-420 (2006.5.25)
(3) キシロースからの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto. :  Calculation of metabolites from xylose in Lactococcus lactis, J. Biosci. Bioeng., 103(1), 92-94 (2007.1.25)
(4) キシロースからの乳酸発酵：Mugihito Oshiro, Hideaki Shinto, Yukihiro Tashiro, Noriko Miwa, Tatsuya Sekiguchi, Masahiro Okamoto, Ayaaki Ishizaki & Kenji Sonomoto. :  Kinetic modeling and sensitivity analysis of xylose metabolism in Lactococcus lactis IO-1, J. Biosci. Bioeng., 108(5), 376-384 (2009.11.25)
　また、下記の文献も参照することができる。
(5) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：S. Abe and M. Takagi. :  Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Biotechnol. Bioeng., 37, 93-96 (1991)
(6) 同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：K. V. Venkatesh. :   Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid,  Bioresour. Technol., 62, 91-98 (1997)
(7) キシランを直接資化する乳酸菌について：M. Ishikawa, K. Nakajima, Y. Itamiya, S. Furukawa, Y. Yamamoto and K. Yamasato. :  Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 2427-2439 (2005)
　非バイオマス原料からの酢酸発酵に関しては、下記の文献を参考にすることができる。
(8) Cai S, Dong X. : Cellulosilyticum ruminicola gen. nov., sp. nov., isolated from the rumen of yak, and reclassification of Clostridium lentocellum as Cellulosilyticum lentocellum comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60(4), 845-849 (2010)
(9) Yang SJ, Kataeva I, Hamilton-Brehm SD, Engle NL, Tschaplinski TJ, Doeppke C, Davis M, Westpheling J, Adams MW.  :  Efficient degradation of lignocellulosic plant biomass, without pretreatment, by the thermophilic anaerobe "Anaerocellum thermophilum" DSM 6725. Appl Environ Microbiol. Jul; 75(14) : 4762-9(2009).
　［その他］
　本発明者らの検討では、Clostridium属微生物を用いたブタノール生産において、13C安定同位体ですべての炭素を置換した乳酸を用いた場合、分子量が通常より2多い、すなわち13Cを2つ含む分子量76のブタノールの生産が確認された(前掲特許文献1)。ABE発酵の代謝に基づくと、13C3乳酸はピルビン酸を経てアセチルCoAに変換され、グルコース(12C)由来のアセチルCoAと共に、アセトアセチルCoAとなって、最終的には13Cを2つ含むブタノールに変換されると考察される。また、13Cを４つ含む分子量7８のブタノールの生産も確認された (前掲非特許文献6）。
　乳酸をブタノール生産の基質として添加する本発明は、連続発酵法において、gas-stripping法により連続的にブタノールを抽出する方法(Bioprocess and Biosystems Engineering, 27, 207-214.,2005)、Clostridium属細菌を固定化してブタノールを生産する方法(Pakistan Journal of Biological Sciences, 9, 1923-1928, 2006、及びApplied Biochemistry and Biotechnology, 113-116, 887-898, 2004)、連続発酵法においてClostridium属細菌の高濃度菌体を用い、菌体をリサイクルする技術(Journal of Biotechnol, 120, 197-206, 2005)にも適用することができる。
　本発明により得られたブタノールは、ガソリン又はディーゼル燃料に添加して用いることができる。本発明で「ディーゼル燃料」というときは、特に記載した場合を除き、原油から精製される軽油の一種で、ディーゼルエンジンの燃料用途のものをいう。ディーゼル燃料は、単に「軽油」と表示されることもある。
　本発明により得られたブタノールは、異性化して、iso-ブタノール、tert-ブタノールとすることができ、またイソプレン、イソブテン、ブテンなどのさまざまな化学合成物質の原材料とすることができる。
　実施例で用いた培地／反応液組成を示す。
　PG培地組成：ジャガイモ150 g/l、硫酸アンモニウム0.50 g/l、グルコース10g/l、炭酸カルシウム3.0 g/l
　TYA培地組成：イーストエクストラクト2 g/l、トリプトン6.0 g/l、酢酸アンモニウム3.0 g/l、硫酸鉄7水和物 10 mg/l、リン酸二水素カリウム0.50 g/l、硫酸マグネシウム7水和物 0.30 g/l
　TY培地組成(前掲非特許文献2参照)：イーストエクストラクト2 g/l、トリプトン6.0 g/l、硫酸アンモニウム2.5 g/l、硫酸鉄7水和物 10 mg/l、リン酸二水素カリウム 0.50 g/l、硫酸マグネシウム7水和物 0.30 g/l
　リン酸メディウム(前掲非特許文献3参照)：リン酸一カリウム0.50 g/l、硫酸鉄7水和物10 mg/l
　［参考例：グルコース・乳酸混合基質を用いたブタノール生産の培養工学的手法による最適化］
　これまでに我々は、乳酸とグルコースの混合基質からClostridium 属微生物によりブタノールを生産する技術を確立している（前掲特許文献1等）。本実施例では、培養工学的なアプローチにより混合基質からのブタノール生産の最適化を目指した。
　1.方法
　ABE生産菌として、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564)を用い、下記の方法で培養を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした(詳細には、PG培地に、胞子を含む砂3 gを接種したものを1分間沸騰湯浴中で煮て、胞子を発芽させた。これを嫌気的条件下、30℃で、24時間培養した。以下の実施例において同じ。)。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19時間本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 300 ml容三角フラスコの50 mlTY培地に、基質溶液(最終濃度で、20 g/lのグルコース及び5 g/lの乳酸)を30 ml添加し、20 mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約6 g/lとなるように接種して、張り込み量100 mlで培養試験を開始した。流加培養では、培養12時間後に、10 mlの基質溶液(グルコース200 g/l+乳酸50 g/l)を添加した。
(5) サンプリングは、回分培養の場合は0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48時間後、流加培養の場合は0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにてブタノール濃度を分析した。
(7)pH-制御培養においては、pHは、HClを用いてpH5.5 に制御した。
(8)pH-stat培養においては乳酸糖混合基質（200 g/l :  50 g/l）を用いてpHを5.5に制御した。
　2.結果
　結果を下表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　pH制御下で培養途中に基質を添加する流加培養を行うことにより、ブタノール生産濃度が2 g/l以上増加し、最大乳酸消費速度及び最大ブタノール生産速度が約3倍上昇した。また、基質の添加によりpHを制御するpH-stat流加培養を行ったところ、ブタノール生産濃度がさらに約3 g/l増加し、4つのパラメータすべてで最高の値を示した。
　［実施例1：非食糧バイオマス由来単糖と乳酸との混合基質の検討］
　非食糧バイオマスから得られる単糖（アラビノース又はキシロース）と乳酸との混合基質を用いて培養を行い、グルコースと乳酸の混合基質を用いた場合と比較した。
　1.方法
　ABE生産菌として、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564)を用い、下記の方法で培養を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19時間本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 大型試験管中の5 ml TY培地に、3 mlの基質(20 g/lのグルコース、アラビノース又はキシロース及び5 g/lの乳酸 (DL-乳酸。以下の実施例において、特に記載した場合を除き、同じ。)。いずれも最終濃度。)を添加したあと、2 mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約5～10 g/lとなるように接種して、張り込み量10 mlで48時間の回分試験管培養を行った。なお、温度30℃、嫌気的条件で培養を行い、初発pH 5.5でpHコントロールは行わなかった。
(5) サンプリングは0, 48時間後に行った。
(6) HPLCにてグルコース及び乳酸濃度、GCにてブタノール、アセトン、エタノール濃度を分析した。
　2.結果
　結果を下表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　アラビノース又はキシロースと乳酸との混合基質を用いた場合、ブタノール生産濃度及び乳酸消費量は、グルコースと乳酸との混合基質を用いた場合よりも高い値を示した。また、対糖収率は、キシロースを用いた場合はグルコースを用いた場合よりも低かったが、アラビノースを用いた場合は、三者のうちで最も高い値を示した。
　これらの結果から、乳酸との混合基質を用いるブタノール生産系の原料として、非食糧バイオマスが適用可能であることが明らかとなった。さらにアラビノースは、本実施例で評価したすべての発酵パラメータでグルコースよりも高い値を示したことから、本生産系において非常に優れた基質であることが示された。
　［実施例2：非食糧バイオマス由来単糖を用いた流加培養］
本発明者らの検討により、グルコースと乳酸を基質とした場合、培養途中に基質を再添加する流加培養がブタノール生産上有効であることが明らかとなっている（前述の参考例参照）。そこで、アラビノースと乳酸を基質とした場合にも流加培養が有効であるかを検討した。
　1.方法
　ABE生産菌として、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (ATCC 13564)を用い、下記の方法で培養を行った。
(1) PG培地にて24時間リフレッシュした。
(2) (1)の培養液をTYA培地に10%接種し、15時間前培養した。
(3) (2)の培養液をTYA培地に10%接種して19時間本培養した後、集菌し、高密度菌体を得た。
(4) 300 ml容三角フラスコの50 mlTY培地に、基質溶液(最終濃度で、20 g/lのグルコース、アラビノース又はキシロース及び5 g/lの乳酸)を30 ml添加し、20 mlの高密度菌体を乾燥菌体重量で終濃度約6 g/lとなるように接種して、張り込み量100 mlで培養試験を開始した。流加培養では、各回毎に10 mlの基質溶液(グルコース、アラビノース又はキシロース200 g/l+乳酸50 g/l)を添加した。
(5) サンプリングは、適時行った。
(6) HPLCにてグルコース、アラビノース又はキシロース及び乳酸濃度、GCにてブタノール、アセトン、エタノール濃度を分析した。
　2.結果
　結果を下表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　基質を再添加しない回分培養に対し、アラビノースを用いた系では、流加培養により、最大ブタノール生産濃度が上昇した。基質を１回添加した系での結果を図1に、２回添加した系での結果を図2に示した。しかし、グルコースを用いた系では、基質１回添加後の培養では乳酸がかなり残存し、そのため２回目を添加することで培地中の乳酸濃度が高くなりすぎ、ブタノールの生産阻害が起こっていると考えられた(データ非掲載)。したがってこのような経過が見られなかったアラビノースを用いる系の優位性が示された。
　［実施例3：乳酸とアラビノースとの相乗効果に関する検討］
　基質として、乳酸のみ、アラビノースのみ、及びアラビノース＋乳酸を用い、基質以外の点では実施例1と同様の条件でブタノール生産を試みた。
　結果を下表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　基質として乳酸20 g/lを用いた場合、ブタノールはほとんど生産されなかった。一方、アラビノース20 g/lを用いた場合は、5.82 g/l、アラビノース20 g/l＋乳酸5 g/lでは、6.56 g/lのブタノールが生産された。すなわち、混合基質を用いることにより、乳酸のみ、アラビノースのみで得られた効果を足し合わせた以上の相乗的な効果が、得られたといえる。
　本発明により、非食糧バイオマスが、乳酸発酵工程のみならず、ABE発酵工程でも利用可能であることが示された。本発明により、非食糧バイオマスをバイオブタノール生産において有効に利用することができる。
　本発明のアラビノースと乳酸との混合基質を用いる態様においては、グルコースと乳酸との混合基質を用いる場合に比較して、より効率的かつ持続可能なブタノール生産が達成されうる。より詳細には、食糧バイオマス由来の単糖として代表的なグルコースに依存しない、非食糧バイオマス由来のアラビノースを有効に利用したブタノール生産、非食糧バイオマスから生産しうる乳酸の十分な利用、そしてよりシンプルな設備によるブタノール生産が、本発明により達成されうる。

Claims (7)

  1. ブタノール生産可能なClostridium(クロストリジウム)属に属する微生物に、
    　アラビノース及び／又はキシロース、及び
    　乳酸
    を基質として含む環境(medium)で、ブタノールを生産させる工程を含む、
    ブタノールの生産方法。
  2. Clostridium属に属する微生物が、Clostridium saccharoperbutylacetonicum(クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム)、 Clostridium beijerinckii(クロストリジウム・ベージェリンキー)、又はClostridium acetobutylicum(クロストリジウム・アセトブチリカム)である、請求項1に記載の生産方法。
  3. 　環境が、アラビノース及び乳酸を基質として含む、請求項1又は2に記載の生産方法。
  4. 乳酸が、L-乳酸とD-乳酸との混合物である、請求項1～3のいずれか1項に記載の生産方法。
  5. 　アラビノース及び／又はキシロースが、非食糧バイオマスに由来するものである、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　乳酸が、非食糧バイオマスから、ホモ型乳酸発酵可能であってL-乳酸とD-乳酸とを生産可能な乳酸菌、又はヘテロ型乳酸発酵可能な乳酸菌により生産されたものである、請求項1～5のいずれか1項に記載のブタノールの生産方法。
  7. 　請求項1～6のいずれか1項に記載のブタノールの生産のための工程、及び
    　得られたブタノールをディーゼル燃料へ添加する工程を含む、ブタノール含有燃料の生産方法。
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