JP6097869B1 - エタノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
回分培養は、酵母液に対して糖液を全量添加した後に培養を開始する方式である。発酵阻害物質がなく、糖源がグルコースである場合には、培養液中の糖濃度が高いため、他の培養方式に比べて発酵速度が速いという長所がある。しかし、糖液中に発酵阻害物質が存在すると、発酵開始時の発酵阻害物質濃度が高いために、他の培養方式に比べ発酵速度が遅くなるという課題がある。また、発酵初期は粘度が高く、発生ガス量も多くなるので、発泡が非常に多くなるという問題がある。
[1]キシロース資化能力を有する酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵槽に添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第1の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第2の発酵工程と、を備え、前記第1の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、前記酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない最大の糖消費速度以上(ただし、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない糖消費速度の範囲を除く)、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするエタノールの製造方法。
[2]前記第1の発酵工程において、前記発酵槽に設けた泡検知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する[1]に記載の製造方法
[3]前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記第2の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が1g/L以下になるとき、発酵を終了する[1]〜[3]のいずれか一つに記載の製造方法。
[5]前記第2の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する[1]〜[4]のいずれか一つに記載の製造方法。
[6]前記第2の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が10分前の測定値に対して1.2倍以上になるとき、発酵を終了する[1]〜[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[7]前記糖化液中のフルフラール濃度が500ppm以上1500ppm以下であり、1.0×107CFU/mL以上1.0×108CFU/mL以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が2倍以上25倍以下であるとき、前記第1の発酵工程における発酵時間が10時間以上14時間以下であり、前記第2の発酵工程における発酵時間が22時間以上38時間以下である[1]〜[6]のいずれか一つに記載の製造方法。
[8]前記第1の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する[1]〜[7]のいずれか一つに記載の製造方法。
[9]前記発酵槽が撹拌翼を備える場合に、前記第1の発酵工程において、培養液の液面が前記発酵槽の前記撹拌翼の底面から20cm下から前記撹拌翼の天面から20cm上までを通過するとき、撹拌を停止する[1]〜[8]のいずれか一つに記載の製造方法。
「セルロース」には、6つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素6つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いた農林産物資源、農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等の種類によって異なる。
<第一実施形態>
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第1の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第2の発酵工程と、を備え、前記第1の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下である。
本実施形態の製造方法において、まず、酵母を発酵槽に添加する。続いて、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を調節しながら発酵槽へ添加し、撹拌しながら発酵を行う。前記糖化液の発酵槽への添加は、連続的に行ってもよく、一定の間隔をおいて断続的に行ってもよい。発酵温度は、25℃〜50℃が好ましく、28℃〜35℃がより好ましく、32℃が特に好ましい。また、発酵時間は続く第2の発酵工程と合わせて、24時間〜120時間が好ましく、24時間〜96時間がより好ましく、24時間〜72時間がさらに好ましい。
使用する酵母の量は、酵母の増殖速度、発酵槽の大きさ、最終的に発酵に用いる糖化液の量を元に算出すればよい。
糖化液には、セルロース、ヘミセルロース、単糖(例えば、グルコース、キシロース等)、及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖以外にも、種々の副生成物が含まれている。それら副生成物が発酵工程に悪影響を及ぼさない物質であれば、最後の精製工程において除去すればよいので大きな問題とはならない。しかしながら、前処理の方法によっては、悪影響を及ぼす発酵阻害物質が含まれる。
すなわち、本実施形態において、主に処理対象とする発酵阻害物質は、実質的にセルロース、ヘミセルロース、単糖、及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖との混合溶液を形成しているものであり、通常の固液分離では分離できない、又は、分離し難い状態のものを指す。そのような発酵阻害物質としては、例えば、酢酸、ギ酸、レブリン酸、糖の過分解物であるフルフラール、5−ヒドロキシメチルフルフラール(5−HMF)、リグニン由来の芳香族化合物であるバニリン、アセトバニリン、グアヤコール等が挙げられる。これら発酵阻害物質のうち、代表的な発酵阻害物質はフルフラール及び5−HMFである。
本発明者らは、上記の酵母における発酵阻害機構及び発酵阻害物質の分解機構に着目し、流加培養により糖化液中の発酵阻害物質(主に、フルフラール)の濃度を低く抑えることで、酵母による発酵阻害物質及び糖の分解を同時に行い、さらに回分培養を組み合わせることで、発酵阻害物質が低減された、又は含まれない糖化液中の糖を酵母により分解させて発酵速度を速めることにより、本発明を完成させるに至った。
酵母に対する糖化液の流加速度は、酵母の糖消費速度により調節する。図1の(A)〜(C)は、発酵阻害物質濃度の異なる糖化液における酵母の糖消費速度と流加速度との関係を示すグラフである。図1の(A)は発酵阻害物質濃度が低いときのグラフであり、(B)は発酵阻害物質濃度がやや高いときのグラフであり、(C)は発酵阻害物質濃度が高いときのグラフである。なお、図1の(A)〜(C)は、酵母に対する糖化液の流加速度及び酵母の糖消費速度について、仮説を元に作成した概念図である。
酵母における分解の優先順位としては、発酵阻害物質、グルコース、グルコース以外の糖(例えば、キシロース等)の順番である。以下、説明を簡略化するために、グルコース以外の単糖の代表例としてキシロースを挙げて説明する。
本明細書において、「残糖」とは、酵母による分解が行われず、培養液中に残留する糖を意味する。ここでいう糖は、酵母が分解可能な単糖等の糖であり、グルコース、キシロース等を含む。
さらに、流加速度が(3)の範囲であるとき、酵母により発酵阻害物質は分解されるが、供給される糖化液中のグルコース濃度が酵母のグルコースの消費能力を上回り、グルコースが残留することで、カタボライト抑制によりキシロースの残留量が増加している状態である。また、流加速度が(3)と(4)の間の点であるとき、酵母により発酵阻害物質は分解されるが、グルコースが残留する最小の糖消費速度、すなわち、発酵阻害が生じない最大の糖消費速度となる。
よって、「(1)と(2)の間の点における糖消費速度」=「(3)と(4)の間の点における糖消費速度」である場合、図1(A)に示すように、流加速度の最適範囲は、(2)及び(3)の範囲である。
一方、「(1)と(2)の間の点における糖消費速度」>「(3)と(4)の間の点における糖消費速度」である場合、図示していないが、流加速度の最適範囲は、(2)の範囲と、(3)の範囲の内、(2)と(3)の間のグラフの頂点となる流加速度から、(1)と(2)の間の点における糖消費速度と同じ値の糖消費速度となる流加速度までの範囲とを合わせた範囲となる。
また、「(1)と(2)の間の点における糖消費速度」<「(3)と(4)の間の点における糖消費速度」である場合、図示していないが、流加速度の最適範囲は、(2)の範囲と、(3)の範囲と、さらに、(4)の範囲の内、(3)と(4)の間の点となる流加速度から、(1)と(2)の間の点における糖消費速度と同じ値の糖消費速度となる流加速度までの範囲とを合わせた範囲となる。
従って、発酵阻害物質が低い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度の下限値としては、図1(A)における(1)と(2)の間の点における糖消費速度以上、すなわち、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上であることが好ましい。
また、流加速度に対応する酵母の糖消費速度の上限値としては、図1(A)における(2)と(3)の間のグラフの頂点における糖消費速度以下、すなわち、酵母の最大糖消費速度以下であることが好ましい。
前記糖消費速度が上記下限値及び上限値に挟まれる範囲となるように流加速度を調節することによって、流加培養を用いる第1の発酵工程において、残糖、又は未分解の発酵阻害物質が発生しても、後に続く回分培養を用いる第2の発酵工程において、前記残糖、又は前記未分解の発酵阻害物質を消費することができるため、第1の発酵工程及び第2の発酵工程を通して、酵母による糖消費速度を速く保つことができ、効率的に発酵工程を行うことができる。
よって、発酵阻害物質がやや高い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度としては、図1(B)における(1)と(2)の間の点における糖消費速度以上、すなわち、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることが好ましい。
よって、発酵阻害物質が高い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度としては、図1(C)における(1)と(4)の間のグラフの頂点における糖消費速度、すなわち、酵母の最大糖消費速度であることが好ましい。
上述の速度に調節することにより、高速且つ高収率でリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
中でも、糖消費速度の測定方法としては、ガス分析計(例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等)等を用いて、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、糖消費速度を算出する方法が好ましい。この方法を用いることで、糖濃度を測定する方法と比較して、短時間で正確な制御を行うことができる。さらに、この方法は、オンラインで素早く糖消費速度を算出することができるため、連続的に行われる発酵工程において、原料の違いや前処理条件の変化による糖濃度や発酵阻害物質濃度の変化に応じて、即座に流加速度を修正するができ、発酵速度の最大化を実現できる。
続いて、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により撹拌しながら発酵を行う。発酵温度は、25℃〜50℃が好ましく、28℃〜35℃がより好ましく、32℃が特に好ましい。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中のキシロース濃度としては、1.0g/L以下であることが好ましく、0.5g/L以下であることがより好ましい。
キシロース濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中の二酸化炭素濃度としては、ガス分析計(例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等)等を用いて検知されなくなる程度の低濃度以下であることが好ましい。
二酸化炭素濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中の溶存酸素濃度としては、10分前の測定値に対して、1.2倍以上であることが好ましく、2.0倍以上であることがより好ましい。
溶存酸素濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
前処理工程は、続く糖化工程において、糖化反応を効率的に行うためにリグノセルロース系バイオマスを前処理する工程である。
前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理工程において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも工業利用には安価で手に入りやすい硫酸が特に好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等が挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。事前処理に用いる反応容器には特に限定はないが、耐酸性又は耐アルカリ性を有する加熱圧力容器、若しくは、耐酸性又は耐アルカリ性を有する容器をオートクレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態が考えられる。
糖化工程は、続く発酵工程において、発酵を効率的に行うために、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを糖化する工程である。
糖化工程において、前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する。糖化温度は、45℃〜70℃が好ましく、45℃〜55℃がより好ましく、50℃が特に好ましい。また、糖化時間は12時間〜120時間が好ましく、24時間〜96時間がより好ましく、24時間〜72時間がさらに好ましい。
セルラーゼは、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ(EG)、セロビオハイドロラーゼ(CBH)及びβ−グルコシダーゼ(BGL)の各活性の少なくとも1つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも1つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼの起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のセルラーゼ及びヘミセルラーゼを用いることができる。
精製工程は、第2の発酵工程において得られた発酵液に含まれるリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、前記発酵液を蒸留する方法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
図2は、本発明の第一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
本実施形態の製造装置10は、糖化槽12と発酵槽11とが配管により配設されている。また、前記糖化槽12において得られた糖化液を前記発酵槽11へ送液する配管13と、前記発酵槽11において得られた発酵液を続く精製装置に送役する配管16とが配設されている。さらに、発酵槽11は、ガス分析計14、糖濃度分析計15及び溶存酸素分析計23を備えている。ガス分析計14、糖濃度分析計15及び溶存酸素分析計23は、必須の構成ではなく、いずれも備えていなくてもよく、少なくともいずれか一つを備えていてもよく、図2に示すように全て備えていてもよい。
また、図2に示すように、配管13及び16は、ガス分析計14、糖濃度分析計15及び溶存酸素分析計23を備えていてもよい。
さらに、制御装置18がガス分析計14、糖濃度分析計15、溶存酸素分析計23、ポンプ17a及びポンプ17bに接続している。
糖化槽12の前には、前処理装置が配設されていてもよい。また、発酵槽11の後に続く設備は、発酵液の用途に応じて、適宜選択することができる。例えば、蒸留塔、分離ろ過膜、遠心分離機等の精製装置が配設されていてもよい。
また、図2に示すように発酵槽11はガス分析計14及び糖濃度分析計15を備えているが、ガス分析計14及び糖濃度分析計15のうちいずれか一つを備えていてもよく、両方ともに備えていてもよい。
制御装置18は、例えば、図2に示すように、制御用コンピュータ及びコントローラーから構成されるもの等が挙げられる。
まず、前処理装置を用いて、リグノセルロース系バイオマスを物理的又は化学的な処理を施し、形状を微細化する、又はオリゴ糖に分解する等して糖化酵素処理しやすい状態にする。続いて、前処理済みのリグノセルロース系バイオマスを糖化槽12へ送液し、糖化酵素を用いて、グルコースやキシロース等の単糖又はより小さなオリゴ糖に分解させる。続いて、糖化槽12から発酵槽11へ糖化液の一部を送液し、酵母を添加する。続いて、糖化液を連続的に送液する。このとき、制御装置18を用いて、ガス分析計14又は糖濃度分析計15で測定された値を元に糖消費速度を算出し、糖消費速度が上述の[第1の発酵工程]で示した範囲となるようにモニタリングしながら、ポンプ17aを制御することにより、発酵槽11に送液される糖化液の流加速度を制御し、発酵を行う。続いて、発酵槽11が一定量の糖化液(通常、発酵槽11の容量の80%以上95%以下)で満たされたら、糖化液の送液を停止し、さらに発酵を行う。続いて、制御装置18を用いて、ガス分析計14、糖濃度分析計15、又は溶存酸素分析計23で測定された値から、キシロース濃度、二酸化炭素濃度、又は溶存酸素濃度が上述の[第2の発酵工程]で示した範囲となったとき、発酵を終了することを判断し、撹拌翼による撹拌を停止する。続いて、制御装置18を用いて、ポンプ17bを制御することにより、得られた発酵液の送液速度を制御し、前記発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、蒸留塔等の精製装置へ送液される。
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、前記第1の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する。
また、発酵工程において、好気条件下では、添加された糖が酵母の菌体合成に使われてしまう。そのため、高発酵収率を達成するためには嫌気条件下に保つことが重要となる。本実施形態の製造方法によれば、培養液を嫌気条件下に保つことができ、発酵収率を向上させることができる。
図3は、本発明の第二実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。本実施形態の製造装置20は、配管13が発酵槽11の底面に配設されている点で、図2に示す製造装置10と相違し、その他の構成は製造装置10と同じである。
なお、以下の図3〜7において、図2に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
図3に示す製造装置20は、糖化液の添加が発酵槽11の底面から送液される以外は、図2に示す製造装置10と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、前記第1の発酵工程において、前記培養液の液面が発酵槽の撹拌翼の底面から20cm下から前記撹拌翼の天面から20cm上までを通過するとき、撹拌を停止する。
本実施形態の製造方法において、糖化液の添加は、上述の<第二実施形態>に示す通り、発酵槽内の培養液の液面より下から行ってもよい。
図4は、本発明の第三実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。本実施形態の製造装置30は、フローセル流量計19を備え、前記フローセル流量計19及び発酵槽11の撹拌翼が制御装置18と接続している点で、図2に示す製造装置10と相違し、その他の構成は製造装置10と同じである。また、製造装置30において、図3に示す製造装置20と同様に、配管13が発酵槽11の底面に配設されていてもよい。
<第一実施形態>
一実施形態において、本発明の発酵装置は、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵するための装置であって、少なくとも1つの泡探知機を有する発酵槽と、前記泡探知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する制御装置と、を備える。
発泡は菌の流出につながり、従来では、発酵槽内の液面を低く保つ操作、又は消泡剤の添加、撹拌数の抑制等の対策を行っており、生産能力低下、試薬費の増加や収率低下を引き起こすため、製造コストの増加につながることが課題であった。また、発泡の主な要因としては、酵母による二酸化炭素ガスの合成等が挙げられ、発酵槽内の培養液は粘性が高く、合成された二酸化炭素よる発泡が起きやすい環境となっている。
本実施形態の発酵装置は、酵母による二酸化炭素の合成量が少ない流加培養による発酵に好適に用いられるため、優れた発泡抑制効果を有する。また、本実施形態の発酵装置は、泡高さを指標として流加速度を制御することによりさらに発泡を抑制することができ、上記従来法において課題であった製造コストの低下につながる。
また、制御装置18は、発酵槽11にガス分析計14及び糖濃度分析計15のうち少なくともいずれか一つを備える場合、上述の図1に示す製造装置10と同様に、酵母の糖消費速度による流加速度の制御と組み合わせて、発泡を抑制しながら酵母による最適な糖消費速度となるように、制御を行ってもよい。
また、制御装置18は、発酵槽11にガス分析計14、糖濃度分析計15及び溶存酸素分析計23のうち少なくともいずれか一つを備える場合、上述の図1に示す製造装置10と同様に、ガス分析計14、糖濃度分析計15及び溶存酸素分析計23の測定値から、キシロース濃度、二酸化炭素濃度、又は溶存酸素濃度が上述の[第2の発酵工程]で示した範囲となったとき、発酵を終了することを判断するように、制御を行ってもよい。
また、制御装置18は、発酵槽11内の培養液の液面が撹拌翼の底面より下にある場合、上述の製造装置30における制御装置18と同様に、液面が、好ましくは撹拌翼の底面から20cm下から前記撹拌翼の天面から20cm上までを通過するとき、撹拌翼による撹拌を停止するように制御してもよい。
まず、糖化装置から発酵槽11へ糖化液の一部を送液し、酵母を添加する。続いて、糖化液を連続的に送液する。このとき、制御装置18を用いて、泡探知機22で探知された泡高さをモニタリングしながら、ポンプ17aを制御することにより、発酵槽11に送液される糖化液の流加速度を制御し、培養液の発泡が抑制しながら発酵を行う。続いて、発酵槽11が一定量の糖化液(通常、発酵槽11の容量の80%以上95%以下)で満たされたら、糖化液の送液を停止し、さらに発酵を行う。続いて、発酵終了後、制御装置18を用いて、ポンプ17bを制御することにより、得られた発酵液の送液速度を制御し、前記発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、蒸留塔等の精製装置へ送液される。
一実施形態において、本発明の発酵装置は、さらに、前記発酵槽は、底面、又は発酵開始時の前記糖化液の液面より下の側面に配設された、前記糖化液を前記発酵槽へ送液するための配管を備える。
図6に示す発酵装置200は、糖化液の添加が発酵槽11の底面から送液される以外は、図5に示す発酵装置100と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵することができる。
2本の500mL容量の三角フラスコに、出芽酵母(キシロース資化の遺伝子操作済み)を6.0×107CFU/mL含む酵母液を10mLずつ添加した。続いて、YPDX培地(3%グルコース及び2%キシロースが含有)190mLを培養開始0時間の時点で全量添加し培養を行ったもの(以下、「回分培養」と呼ぶことがある。)と、前記YPDX培地190mLを48時間かけて定速で添加しながら培養したもの(以下、「流加培養」と呼ぶことがある。)と、を準備した。流加培養では、送液ポンプとして、KNF Lab社製のSIMDOS02 FEM1.02KT.18Sを用いた。また、培養装置としては、Bioshaker BR−43FL(TAITEC社製)を用いた。撹拌条件としては、撹拌数60rpm、32℃の条件で、48時間培養を行った。培養開始から12時間毎に、回分培養及び流加培養それぞれから少量のサンプルを採取し、HPLC(島津製作所製、検出器:RID−10A、カラムオーブン:CTO−20A)を用いて、培養液中に含まれるエタノールを検出した。結果を図7に示す。
YPDX培地の代わりに、希硫酸前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液(3%グルコース、2%キシロース及び0.06%フルフラール含有)を180mLずつ用い、6.0×107CFU/mL含む酵母液を20mLずつ用いた以外、参考例1と同様の方法を用いて、回分培養及び流加培養を行った。結果を図8に示す。
2本の500mL容量の三角フラスコに、出芽酵母(キシロース資化の遺伝子操作済み)を6.0×107CFU/mL含む酵母液を10mLずつ添加した。続いて、希硫酸前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液(3%グルコース、2%キシロース及び0.06%フルフラール含有)190mLを48時間かけて定速で添加し培養を行ったもの(以下、「流加培養」と呼ぶことがある。)と、前記酵素糖化液190mLを12時間かけて定速で添加し(前記流加培養の4倍の流加速度で前記酵素糖化液を添加し)、残りの36時間は前記酵素糖化液の添加を行わずに培養を行ったもの(以下、「流加培養+回分培養」と呼ぶことがある。)と、を準備した。流加培養では、送液ポンプとして、KNF Lab社製のSIMDOS02 FEM1.02KT.18Sを用いた。流加培養+回分培養における流加培養では、送液ポンプとして、Cole−Parmer社製のCole−Parmer(登録商標) Masterflex 77521−50を用いた。撹拌条件としては、撹拌数60rpm、32℃の条件で、48時間培養を行った。培養開始から12時間毎に、流加培養及び流加培養+回分培養それぞれから少量のサンプルを採取し、HPLC(島津製作所製、検出器:RID−10A、カラムオーブン:CTO−20A)を用いて、培養液中に含まれるエタノールを検出した。結果を図9に示す。
Claims (9)
- キシロース資化能力を有する酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵槽に添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第1の発酵工程と、
添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第2の発酵工程と、
を備え、
前記第1の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、前記酵母の糖消費速度により調節し、
前記酵母の糖消費速度が、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない最大の糖消費速度以上(ただし、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない糖消費速度の範囲を除く)、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするエタノールの製造方法。 - 前記第1の発酵工程において、前記発酵槽に設けた泡検知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する請求項1に記載の製造方法。
- 前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記第2の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が1g/L以下になるとき、発酵を終了する請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第2の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第2の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が10分前の測定値に対して1.2倍以上になるとき、発酵を終了する請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記糖化液中のフルフラール濃度が500ppm以上1500ppm以下であり、1.0×107CFU/mL以上1.0×108FU/mL以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が2倍以上25倍以下であるとき、
前記第1の発酵工程における発酵時間が10時間以上14時間以下であり、
前記第2の発酵工程における発酵時間が22時間以上38時間以下である請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。 - 前記第1の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記発酵槽が撹拌翼を備える場合に、前記第1の発酵工程において、前記培養液の液面が前記発酵槽の前記撹拌翼の底面から20cm下から前記撹拌翼の天面から20cm上までを通過するとき、撹拌を停止する請求項1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
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