WO2014141896A1 - セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法 - Google Patents

セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法 Download PDF

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WO2014141896A1
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ethanol
yeast
mass
cellulosic biomass
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宏 長崎
裕也 鈴木
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コスモ石油株式会社
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    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
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    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C13K13/002—Xylose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol by alcohol fermentation using a cellulosic biomass hydrolyzate.
  • Cellulosic biomass is attracting attention as an ethanol production raw material by fermentation of microorganisms from the environmental aspect.
  • agricultural waste such as wood, paper, bagasse (sugar cane squeezed), corn stover (corn core, stem, leaves, etc.) and straw
  • Patent Documents 1 to 3 The use of cellulosic biomass raw materials has been studied.
  • A. Petersson et al. ⁇ A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzymes encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance '', Yeast 2006, Vol. 23, p.455-464 J. A. van Maris et al., ⁇ Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae '', Antonie van Leeusenhoek, 2006, Volume 90, p.391-418 E. Palmqvist and B. Hahn-Hagardal, ⁇ Fermentation of lignocellulosic hydrolysate. II: inhibitors and mechanisms of inhibition '', Bioresource Technology, 2000, Vol. 74, p.25-33
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing ethanol even when a fermentation inhibitor is present in a cellulosic biomass hydrolyzate.
  • the present inventor has identified, using yeast belonging to Candida intermedia, in a method for producing ethanol using a fermentation liquid containing a cellulosic biomass hydrolyzate. It is possible to maintain efficient production of ethanol even when there is a fermentation inhibitor derived from cellulosic biomass hydrolyzate in the fermentation liquid by fermenting under the aeration conditions of The headline and the present invention were completed.
  • the present invention provides the following [1] to [3].
  • a cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution is prepared under the conditions that the air supply rate into the fermenter is 0.0001 to 100 L / hour / g dry cell weight.
  • a method for producing ethanol wherein the yeast is fermented using yeast belonging to (1).
  • the fermentation according to [1], wherein the fermentation is a continuous method in which a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is fed into the fermentor at a feed rate of 0.0002 to 2 L / hour / g dry cell weight. Ethanol production method.
  • the method for producing ethanol according to [1] or [2], wherein the yeast belonging to Candida intermedia is a yeast named 4-6-4T2 and deposited as FERM BP-11509.
  • ethanol can be efficiently produced from a cellulosic biomass hydrolyzate containing a fermentation inhibitor.
  • Acetic acid 0.3% by mass (0.050 mol / L), levulinic acid 0.3% by mass (0.026 mol / L) and formic acid 0.2% by mass (0.043 mol / L) were added to the fermentation liquid, It is a figure which shows ethanol concentration time-dependent change at the time of making ethanol produce by each yeast.
  • Add 0.22% by mass of furfural (0.023 mol / L) or 0.68% by mass (0.054 mol / L) of HMF to the fermentation liquid, and use Candida Intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509).
  • yeast belonging to Candida intermedia is used.
  • the yeast is not particularly limited as long as it belongs to Candida intermedia, such as Candida intermedia “NBRC10601” available from National Institute of Technology and Evaluation (NITE). It may be a Candida intermedia mutant.
  • the Candida intermedia “4-6-4T2” obtained by the present inventor by naturally mutating Candita intermedia “NBRC10601” as a parent strain according to a conventional method and selecting a strain having higher ethanol production ability than the parent strain.
  • the 4-6-4T2 has the ability to efficiently produce ethanol from glucose and xylose in a short time in the presence of glucose and xylose.
  • coexistence with glucose and xylose means that 4-6-4T2 coexists in a raw material liquid (fermentation liquid) containing at least glucose and xylose.
  • the conventional yeast has insufficient xylose consumption efficiency, or has ethanol-producing ability from either glucose or xylose, but when both glucose and xylose are present, catabolite repression Xylose was hardly consumed until glucose was completely consumed, but 4-6-4T2 was able to efficiently remove ethanol from both in a short time even when both glucose and xylose were present. Have the ability to produce.
  • 4-6-4T2 efficiently produces ethanol from a raw material liquid containing glucose and xylose in a short time, but at this time, almost no xylitol as a by-product is produced.
  • 4-6-4T2 has the same properties as the parent strain except for the ability to produce ethanol from such sugars.
  • yeasts which can produce ethanol from a cellulosic biomass hydrolyzate Pichia stipitis, Candida shihatae (Candida shehatae), Pachisolen tanofilus (Pacysolen tannofilus), etc. are also known. These yeasts can produce ethanol by consuming xylose which is difficult to consume among saccharides in cellulosic biomass hydrolyzate. However, since these yeasts cannot produce sufficient ethanol in the presence of fermentation inhibitors contained in cellulosic biomass hydrolysates, these yeasts can be used in place of yeasts belonging to Candida intermedia used in the present invention. Even if it does, efficient ethanol production cannot be achieved like this invention.
  • a cellulose biomass hydrolyzate is contained as a carbon source.
  • the cellulosic biomass refers to biomass containing cellulose and hemicellulose.
  • Glucose is obtained by hydrolysis of cellulose in such biomass, while glucose, xylose, mannose, and galactose are obtained by hydrolysis of hemicellulose.
  • sugar in a cellulose biomass hydrolyzate changes with kinds of cellulose biomass, all contain glucose, xylose, mannose, and galactose.
  • cellulose-based biomass that is a raw material for hydrolysis
  • agricultural residues rice straw, wheat straw, bagasse, corn stover, etc.
  • forestry residues timber, etc.
  • the cellulosic biomass hydrolyzate used in the present invention refers to a product obtained by hydrolyzing cellulosic biomass by dilute sulfuric acid method or hydrothermal decomposition method.
  • the cellulosic biomass is dried and then pulverized, and distilled water and sulfuric acid (0.2 to 0.5% by mass) are added thereto so that the weight becomes 10 times, and 190 ° C. Hydrolysis at ⁇ 210 ° C for 5-10 minutes (PM.
  • a saccharified solution suitable for ethanol production can be obtained by hydrolyzing cellulosic biomass at 190 ° C to 210 ° C for 5 to 10 minutes. (Id.).
  • Cellulose biomass hydrolyzate contains furan compounds such as furfural and 5-hydroxymethylfurfural (HMF), weak acids such as acetic acid, formic acid, and levulinic acid as fermentation inhibitors generated during the hydrolysis process. It is.
  • the typical content of a typical fermentation inhibitor in a cellulosic biomass hydrolyzate is, for example, 0.0 to 0.05 mol / L for furfural or HMF, and is 0.00 for acetic acid, formic acid, or levulinic acid. It is about 0 to 0.15 mol / L (HBKlinke et al. “Inhibiton of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66 vol. P.10-26).
  • these fermentation inhibitors are weak acids such as acetic acid, for example, even if they are present in the fermentation solution at about 0.02 mol / L, usually the ethanol production efficiency is remarkably lowered, but the ethanol production method of the present invention is used. In that case, even if a weak acid as a fermentation inhibitor is present at 0.02 mol / L or more, it hardly affects the ethanol production efficiency, and even if it exists at 0.04 mol / L or more, it is efficient without any problem. Ethanol production can be performed. On the other hand, if it exceeds 0.20 mol / L, the ethanol production efficiency is likely to be affected.
  • the ethanol production efficiency is usually significantly reduced.
  • the ethanol production method of the present invention Even if 0.01 mol / L or more of a furan compound is present as a fermentation inhibitor, ethanol production efficiency is hardly affected, and even if 0.02 mol / L or more is present, efficient ethanol is satisfactory. Production can be done. On the other hand, if it exceeds 0.10 mol / L, the ethanol production efficiency tends to be affected, so that it is preferably 0.10 mol / L or less, more preferably 0.070 mol / L or less, and 0.040 mol / L. It is particularly preferred that In addition, the said content is content of the sum total of all the furan compounds.
  • the ethanol production method of the present invention can naturally produce ethanol well even under conditions that do not contain weak acids or furan compounds, but it can produce ethanol well from cellulosic biomass hydrolysates despite the presence of fermentation inhibitors.
  • the fermentation solution contains 0.02 mol / L to 0.15 mol / L of weak acid and / or 0.01 mol / L to 0.10 mol / L of furan compound. It is preferable. Further, it is more preferable that the weak acid is contained in the fermentation liquid at 0.04 mol / L to 0.12 mol / L and / or the furan compound is contained at 0.02 mol / L to 0.07 mol / L.
  • fermentation production of ethanol is performed using the fermentation liquid containing the cellulosic biomass hydrolyzate, and the content of the cellulosic biomass hydrolyzate in the fermentation liquid is Although it can be selected as appropriate, it is more preferably 0.1 to 20% by mass, in terms of total monosaccharides based on the total amount in the fermentation liquid before being put into the fermenter, and 0.5 to 15% by mass. More preferably, the content is 1 to 10% by mass.
  • Preferred sugar concentrations are 0.1 to 10% by mass for xylose, preferably 0.5 to 5% by mass, and 0.0 to 15% by mass for glucose and other hexoses in total. Is in the range of 0.5 to 5% by mass.
  • the fermentation liquid used for ethanol production of the present invention may contain necessary components as appropriate in addition to the cellulose-based biomass hydrolyzate.
  • saccharides such as glucose, mannose, galactose and xylose may be contained as a carbon source other than the cellulosic biomass hydrolyzate.
  • the concentration of monosaccharides is preferably 0.1 to 10% by mass in total with saccharides derived from cellulosic biomass hydrolyzate, and is preferably 1 to 5% by mass. More preferably.
  • nitrogen sources such as amino acids, urea, polypeptone, and amino acid-free nitrogen base, yeast extract and the like may be added.
  • the yeast is also extracted when the fermentation solution containing ethanol in the culture tank is extracted, and it is necessary to grow the yeast in the fermentation tank. Therefore, when continuous fermentation over a long period of time is performed, it is preferable to appropriately include such components so as to be suitable for yeast growth.
  • the air supply rate must be 0.0001 to 100 L / hour / g dry cell weight. Outside this range, ethanol production efficiency will be reduced.
  • the air supply rate is preferably 0.005 to 100 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.005 to 10 L / hour / g dry cell weight, and 0.005 to 1.0 L / hour / g dry.
  • the cell weight is preferred.
  • the air supply rate is preferably 0.005 to 1.0 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.005 to 0.5 L / hour / g dry cell weight, 0.005 to 0.10 L / hour / g dry cell weight is more preferable, and 0.005 to 0.05 L / hour / g dry cell weight is particularly preferable.
  • the air supply rate is preferably 0.05 to 100 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.05 to 10 L / hour / g dry cell weight, and 0.10 to 1.0 L.
  • the weight of dried cells / hour / hour is more preferable, and the weight of dried cells of 0.10 to 0.5 L / hour / g is particularly preferable.
  • the air is the atmosphere, which is 1/5 of the oxygen supply amount.
  • the ethanol production method of the present invention may be carried out by a batch fermentation method or a continuous fermentation method. However, according to the present invention, since the problems of ethanol production in the continuous fermentation method can be improved, it is carried out by a continuous fermentation method. It is preferable.
  • the present invention is carried out by a continuous fermentation method, it is preferable to supply the cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution into the fermenter at a supply rate of 0.0002 to 2 L / hour / g dry cell weight. This supply rate is preferably 0.005 to 0.5 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.01 to 0.05 L / hour / g dry cell weight.
  • the fermentation liquid is extracted at the same rate as the supply of the fermentation liquid.
  • ethanol production by the continuous fermentation method is superior in that there is no switching of such processes, but conditions suitable for ethanol fermentation are often adopted rather than conditions suitable for growth.
  • the growth of the yeast is suppressed, the yeast cannot be grown so as to supplement the yeast continuously extracted as the fermentation broth in the fermenter, the yeast concentration is reduced, and the ethanol production efficiency is also lowered. Therefore, in order to maintain high ethanol production efficiency by a normal continuous fermentation method, it is often necessary to supplement yeast.
  • the balance between yeast growth and ethanol fermentation by the grown yeast can be effectively balanced, and efficient ethanol production can be maintained without additional supply of yeast during continuous fermentation. can do.
  • batch fermentation with varying growth and ethanol production concentrations may not be suitable for ethanol fermentation with yeast using cellulosic biomass hydrolysates.
  • the growth and ethanol production concentrations are kept almost constant, so the coenzyme production concentration is also constant, and there is no excess or deficiency in the supply of these coenzymes. This is because it is difficult to receive and ethanol can be produced efficiently.
  • more preferable conditions for the ethanol production method of the present invention are an air supply rate of 0.05 to 100 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.05 to 10 L / hour / g dry cell weight, more preferably.
  • the concentration of yeast during ethanol production is preferably adjusted to 0.5 to 5% by mass based on the dry cell weight. In the batch fermentation method, the concentration may be adjusted in the growth step before the ethanol fermentation step.
  • the pre-cultured yeast is inoculated so as to be within this concentration range before the start of the culture, or after the inoculation, the yeast concentration may be multiplied by about twice, and during ethanol production, What is necessary is just to adjust so that it may become the range of this density
  • the temperature during ethanol production is preferably 20 to 35 ° C.
  • the following steps are used to adjust the amount of bacterial cells to a preferred concentration prior to ethanol production in the batch fermentation method, the pre-culture performed prior to the continuous fermentation method or the batch fermentation method, and the continuous fermentation method. It can be performed under such conditions.
  • the medium contains a cellulosic biomass hydrolyzate as a carbon source, glucose and one or more sugars selected from mannose, galactose, and xylose, and further suitable amino acids, urea, polypeptone, amino acids suitable for growth
  • a nitrogen source such as a nitrogen-free nitrogen base or a yeast extract or the like can be used.
  • the concentration of monosaccharides is preferably 0.1 to 10% by mass in total, and more preferably 1 to 5% by mass.
  • the amount used is preferably 20% by volume or less of the medium volume, and more preferably 10% by volume or less.
  • the temperature is preferably 10 ° C. to 37 ° C., more preferably 25 ° C. to 30 ° C.
  • the pH is preferably 4 to 7, more preferably 4.5 to 6.5.
  • pre-culture is performed under aerobic conditions, it is more preferable to perform the culture at 5-6.
  • the efficient ethanol production in the present invention means that a fermentation yield of 70% by mass or more is achieved within 24 hours from the start of fermentation in the batch fermentation method, and 24 hours from the start of fermentation in the continuous fermentation method. It means that 70 mass% or more is maintained in fermentation yield after that.
  • the acclimatized strain solution was diluted 1000 times and applied to a medium of YNB agar medium (glucose: 5%, yeast extract: 1%, amino acid-free yeast nitrogen base: 2%, agar: 2%) at 25 ° C. After culturing for 4 days, a strain having formed a colony was obtained.
  • Candida intermedia 4-6-4T2 strain This strain has been deposited with the Patent Organism Depositary Center (NITE) of the National Institute for Product Evaluation Technology (NITE), and the deposit number is FERM BP-11509.
  • Example 1 Candida Intermedia NBRC10601 or Candida Intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) was added to YNB medium (2% glucose and 1% xylose, 2% yeast nitrogen base (without amino acids), 1 % Yeast extract) and precultured at a temperature of 30 ° C. and a pH of 5.5 to 6 (no adjustment) for 48 hours. Thereafter, a simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (glucose 3% by mass, xylose 2% by mass, acetic acid 0.5% by mass (0.08 mol / L), 0.05M phosphate buffer, pH 5.5) Bacteria were added to 2% by mass (corresponding to dry cell weight).
  • YNB medium 2% glucose and 1% xylose, 2% yeast nitrogen base (without amino acids), 1 % Yeast extract
  • the simulated cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 1 contains glucose and xylose, which are typical sugars in cellulosic biomass hydrolysate, and is also contained in cellulosic biomass hydrolyzate.
  • a fermentation inhibitor As a fermentation inhibitor, acetic acid is contained, and a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is simulated.
  • ethanol was produced by batch fermentation without supplying the fermentation liquid and extracting the fermentation liquid, that is, without using the continuous fermentation method. For comparison, ethanol production was performed with an air supply of 0 L / hour / g dry cell weight.
  • Example 2 Candida intermedia NBRC10601 or Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) is pre-cultured under the same conditions as in Example 1, and then a simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (Glucose 3%, xylose 2%, acetic acid 0.3% by mass (0.05 mol / L), furfural 0.1% by mass (0.010 mol / L), 5-hydroxymethylfurfural (HMF) 0.1% by mass (0.008 mol / L), 0.05M phosphate buffer solution, pH 5.5) was added with a bacterium so as to be 2% by mass (corresponding to dry cell weight).
  • a simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation solution Glucose 3%, xylose 2%, acetic acid 0.3% by mass (0.05 mol / L), furfural 0.1% by mass (0.010 mol / L), 5-hydroxymethylfurfural (HMF) 0.1% by mass (0.008 mol / L),
  • the simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 2 contains glucose and xylose, which are typical sugars in the cellulose-based biomass hydrolyzate, and the cellulose-based biomass hydrolyzate contains The fermentation inhibitor contains acetic acid, furfural, and HMF, and simulates a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate.
  • ethanol was produced by batch fermentation without supplying the fermentation liquid and extracting the fermentation liquid, that is, without using the continuous fermentation method. For comparison, ethanol production was performed with an air supply of 0 L / hour / g dry cell weight.
  • Example 3 Candida intermedia NBRC10601 or Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) is pre-cultured under the same conditions as in Example 1, and then a simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (Glucose 3% by mass, xylose 2% by mass, acetic acid 0.3% by mass (0.050 mol / L), levulinic acid 0.3% by mass (0.026 mol / L), formic acid 0.2% by mass (0.043 mol) / L), 0.05 M phosphate buffer solution, pH 5.5) was added with a bacterium so as to be 2 mass% (corresponding to dry cell weight).
  • a simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation solution Glucose 3% by mass, xylose 2% by mass, acetic acid 0.3% by mass (0.050 mol / L), levulinic acid 0.3% by mass (0.026 mol / L), formic acid 0.2% by mass (0.043 mol) / L
  • the simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 3 contains glucose and xylose, which are typical sugars in the cellulose-based biomass hydrolyzate, and contains the cellulose-based biomass hydrolyzate.
  • the fermentation inhibitor acetic acid, levulinic acid, and formic acid are contained, and a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is simulated.
  • ethanol was produced by batch fermentation without supplying the fermentation liquid and extracting the fermentation liquid, that is, without using the continuous fermentation method. For comparison, ethanol production was performed with an air supply of 0 L / hour / g dry cell weight.
  • Example 4 After pre-culturing Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) under the same conditions as in Example 1, a simulated cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (glucose 3 mass%, xylose Bacteria were added to 2% by mass (corresponding to dry cell weight) to 2% by mass, furfural 0.22% by mass (0.023 mol / L), 0.05M phosphate buffer, pH 5.5). Using this, ethanol production was performed with an air supply amount of 0.01 L / h / g dry cell weight, and the change in ethanol concentration with time was measured.
  • a simulated cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (glucose 3 mass%, xylose Bacteria were added to 2% by mass (corresponding to dry cell weight) to 2% by mass, furfural 0.22% by mass (0.023 mol / L), 0.05M phosphate buffer, pH 5.5).
  • ethanol production was performed with an air supply amount of
  • simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 4 contains glucose and xylose, which are typical sugars in the cellulose-based biomass hydrolyzate, and also contains the cellulose-based biomass hydrolyzate.
  • a fermentation inhibitor furfural or HMF is contained, and a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is simulated. Further, in this ethanol production, ethanol was produced by batch fermentation without supplying the fermentation liquid and extracting the fermentation liquid, that is, without using the continuous fermentation method. For comparison, ethanol production was performed with an air supply of 0 L / hour / g dry cell weight.
  • Example 5 After pre-culturing Candida intermedia NBRC10601 under the same conditions as in Example 1, fermentation liquid containing simulated cellulose biomass hydrolyzate (glucose 3 mass%, xylose 2 mass%, acetic acid 0.5 mass% (0.08 mol / L), 0.05 M phosphate buffer solution, pH 5.5) was added to 0.36 L so as to be 2% by mass (7.2 g (dry cell weight)). Using this, the supply rate of the fermentation liquid was 0.015 L / hour, the extraction rate of the fermentation liquid was 0.015 L / hour, the air supply amount was 0 L / hour / g dry cell weight, 0.17 L / hour.
  • simulated cellulose biomass hydrolyzate glucose 3 mass%, xylose 2 mass%, acetic acid 0.5 mass% (0.08 mol / L), 0.05 M phosphate buffer solution, pH 5.5
  • the simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 5 contains glucose and xylose, which are typical sugars in the cellulose-based biomass hydrolyzate, and in the cellulose-based biomass hydrolyzate.
  • acetic acid is contained, and a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is simulated.
  • Example 6 After pre-culturing Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) under the same conditions as in Example 1, a simulated cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (glucose 3 mass%, xylose 2% by mass, 0.5% by mass of acetic acid (0.08 mol / L), 0.05M phosphate buffer, pH 5.5) 0.36 L, 2% by mass (equivalent to 7.2 g dry cell weight) was added as follows. Using this, the supply rate of the fermentation liquid was 0.015 L / hour, the extraction rate of the fermentation liquid was 0.015 L / hour, the air supply amount was 0 L / hour / g dry cell weight, 0.17 L / hour.
  • a simulated cellulosic biomass hydrolyzate-containing fermentation solution (glucose 3 mass%, xylose 2% by mass, 0.5% by mass of acetic acid (0.08 mol / L), 0.05M phosphate buffer, pH 5.5) 0.
  • the simulated cellulose-based biomass hydrolyzate-containing fermentation liquid of Example 6 contains glucose and xylose, which are typical sugars in the cellulose-based biomass hydrolyzate, and the cellulose-based biomass hydrolyzate contains As a fermentation inhibitor, acetic acid is contained, and a fermentation liquid containing cellulosic biomass hydrolyzate is simulated.

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Abstract

　セルロース系バイオマス加水分解物中に発酵阻害物質が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産する方法の提供。　セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を、発酵槽内へのエア供給速度が０．０００１～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量となる条件下で、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いて発酵させることを特徴とするエタノールの生産方法。

Description

セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法
　本発明は、セルロース系バイオマス加水分解物を用いアルコール発酵によりエタノールを生産する方法に関する。
　セルロース系バイオマスは、環境面から微生物の発酵によるエタノール生産原料として注目されている。特に、最近では未利用バイオマスの有効活用という観点から、木材、紙類、あるいはバガス（サトウキビの搾りかす）、コーンストーバー（トウモロコシの芯、茎、葉等）並びにワラ類のような農業廃棄物等のセルロース系のバイオマス原料の利用が検討されている（特許文献１～３）。
　ところで、セルロース系バイオマスを用いて微生物の発酵によってエタノールを生産するためには、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースや、ヘミセルロース、これらの一部分解物である多糖類を分解し、六炭糖であるグルコース、マンノース及びガラクトースや五炭糖であるキシロースを主成分とする糖化液を得、この糖化液中の糖を微生物の発酵に供する必要がある。そして、かかるセルロース系バイオマスの分解方法としては、酵素法と、希硫酸法や水熱分解法などの加水分解法が知られている。この内、酵素法での糖化は、糖化液にフルフラール、５－ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、酢酸、ギ酸、レブリン酸の過分解物を生成しないが、多種類かつ多量の酵素が必要であり、工業化にはコスト面で課題がある。一方、希硫酸法や水熱分解法などの加水分解法はコスト面では優位であるものの、フルフラール、５－ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、酢酸、ギ酸、レブリン酸などの弱酸など種々の過分解物（副生成物）を生成し、これらの副生成物が単糖からのエタノール生産を阻害することが知られている（非特許文献１～３）。
特開２００６－８８１３６号公報 特開２００８－５４６７６号公報 特開２００８－２６０８１１号公報
A. Peterssonら、「A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzymes encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance」、Yeast 2006年、第23巻、p.455-464 J. A. van Marisら、「Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae」、Antonie van Leeusenhoek、2006年、第90巻、p.391-418 E. PalmqvistおよびB. Hahn-Hagardal、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysate. II: inhibitors and mechanisms of inhibition」、Bioresource Technology、2000年、第74巻、p.25-33
　本発明の課題は、セルロース系バイオマス加水分解物中に発酵阻害物質が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産する方法を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、セルロース系バイオマス加水分解物を含有する発酵用液を用いてエタノールを生産する方法において、カンジダ・インターメディアに属する酵母を用いて、特定の通気条件下で発酵することによって、発酵用液中にセルロース系バイオマス加水分解物由来の発酵阻害物質が存在する場合であっても効率的なエタノールの生成を持続することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔３〕を提供するものである。
〔１〕セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を、発酵槽内へのエア供給速度が０．０００１～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量となる条件下で、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いて発酵させることを特徴とするエタノールの生産方法。
〔２〕発酵が、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を０．０００２～２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給する連続法である、〔１〕記載のエタノールの生産方法。
〔３〕カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が、４－６－４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９として寄託された酵母である〔１〕又は〔２〕記載のエタノールの生産方法。
　本発明のエタノールの生産方法によれば、発酵阻害物質が存在するセルロース系バイオマス加水分解物から効率的にエタノールを生産することができる。
発酵用液に酢酸０．５質量％（０．０８mol／L）を添加し、各酵母によりエタノール生産させた時のエタノール濃度経時変化を示す図である。 発酵用液に酢酸０．３質量％（０．０５mol／L）、フルフラール０．１質量％（０．０１０mol／L）およびＨＭＦ０．１質量％（０．００８mol／L）を添加し、各酵母により、エタノール生産させた時のエタノール濃度経時変化を示す図である。 発酵用液に酢酸０．３質量％（０．０５０mol／L）、レブリン酸０．３質量％（０．０２６mol／L）およびギ酸０．２質量％（０．０４３mol／L）を添加し、各酵母により、エタノール生産させた時のエタノール濃度経時変化を示す図である。 発酵用液にフルフラール０．２２質量％（０．０２３mol／L）又はＨＭＦ０．６８質量％（０．０５４mol／L）を添加し、カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）により、エタノール生産させた時のエタノール濃度経時変化を示す図である。 カンジダ・インターメディア　ＮＢＲＣ１０６０１の連続発酵でのエタノール生産濃度経時変化を示す図である。 カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）の連続発酵でのエタノール生産濃度経時変化を示す図である。
（１）酵母
　本発明のエタノールの生産方法では、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が用いられる。該酵母としてはカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母であれば特に限定されず、例えば、独立行政法人　製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）から入手可能なカンジタ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」等であってもよいし、カンジダ・インターメディアの突然変異株であってもよい。その中でも、本発明者がカンジタ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得したカンジダ・インターメディア「４－６－４Ｔ２」と命名し、「ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９」として独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託した酵母（原寄託日，２０１１年９月６日）を用いることが特に好ましい。
　前記４－６－４Ｔ２は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する。ここで、グルコース及びキシロースとの共存下とは、少なくともグルコースとキシロースを含む原料液体（発酵用液）中に４－６－４Ｔ２が共存することを意味する。従来の酵母は、前述のようにキシロースの消費効率が十分でないもの、或いはグルコース又はキシロースのうちいずれか一方からのエタノール生産能を有するものの、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合は、カタボライトリプレッションによりグルコースが完全に消費されるまでキシロースがほとんど消費されないものであったが、４－６－４Ｔ２は、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合であっても、その両方から短時間で効率よくエタノールを生産する能力を有する。
　また、４－６－４Ｔ２は、グルコース及びキシロースを含有する原料液体から短時間で効率良くエタノールを生産するが、このとき副生成物としてのキシリトールがほとんど生成されない。また、４－６－４Ｔ２は、このような糖からのエタノールの生産能力以外については親株と同等の性質を有する。
　なお、セルロース系バイオマス加水分解物からエタノールを生産できる酵母としては、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｈｅｈａｔａｅ）及びパチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｙｓｏｌｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）等も知られている。これら酵母は、セルロース系バイオマス加水分解物中の糖類の中でも消費しづらいキシロースを消費してエタノールを生産することができる。しかしながら、これらの酵母はセルロース系バイオマス加水分解物中に含まれる発酵阻害物質存在下では十分なエタノール生産ができないため、これら酵母を、本発明で用いられるカンジダ・インターメディアに属する酵母に代えて用いたとしても本発明のように効率的なエタノール生産を達成することはできない。
（２）セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液
　本発明のエタノールの生産方法においては、セルロース系バイオマス加水分解物を炭素源として含有する。
　ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースとヘミセルロースを含むバイオマスをいう。斯かるバイオマス中のセルロースが加水分解されることでグルコースが得られ、一方、ヘミセルロースが加水分解されることでグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースが得られる。なお、セルロース系バイオマス加水分解物中の各糖類の含有比率はセルロース系バイオマスの種類によって異なるが、いずれもグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースを含有する。
　本発明においては、加水分解の原料であるセルロース系バイオマスとしては、エタノール生産における経済的優位性の観点から、農業残渣（稲ワラ、麦ワラ等、バガス、コーンストーバー等）、林業残渣（材木等）等から得られるものが好ましい。
　本発明で用いられるセルロース系バイオマス加水分解物とは、セルロース系バイオマスを希硫酸法や水熱分解法などによって加水分解して得られるものを指す。例えば、希硫酸法ではセルロース系バイオマスを乾燥させた後、粉砕し、これに重量が１０倍量になるように蒸留水および硫酸（０．２～０．５質量％）を添加し、１９０℃～２１０℃、５～１０分で加水分解することで（P-M.Bondessonら、「Ethanol and biogas production after steam pretreatment of corn stover with or without the addition of sulphuric acid」、Biotechnol.,for Biofuel.2013年、第6巻、p.1-11）、また、水熱分解法ではセルロース系バイオマスを１９０℃～２１０℃、５～１０分加水分解することで、エタノール生産に適した糖化液を得ることができる（同上文献）。
　セルロース系バイオマス加水分解物中には、加水分解処理に伴って発生する発酵阻害物質として、フルフラール及び５－ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、酢酸、ギ酸及びレブリン酸などの弱酸などが含まれる。代表的な発酵阻害物質のセルロース系バイオマス加水分解物中での通常の含有量は、例えばフルフラールやＨＭＦであれば０．０～０．０５mol／L、酢酸やギ酸やレブリン酸であれば０．０～０．１５mol／L程度である（H.B.Klinkeら「Inhibiton of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass」、Appl.Microbiol.Biotechnol.66巻 p.10-26）。
　これらの発酵阻害物質は、例えば酢酸等の弱酸であれば発酵用液中に０．０２mol／L程度存在しても通常では著しくエタノール生産効率を低下させるが、本発明のエタノールの生産方法を用いた場合には、発酵阻害物質として弱酸が０．０２mol／L以上存在していてもエタノール生産効率にはほとんど影響せず、さらには０．０４mol／L以上存在していても問題なく効率のよいエタノール生産を行うことができる。一方、０．２０mol／Lを超えるとエタノール生産効率に影響しやすくなるため、０．２０mol／L以下であることが好ましく、０．１５mol／L以下であることがより好ましく、０．１２mol／L以下であることがさらに好ましく、０．０８mol／L以下であることが特に好ましい。なお、上記含有量は全ての弱酸の合計の含有量である。
　また、フルフラールやＨＭＦ等のフラン化合物であれば発酵用液中に０．０１mol／L程度存在しても通常では著しくエタノール生産効率を低下させるが、本発明のエタノールの生産方法を用いた場合には、発酵阻害物質としてフラン化合物が０．０１mol／L以上存在していても、エタノール生産効率にはほとんど影響せず、さらには０．０２mol／L以上存在していても問題なく効率のよいエタノール生産を行うことができる。一方、０．１０mol／Lを超えるとエタノール生産効率に影響しやすくなるため、０．１０mol／L以下であることが好ましく、０．０７０mol／L以下であることがより好ましく、０．０４０mol／L以下であることが特に好ましい。なお、上記含有量は全てのフラン化合物の合計の含有量である。
　従って、本発明のエタノール生産方法は、当然、弱酸やフラン化合物を含有しない条件下でも良好にエタノールを生産できるが、発酵阻害物質の存在にもかかわらずセルロース系バイオマス加水分解物から良好にエタノールを生産できるという効果を享受しやすいという観点からは、発酵用液中に弱酸が０．０２mol／L～０．１５mol／L及び／又はフラン化合物が０．０１mol／L～０．１０mol／L含有することが好ましい。さらに発酵用液中に弱酸が０．０４mol／L～０．１２mol／L及び／又はフラン化合物が０．０２mol／L～０．０７mol／L含有することがより好ましい。
　本発明のエタノールの生産方法においては、このセルロース系バイオマス加水分解物を含有する発酵用液を用いてエタノールの発酵生産が行われ、その発酵用液中のセルロース系バイオマス加水分解物の含有量は適宜選択することができるが、発酵槽に投入する前の発酵用液中全量基準、総単糖類換算で０．１～２０質量％であることがより好ましく、０．５～１５質量％であることがさらに好ましく、１～１０質量％であることが特に好ましい。好ましい各糖濃度は、キシロースが０．１～１０質量％、好ましくは０．５～５質量％の範囲内であり、グルコース及びその他の６炭糖が合計で０．０～１５質量％、好ましくは０．５～５質量％の範囲内である。
　本発明のエタノール生産に用いる発酵用液には、セルロース系バイオマス加水分解物の他にも適宜必要な成分を含有していてもよい。例えば、セルロース系バイオマス加水分解物以外の炭素源として、グルコース、マンノース、ガラクトース及びキシロース等の糖類を含有してもよい。別途このような糖類を含有させる場合には、単糖の濃度としては、セルロース系バイオマス加水分解物由来の糖類との合計で０．１～１０質量％とすることが好ましく、１～５質量％とすることがより好ましい。また、アミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源や、酵母エキス等を添加してもよい。なお、後述するように、発酵方式として連続発酵法を用いた場合には、培養槽中のエタノールを含有する発酵液の抜き出し時に酵母も抜き出され、発酵槽内での酵母の増殖が必要となる場合が多いため、長期にわたる連続発酵を行う際には、このような成分を酵母の増殖に適するように適宜含有させることが好ましい。
（３）発酵条件
　本発明のエタノール生産方法においては、エア供給速度を０．０００１～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量とする必要がある。この範囲を外れると、エタノール生産効率が低下してしまう。エア供給速度は、０．００５～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が好ましく、０．００５～１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．００５～１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が好ましい。また、回分発酵法の場合のエア供給速度は０．００５～１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が好ましく、０．００５～０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．００５～０．１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．００５～０．０５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。連続発酵法の場合のエア供給速度は０．０５～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が好ましく、０．０５～１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．１０～１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．１０～０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。ここでエアとは、大気であり、酸素供給量に換算すれば、その１／５である。
　本発明のエタノール生産方法は回分発酵法で行ってもよいし連続発酵法で行ってもよいが、本発明によれば連続発酵法におけるエタノール生産の問題点を改善できるため、連続発酵法で行うことが好ましい。本発明を連続発酵法で行う場合、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を０．０００２～２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給することが好ましい。この供給速度は、好ましくは０．００５～０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、より好ましくは０．０１～０．０５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量である。なお、連続発酵法では、発酵用液の供給と同じ速度で発酵液の抜き出しが行なわれる。
　ここで、セルロース系バイオマス加水分解物を用いる酵母によるエタノール発酵においては、好気的条件下、セルロース系バイオマス加水分解物存在下における酵母の増殖と、嫌気的条件下、セルロース系バイオマス加水分解物存在下における増殖した酵母によるエタノール発酵とが行われる。そのため、回分発酵方法によるエタノール生産においては、かかる酵母の増殖を行う工程と、増殖した酵母によるエタノール発酵を行う工程とを交互に行うことで、それぞれの工程に適合した条件を採用することができる。ただし、工程の切り替え毎にエタノール生産が中断されるという難点がある。
　これに対し、連続発酵方法によるエタノール生産では、このような工程の切り替えがない点で優れているが、増殖に適した条件よりもエタノール発酵に適した条件が採用されることが多い。その結果、酵母の増殖が抑えられ、連続的に発酵液として抜き出される酵母を発酵槽内で補うほどの増殖ができず、酵母濃度が減少し、エタノール生産効率も低下してしまう。そのため、通常の連続発酵法で高いエタノール生成効率を維持するには、酵母を補充する必要が生じることが多い。
　しかし、本発明のエタノール生産方法によれば、酵母の増殖と増殖した酵母によるエタノール発酵とのバランスを有効にとれ、連続発酵中に酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することができる。
　さらに、以下に述べる理由から、セルロース系バイオマス加水分解物を用いる酵母によるエタノール発酵は連続式発酵の方がより適しているといえ、このことからも効率的なエタノールの連続生産が可能となる本発明のエタノール生産方法の意義は大きい。
　すなわち、増殖および発酵工程において、酵母はセルロース系バイオマス加水分解物中に存在する糖以外に発酵阻害物質であるフルフラールやＨＭＦもいっしょに取り込む。取り込まれたこれらの物質は増殖あるいは発酵過程で酵母の細胞内の酵素により、酸化および／または還元され無毒化される。その際、酵素は補酵素（ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ）を必要とするが、補酵素は増殖または発酵過程にともない生成する（非特許文献１）。そのため、増殖およびエタノール生産濃度が変動する回分発酵は、セルロース系バイオマス加水分解物を用いる酵母によるエタノール発酵には適さない場合がある。これに対し、連続発酵では、増殖およびエタノール生産濃度がほぼ一定に保たれるため、補酵素の生成濃度も一定となり、これら補酵素の供給に過不足が生じないため、発酵阻害物質の影響が受けにくく、効率的にエタノールを生産することが可能となるためである。
　かかる観点から、本発明エタノール生産方法のより好ましい条件はエア供給速度０．０５～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、さらに好ましくは０．０５～１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、さらに好ましくは０．１０～１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量であって、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を０．００５～０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、さらに好ましくは０．０１０～０．０５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給する連続発酵法である。
　上記以外の発酵条件については、適宜、選択すればよいが、好ましい条件を挙げると以下の通りである。
　エタノール生産中の酵母濃度は、乾燥菌体重量で０．５～５質量％に調整することが好ましい。回分発酵法においては、エタノール発酵工程前の増殖工程においてこの濃度に調整すればよい。連続発酵法においては、培養開始前に前培養した酵母をこの濃度の範囲となるように植菌するか、植菌後、酵母濃度を２倍程度の増殖をともなってもよく、エタノール生産中はセルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液の供給速度（すなわち発酵液抜き出し速度）や酸素濃度等の培養条件を調整しこの濃度の範囲となるように調整すればよい。
　エタノール生産中の温度は、２０～３５℃とすることが好ましい。
　回分発酵法の増殖工程、連続発酵法や回分発酵法の増殖工程に先だって行う前培養、及び連続発酵法においてエタノール生産に先だって菌体量を好ましい濃度に調整するために実施する培養は、次のような条件で行うことができる。培地としては、炭素源としてセルロース系バイオマス加水分解物や、グルコースと、マンノース、ガラクトース及びキシロースから選ばれる１種以上の糖を含有し、さらに、適宜、生育に適したアミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源や、酵母エキス等を含有するものを用いることができる。なお、単糖の濃度としては、合計で０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましいが、セルロース系バイオマス加水分解物を炭素源として用いる場合、斯かる加水分解物の使用量は、培地容量の２０容量％以下が好ましく、１０容量％以下がより好ましい。温度は、好ましくは１０℃～３７℃であり、より好ましくは２５℃～３０℃である。ｐＨは、好ましくは４～７、より好ましくは４．５～６．５である。また、前培養を好気条件で行う場合には５～６で行うことがより好ましい。
　なお、本発明における効率的なエタノール生産とは、回分発酵法では発酵開始から２４時間以内に発酵収率において７０質量％以上達成していることを意味し、連続発酵法では発酵開始から２４時間以降も発酵収率において７０質量％以上を維持していることを意味する。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
参考例１
　以下の手順に従い、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に保存されている酵母カンジタ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として、馴養及び自然変異により４－６－４Ｔ２株を取得した。
　まず、グルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液のｐＨを水酸化マグネシウムにて５．０に調整し、この溶液２０％と液体培地（酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％）８０％を混合した。この混合溶液１０ｍＬにキシロースを１％添加し、酵母カンジタ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を１白金耳植菌し、３０℃で３日間培養し培養液を得た。
　次いで、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液と液体培地を５０％ずつ混合し、この混合液１０ｍＬに上記３日間培養した培養液を１００μＬ添加し、更に７日間培養した。更に、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液８０％と培地２０％を混合し、この混合液１０ｍＬに上記７日間培養した培養液を１００μＬ加え３０日間更に培養し、馴養株液とした。
　上記馴養株液を１０００倍希釈し、ＹＮＢ寒天培地（グルコース：５％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で４日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
　上記取得した株をＹＮＢ寒天培地（トレハロース：２％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で３日間培養した後、コロニーが形成されたのを確認し、４℃で保管した。４℃において拡大したコロニーを選抜し、リン酸緩衝液（キシロース：２．５％、ＫＨ2ＰＯ4：０．１Ｍ、ｐＨ＝５．０、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００６Ｍ）でエタノール生産試験を実施し、親株よりもエタノール生産能の高い株を選抜した。
　このようにして目的とする酵母を選抜し、これをカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）４－６－４Ｔ２株と命名した。本菌株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９である。
実施例１
　カンジダ・インターメディア　ＮＢＲＣ１０６０１または、カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）を、ＹＮＢ培地（グルコース２質量％およびキシロース１質量％、２％酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃、ｐＨ５．５～６（調整なし）で前培養を行った。その後、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３質量％、キシロース２質量％、酢酸０．５質量％（０．０８mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）に２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が０．０１Ｌ／ｈ／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図１に示す。
　なお、実施例１の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
　また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
実施例２
　カンジダ・インターメディア　ＮＢＲＣ１０６０１または、カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）を、実施例１と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３％、キシロース２％、酢酸０．３質量％（０．０５mol／L）、フルフラール０．１質量％（０．０１０mol／L）、５－ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）０．１質量％（０．００８mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）に、２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が０．０１Ｌ／ｈ／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図２に示す。
　なお、実施例２の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸、フルフラール、ＨＭＦを含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
　また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
実施例３
　カンジダ・インターメディア　ＮＢＲＣ１０６０１または、カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）を、実施例１と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３質量％、キシロース２質量％、酢酸０．３質量％（０．０５０mol／L）、レブリン酸０．３質量％（０．０２６mol／L）、ギ酸０．２質量％（０．０４３mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）に２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が０．０１Ｌ／ｈ／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図３に示す。
　なお、実施例３の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸、レブリン酸、ギ酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
　また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
実施例４
　カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）を、実施例１と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３質量％、キシロース２質量％、フルフラール０．２２質量％（０．０２３mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）に２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加した。これを用い、エア供給量が０．０１Ｌ／ｈ／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。また、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液中のフルフラール０．２２質量％に代えて５－ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）０．６８質量％（０．０５４mol／L）を含有させた発酵用液、比較としてこれら発酵阻害物質を含有しない発酵用液をそれぞれ用い、これ以外は同じ条件にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図４に示す。
　なお、実施例４の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としてはフルフラールまたはＨＭＦを含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
　また、このエタノール生産では発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、すなわち連続発酵法は用いずに回分発酵法によってエタノール生産を行った。また、比較としてエア供給を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量としてエタノール生産を行った。
実施例５
　カンジダ・インターメディア　ＮＢＲＣ１０６０１を、実施例１と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３質量％、キシロース２質量％、酢酸０．５質量％（０．０８mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）０．３６Ｌに、２質量％（７．２ｇ（乾燥菌体重量））となるように添加した。これを用い、発酵用液の供給速度を０．０１５Ｌ／時、発酵用液の抜き出し速度を０．０１５Ｌ／時とし、エア供給量を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、０．１７Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量または１．７Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量のいずれかとし、連続発酵法にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図５に示す。
　なお、実施例５の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
実施例６
　カンジダ・インターメディア　４－６－４Ｔ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９）を、実施例１と同様の条件で前培養を行った後に、模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液（グルコース３質量％、キシロース２質量％、酢酸０．５質量％（０．０８mol／L）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）０．３６Ｌに、２質量％（７．２ｇ乾燥菌体重量相当）となるように添加した。これを用い、発酵用液の供給速度を０．０１５Ｌ／時、発酵用液の抜き出し速度を０．０１５Ｌ／時とし、エア供給量を０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量、０．１７Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量または１．７Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量のいずれかとし、連続発酵法にてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。結果は図６に示す。
　なお、実施例６の上記模擬セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液は、セルロース系バイオマス加水分解物中で代表的な糖類であるグルコースとキシロースを含有させ、またセルロース系バイオマス加水分解物中の発酵阻害物質としては酢酸を含有させ、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を模擬したものである。
　図１～図６の結果より、発酵阻害物質を含むセルロース系バイオマス加水分解物を原料とした場合であっても、カンジダ・インターメディアに属する酵母を用い、かつ発酵槽内へのエア供給速度を０．０００１～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量となる条件で発酵すれば、エタノール生産効率が向上することがわかる。また、連続発酵法が特に有用である。

Claims (3)

  1. 　セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を、発酵槽内へのエア供給速度が０．０００１～１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量となる条件下で、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いて発酵させることを特徴とするエタノールの生産方法。
  2. 　発酵が、セルロース系バイオマス加水分解物含有発酵用液を０．０００２～２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給する連続発酵である請求項１のエタノールの生産方法。
  3. 　カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が、４－６－４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５０９として寄託された酵母である請求項１または２に記載のエタノールの生産方法。
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