TWI433935B - 併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法 - Google Patents

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Description

併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法
本發明是有關於一種併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，尤指一種可降低纖維酒精產製程序之種菌培養成本，並達到同時生產木糖醇以增加纖維酒精製程之額外產值者。
按，纖維酒精為今最具潛力取代石化燃料之替代能源，現階段研發重點在於如何降低成本，以符合經濟效益。纖維酒精生產程序大致可分為原料前處理(pretreatment)，糖化(saccharification)，發酵(fermentation)及蒸餾四個主要步驟；在程序設計上則以分開式水解及發酵程序(Separate/Sequential Hydrolysis and Fermentation,SHF)及同步水解發酵程序(Simultaneous Saccharification and Fermentation,SSF)是目前現有且較成熟之纖維素轉化酒精程序。
而一般纖維生質原料主要含有60-80%的纖維素、半纖維素及15-25%的木質素，其中半纖維素需先以前處理程序轉化五碳糖(主要為木糖)後，才能以生物發酵技術將這些單糖進一步發酵為酒精；目前最常使用之酒精發酵菌株為Saccharomyces cerevisiae，因其具有高酒精產率及對環境抑制物有高耐受力，在工業上已有廣泛應用；但因其缺乏木糖代謝能力，使得目前纖維酒精產製程序之五碳糖發酵及六碳糖發酵單元為利用不同發酵菌株分開進行，程序設備多，因此，設備成本高，亦增加原料流失率，不符經濟效益。
然，五碳糖水解液(主要為木糖)之利用除了轉化為酒精外，木糖醇為另一具高經濟價值之選擇，木糖醇是一種天然甜味劑，化學結構為五碳糖醇，甜度相當於蔗糖但熱量低(2.4 kcal/g)，溶於水時具低黏稠度及無熱效應的特性適合廣泛應用於各種食品工業。同時木糖醇亦為人體中正常代謝產物，不需胰島素即可進行代謝，因此可供糖尿病患者使用；此外，木糖醇具抑制「蛀牙細菌」Streptococcus mutans生長的功能，因此也有抗齲齒的效果，由於上述優點，木糖醇需求於全球快速成長，因此木糖轉化木糖醇之應用亦愈受矚目。
雖然木糖醇有眾多發展優點，但仍受其高生產成本而有所限制。傳統木糖醇生產方式是先將木質纖維素水解，再於水解液中純化出木糖，接著利用加氫方式將木糖還原為木糖醇，最後進行結晶程序產出木糖醇。然而木糖純化過程昂貴，且在木糖加氫過程需高溫高壓，並利用金屬鎳作為催化劑，相當昂貴、危險且具環境汙染性，因此這些是木糖醇發展受侷限之因素。為解決傳統木糖醇生產的缺失，利用生物法生產木糖醇之研究陸續浮現。利用生物法生產木糖醇不需純化木糖，是藉由一些天然木糖同化微生物如Candida guilliermondii、Candida parapsilosis及Candida tropicalis等酵母菌或真菌將木糖直接在纖維水解液中利用木糖還原酶轉化為木糖醇，生物轉化的方式除產率較高外，也可免除化學法中木糖醇產物可能受重金屬汙染的風險，以食品添加物的標準而言，生物轉化方式製造的木糖醇產物會是比較安全的。
現階段酒精工業最常使用之發酵菌株為Saccharomyces cerevisiae，因其具有高酒精產率及環境抑制物耐受力，在工業上已有廣泛應用；但因其缺乏木糖代謝能力，使得目前纖維酒精產製程序之五碳糖發酵及六碳糖發酵單元為利用不同發酵菌株分開進行，程序設備多，因此設備成本高，也增加原料流失率，經濟效益低。
目前常見以Pichia sp.作為木糖發酵菌株，因其具有較高之木糖轉化酒精能力，但Pichia sp.對於酒精濃度及環境抑制物之耐受能力低，因而在工業上應用有所限制。在纖維原料經由前處理的過程會隨反應條件的不同而產生若干濃度的醋酸(acetic acid)、糠醛(Furfural)及羥甲基糠醛(Hydroxymethyl furfural)等發酵抑制物(糠醛0.5-2.0 g/L可抑制產率29-95%及生長速率25-99%；羥甲基糠醛1.0-5.0 g/L可抑制產率17-91%及生長速率5-99%)，因此現階段前處理所得之木糖水解液通常亦會經過過鹼化法(Overliming)移除糠醛，將前處理產出之水解液去毒性(Detoxification)，方能使Pichia sp.在後續發酵過程順利進行。但過鹼化法調理過程中，通常會造成木糖損失，同時會產生硫酸鈣污泥，故需投入額外之經費與設備予以處理及處置，使生產成本提高。
木糖醇為今高經濟價值產品，但目前仍受其高生產成本而有所限制。傳統木糖醇生產方式是先將木質纖維素水解，再於水解液中純化出木糖，接著利用加氫方式將木糖還原為木糖醇，最後進行結晶程序產出木糖醇。然而木糖純化過程昂貴，且在木糖加氫過程需高溫高壓，並利用金屬鎳作為催化劑，相當昂貴、危險且具環境汙染性，因此這些是木糖醇發展受侷限之因素。為解決傳統木糖醇生產的缺失，利用生物法生產木糖醇之研究陸續浮現。Saccharomyces cerevisiae在共發酵之基因改良研究上已有許多相關研究發表，但卻未見有在工業規模應用之代表性菌株，可見目前共發酵菌仍有改良之進步空間。
本發明之主要目的係在於，可降低纖維酒精產製程序之種菌培養成本，並達到同時生產木糖醇以增加纖維酒精製程之額外產值。
為達上述之目的，本發明係一種併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其係以未去毒性之纖維木糖水解液作為發酵菌株培養之營養源，進行種菌培養同時生產木糖醇，並於木糖水解液培養後直接進行葡萄糖水解液之酒精發酵。
於本發明之一實施例中，該種菌培養之步驟之前係以雙軸螺旋擠壓混酸搭配熱水溶洗反應槽、稀酸催化反應槽、酸催化蒸汽爆裂系統或相關之稀酸槽作為前處理設備。
於本發明之一實施例中，該木糖水解液係可利用稻稈、蔗渣、芒草、狼尾草、鳳梨皮、柳枝稷、木材、竹子或相關之生質原料經前處理後取得。
於本發明之一實施例中，該未去毒性之木糖水解液需預先添加鹼劑將酸鹼值調整至4.0-7.0之間。
於本發明之一實施例中，該未去毒性之木糖發酵液應額外添加酵母萃取物0.5-1%。
於本發明之一實施例中，該發酵菌株係為基因改良之Saccharomyces cerevisiae ，並包含xyl1 及xyl2 等兩個外源基因。
於本發明之一實施例中，該菌株可在木糖濃度10-80gl-1 進行生長。
請參閱『第1圖～第6－2圖』所示，係分別為本發明之方塊示意圖、本發明不同木糖初始濃度對基因重組菌株ScXR/XDH生產木糖醇之示意圖、本發明不同ScXR/XDH初始菌體濃度對生產木糖醇之示意圖、本發明額外添加酵母萃取物提高ScXR/XDH之木糖利用率之示意圖及本發明纖維葡萄糖水解液發酵測試之示意圖。如圖所示：本發明係一種併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其係以未去毒性之纖維木糖水解液作為發酵菌株培養之營養源，進行種菌培養1，並於木糖水解液12培養後直接進行酒精發酵，而同時生產葡萄糖水解液11，之後再轉化產生酒精21與木糖醇31，其中於種菌培養之前係以雙軸螺旋擠壓混酸搭配熱水溶洗反應槽、稀酸催化反應槽、酸催化蒸汽爆裂系統或相關之稀酸槽作為前處理設備，且該木糖水解液係可利用稻稈、蔗渣、芒草、狼尾草、鳳梨皮、柳枝稷、木材、竹子或相關之生質原料經前處理後取得，而該未去毒性之木糖水解液需預先添加鹼劑將酸鹼值調整至4.0-7.0之間，另該未去毒性之木糖發酵液應額外添加酵母萃取物0.5-1%，再者該發酵菌株係為基因改良之Saccharomyces cerevisiae，並包含xyl1及xyl2等兩個外源基因，而該菌株可在木糖濃度10-80gl-1進行生長。
而於本發明實施時，為建構木糖醇生產菌株，故選殖xyl1,xyl2基因(源自Pichia sp.)，並以同源重組方式將基因嵌入Saccharomyces cerevisiae 20270菌株染色體，最後得到一穩定表現之基因重組菌株ScXR/XDH。今以下列實施例作一說明：
一、以基因重組菌株ScXR/XDH生產木糖醇：
首先以人工合成之木糖溶液為例，說明本發明之Saccharomyces cerevisiae基改菌株於木糖發酵生產木糖醇的結果；先將基改菌株培養於YPD medium(10gl-1 yeast extract,20gl-1 glucose,20gl-1 peptone)，100rpm，30℃，12hr。將10ml種菌移至50ml新鮮人工合成木糖溶液(10gl-1 yeast extract,40gl-1 xylose,20gl-1 peptone)，在250ml瓶杯進行發酵測試，100rpm，30℃；由第2圖結果顯示基改菌株在76小時可幾乎完全消耗木糖約40g，也能生產約23g之木糖醇，木糖醇轉化率約64%。
二、不同木糖初始濃度對基因重組菌株ScXR/XDH生產木糖醇之影響：
以不同木糖濃度之人工合成木糖溶液及纖維木糖水解液為發酵液進行菌株發酵測試；先將基改菌株ScXR/XDH培養於YPD medium(10gl-1 yeast extract,20gl-1 glucose,20gl-1 peptone)，100rpm，30℃，12hr。將10ml種菌轉移至50ml新鮮人工合成木糖溶液(10gl-1 yeast extract,20-70gl-1 xylose,20gl-1 peptone)及纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,23gl-1 xylose(木糖濃度調配為額外添加D-xylose),4 gl-1 arabinose)，在250ml瓶杯進行發酵測試，100rpm，30℃；由第3－1圖及第3－2圖結果顯示基改菌株在人工合成木糖溶液部分，木糖醇產率方面是隨著木糖濃度增加而增加；但在木糖消耗速率方面，40 gl-1濃度之木糖溶液消耗速度最快，在20-40 gl-1之濃度範圍隨木糖濃度增加而增加，然而在40-70 gl-1濃度範圍隨木糖濃度增加而下降，在纖維木糖水解液部分，木糖醇產率方面是隨著木糖濃度增加而增加；但在木糖消耗速率方面無顯著差異。
三、不同ScXR/XDH初始菌體濃度對生產木糖醇之影響：
以含不同ScXR/XDH初始菌體濃度之人工合成木糖溶液及纖維木糖水解液為發酵液進行菌株發酵測試；先將基改菌株ScXR/XDH培養於YPD medium(10gl-1 yeast extract,20gl-1 glucose,20gl-1 peptone)，100rpm，30℃，12hr。將0.5-2.5 gl-1種菌轉移至50ml新鮮人工合成木糖溶液(10gl-1 yeast extract,20gl-1 xylose,20gl-1 peptone)及纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,23gl-1 xylose,4 gl-1 arabinose)，在250ml瓶杯進行發酵測試，100rpm，30℃；由第4－1圖及第4－2圖結果顯示基改菌株在人工合成木糖溶液部分，木糖醇產率隨著木糖濃度增加而下降；但在木糖消耗速率方面無顯著差異。在纖維木糖水解液部分，木糖醇產率隨著木糖濃度增加而增加；但在木糖消耗速率方面無顯著差異。
四、額外添加酵母萃取物提高ScXR/XDH之木糖利用率：
以纖維木糖水解液進行菌株培養及木糖代謝測試；先將基改菌株ScXR/XDH接種於YPD medium(10gl-1 yeast extract,20gl-1 glucose,20gl-1 peptone)，100rpm，30℃，12hr。將0.5gl-1種菌轉移至50ml纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,22.3-22.4gl-1 xylose,4 gl-1 arabinose)及額外添加酵母萃取物之纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,22.3-22.4gl-1 xylose,4 gl-1 arabinose,1% yeast extract)，在250ml瓶杯進行菌種培養及木糖代謝測試，100rpm，30℃；由第5－1圖及第5－2圖結果顯示基改菌株在一般木糖水解液48小時培養後，可消耗木糖約16.6 gl-1，木糖消耗速率約0.35gl-1h-1，木糖醇產率約0.45gg-1，細胞乾重達約7.8gl-1；經由木糖水解液添加酵母萃取物48小時培養後，可消耗木糖約19.7gl-1，木糖消耗速率約0.41gl-1h-1，木糖醇產率約0.52gg-1，細胞乾重達約9.2gl-1。
五、纖維葡萄糖水解液發酵測試：
以纖維木糖水解液進行菌株培養後，將所培養之菌株進行纖維葡萄糖水解液之發酵測試；先將基改菌株ScXR/XDH接種於YPD medium(10gl-1 yeast extract,20gl-1 glucose,20gl-1 peptone)，100rpm，30℃，12hr。將0.5gl-1種菌轉移至50ml纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,22.3-22.4gl-1 xylose,4 gl-1 arabinose)及額外添加酵母萃取物之纖維木糖水解液(6gl-1 glucose,22.3-22.4gl-1 xylose,4gl-1 arabinose,1% yeast extract)，在250ml瓶杯進行菌種培養，100rpm，30℃，24hr。再將10ml木糖水解液培養24hr後之種菌以1:6(v/v)體積比轉移至50ml葡萄糖水解液進行發酵測試，100rpm，30℃；由第6－1圖及第6－2圖結果顯示基改菌株在一般木糖水解液作為種菌培養液，24小時內可消耗葡萄糖約76.2gl-1，葡萄糖消耗速率約3.18gl-1h-1，酒精產率約0.46gg-1，酒精轉化率約89%，細胞乾重達約8.2gl-1。在經以木糖水解液添加酵母萃取物作為種菌培養液，24小時內可消耗葡萄糖約95.9gl-1，葡萄糖消耗速率約4.00gl-1h-1，酒精產率約0.48gg-1，酒精轉化率約92%，細胞乾重達約11.1gl-1。
由以上研究結果說明本發明之Saccharomyces cerevisiae菌株經由基因改良後能代謝木糖並以此為碳源進行生長，且具高木糖醇產率，木糖醇轉化率最高可達81%，且應用於葡萄糖發酵之酒精轉化率亦可達92%。
綜合以上說明，本發明提供了現階段纖維酒精產製程序新的製程選擇，在菌種使用、種菌培養方法及木糖利用上提出減少製程成本之方法，而至少具有下列優點：
本發明主要特色為降低纖維酒精產製程序之種菌培養成本，同時生產木糖醇增加額外產值。
本發明以纖維木糖水解液作為纖維酒精產製程序之種菌培養營養源，減少種菌培養及設備成本，同時木糖水解液不需經過去毒性處理即可培養種菌，亦能減少去毒性程序設備使用。
以Saccharomyces cerevisiae基改菌株作為木糖發酵菌株，只需一套種菌培養設備，相較現階段纖維酒精產製程序之五碳糖發酵及六碳糖發酵單元為利用不同發酵菌株分開進行，需要兩套種菌培養設備才得以同時進行，相較之下本發明有較低之種菌設備成本。
以Saccharomyces cerevisiae基改菌株作為木糖發酵菌株相較於現階段纖維酒精產製程序常用之木糖發酵菌株Pichia sp.有較高之環境耐受能力；木糖水解液不須經由繁複之去毒性步驟即可進行培養及發酵，且具有高木糖醇產率，可降低種菌培養成本外，也可大幅減少木糖水解液去毒性之耗材及設備成本。另S. cerevisiae同時也是美國食品藥物管理局認定安全之食品(Generally recognized as safe,GRAS)，不會危急人類或環境，因此若能以此菌株作為木糖發酵菌株為較佳選擇。
菌株可在人工合成之木糖培養基生長，木糖消耗速率最高可達0.58 gl-1h-1，木糖醇產率最高可達理論值之81%(產率約達0.74 gg-1)，比常見之木糖醇生產菌株菌株如Candida boidinii、Candida guilliermondii、Candida utilis、Candida maltosa等為佳(木糖醇產率多在0.7 gg-1以下)；亦較佳於目前大多數以Saccharomyces cerevisiae基改菌株(產率多在0.3 gg-1以下)。
基改菌株亦可利用未去毒性之稻稈纖維木糖水解液作為培養基(糠醛約0.3-0.6 g/L，羥甲基糠醛約0.7-1.0 g/L)，結果顯示在一般木糖水解液48小時培養後，木糖醇產率約0.45gg-1，木糖消耗速率約0.35gl-1h-1；於木糖水解液添加酵母萃取物48小時培養後，木糖醇產率約0.52gg-1，木糖消耗速率約0.41gl-1h-1，上此結果顯示本發明若在木糖水解液額外添加酵母萃取物，更可提高基改菌株對木糖之利用率。
基改菌株以一般木糖水解液作為種菌培養液進一步發酵葡萄糖水解液結果顯示，24小時內可消耗葡萄糖約76.2gl-1，葡萄糖消耗速率約3.18gl-1h-1，酒精產率約0.46gg-1，酒精轉化率約89%；若以木糖水解液添加酵母萃取物作為種菌培養液，24小時內可消耗葡萄糖約95.9gl-1，葡萄糖消耗速率約4.00gl-1h-1，酒精產率約0.48gg-1，酒精轉化率可達92%，此結果顯示若在木糖水解液添加酵母萃取物，亦可提高基改菌株對葡萄糖之利用率。
綜上所述，本發明併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法可有效改善習用之種種缺點，可降低纖維酒精產製程序之種菌培養成本，並達到同時生產木糖醇以增加纖維酒精製程之額外產值；進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合消費者使用之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
1．．．種菌培養
11．．．葡萄糖水解液
12．．．木糖醇水解液
21．．．酒精
31．．．木糖醇
第1圖，係本發明之方塊示意圖。
第2圖，係本發明以基因重組菌株ScXR/XDH生產木糖醇之示意圖。
第3－1圖及第3－2圖，係本發明不同木糖初始濃度對基因重組菌株ScXR/XDH生產木糖醇之示意圖。
第4－1圖及第4－2圖，係本發明不同ScXR/XDH初始菌體濃度對生產木糖醇之示意圖。
第5－1圖及第5－2圖，係本發明額外添加酵母萃取物提高ScXR/XDH之木糖利用率之示意圖。
第6－1圖及第6－2圖，係本發明纖維葡萄糖水解液發酵測試之示意圖。
1．．．種菌培養
11．．．葡萄糖水解液
12．．．木糖醇水解液
21．．．酒精
31．．．木糖醇

Claims (5)

  1. 一種併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，係以未去毒性之纖維木糖水解液作為纖維葡萄糖水解液酒精發酵之種菌培養營養源，並同時將纖維木糖水解液之木糖轉化為木糖醇，其中，該發酵菌株係為基因改良之Saccharomyces cerevisiae ，並包含xyl1 及xyl2 兩個外源基因。
  2. 依申請專利範圍第1項所述之併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其中，該種菌培養之步驟之前係以雙軸螺旋擠壓混酸搭配熱水溶洗反應槽、稀酸催化反應槽、酸催化蒸汽爆裂系統或相關之稀酸槽作為前處理設備。
  3. 依申請專利範圍第1項所述之併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其中，該木糖水解液係可利用稻稈、蔗渣、芒草、狼尾草、鳳梨皮、柳枝稷、木材、竹子或相關之生質原料經前處理後取得。
  4. 依申請專利範圍第1項所述之併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其中，該未去毒性之木糖水解液需預先添加鹼劑將酸鹼值調整至4.0-7.0之間。
  5. 依申請專利範圍第1項所述之併同培養葡萄糖發酵菌株及生產木糖醇之方法，其中，該菌株可在木糖濃度10-80gl-1 進行生長。
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