CN107177636A - 一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,其特征在于,在生物反应器中,先在好氧条件下高密度发酵生产酵母,然后向生物反应器中添加木质纤维素和酶制剂,在厌氧条件下同步糖化发酵生产乙醇。包括如下步骤:①酵母高密度发酵:向生物反应器中加入含有葡萄糖的培养基,接种酵母。通气,先分批培养酵母,之后流加葡萄糖溶液,高密度生产酵母。②同步糖化发酵:当酵母达到一定浓度后,向发酵液中加入木质纤维素以及酶制剂。停止通气,进行厌氧同步糖化发酵,生产乙醇。本发明的效果是:乙醇产率大幅度提高,发酵时间大幅度缩短。并且,培养酵母种子液和同步糖化发酵在一个生物反应器中完成,减少了设备投资,提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产乙醇的方法,特别涉及一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,属于生物工程和能源领域。
背景技术
化石能源逐渐枯竭将影响世界能源供应,解决此问题的关键在于开发可再生能源。以木质纤维素为原料,高效地生产清洁燃料,如乙醇、丙醇、丁醇等,可以在一定程度上减少人类对化石能源的依赖。
过去,利用木质纤维素发酵生产乙醇,要先将木质纤维素糖化后,再对糖化后含单糖的水解液进行发酵,这种方式称为分步糖化发酵。分步糖化发酵的缺点是纤维素酶催化纤维素水解反应是一个可逆反应,而单糖的积累使得酶解反应受到抑制,纤维素水解不充分。另外,发酵时,由于单糖浓度过高会使得发酵被抑制。为了防止酶解过程中糖积累抑制酶解,提高纤维素酶的催化水解效率,后来,人们提出了同步糖化发酵方式。同步糖化发酵是指木质纤维素糖化和发酵生产乙醇同时进行,在同步糖化发酵过程中,酶解产生的单糖被酵母同步转化。在同步糖化发酵过程中单糖浓度一直保持在较低水平。这样,可以消除高浓度单糖对酶解的抑制作用。其中,李荣杰等在“一种利用秸秆发酵生产乙醇的方法”的专利中,提供了一种木质纤维素同步糖化、异构化发酵生产乙醇的方法。他们用稀酸或碱溶液对秸秆进行预处理,然后将预处理秸秆放入发酵罐中,加入酶制剂,利用纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶预水解秸秆,之后,按15%接种量接种OD600为6的酿酒酵母种子液,进行同步糖化发酵,最终,乙醇的产率为53.2%(CN 101705255 A);鲁杰等在“利用木质纤维素分批补料半同步糖化发酵制备乙醇的方法”的专利中,先将木质纤维素进行预处理,将预处理木质纤维素、纤维素酶液加入到锥形瓶,摇床振荡预水解,之后,降温,加入活化后的酵母液,同步糖化发酵,所得的乙醇的产率最高为79.1%(CN 103074385 A)。
同步糖化发酵实质上是一个将木质纤维素酶解成单糖和单糖发酵成乙醇的级联反应。对于提高木质纤维素酶解效率的研究很多,主要方法是通过复配纤维素酶以及增加酶的使用量来提高酶解效率(陈朝儒,奚亚军。甜高粱茎汁及茎渣同步糖化发酵工艺优化。2016,32(3):253-258;罗鹏。蒸汽爆破麦草同步糖化发酵转化乙醇的研究。2007,35(12):42-45;张伟。小麦秸秆同步糖化发酵制取燃料乙醇。2012,38(12):50-54),而对于酵母发酵单糖生产乙醇效率方面的研究则长期被忽视。在传统同步糖化发酵过程中,利用木质纤维素作为底物同步糖化发酵生产乙醇,由于酵母量低,致使酵母利用葡萄糖生产乙醇速率低,延长了发酵时间,使得生产成本增加。提高同步糖化发酵体系中初始酵母量,以提高单糖发酵成乙醇速率方面的研究,在国内外尚属空白。
另外,在传统的同步糖化发酵过程中,生产酵母种子液和同步糖化发酵分别在两个生物反应器中进行。一般地,在一个生物反应器中生产酵母种子液后,将酵母接种到另外一个生物反应器中进行同步糖化发酵。而在这种方式中,由于使用两个生物反应器,因此生产成本较高。
发明内容
本发明的目的之一是在于解决同步糖化发酵过程中酵母量不足的问题,提出在生物反应器中,先在好氧条件下高密度发酵生产酵母,然后向生物反应器中添加木质纤维素和酶制剂,在厌氧条件下同步糖化发酵生产乙醇的方法。采用本方法,乙醇产率大幅度提高,发酵时间大幅度缩短。
本发明的另一个目的是针对传统同步糖化发酵方式的不足,即生产酵母种子液与同步糖化发酵分别在两个生物反应器中进行。使用两个生物反应器,成本高,过程繁琐。而采用本发明,培养酵母种子液和同步糖化发酵在一个生物反应器中完成,减少了设备投资,提高了生产效率。
本发明提供了一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵制备乙醇的方法(见图1),所述方法包括如下步骤:
①酵母高密度发酵
向生物反应器中加入含有10-100克/升葡萄糖的培养基,灭菌后,按2%-10%接种量接种酵母。通气,28-37℃发酵培养酵母,当培养基中葡萄糖浓度降低到2克/升以下后,流加50-800克/升的葡萄糖溶液,高密度发酵生产酵母。
②同步糖化发酵
当发酵液中酵母浓度达到5-150克干重/升后,向发酵液中加入10-300克木质纤维素/(升发酵液)以及酶制剂。停止通气,进行厌氧同步糖化发酵,发酵12-144小时,生产乙醇。
本发明所述通气为通入空气或氧气。
本发明所述葡萄糖是商品葡萄糖或由木质纤维素水解所得的葡萄糖水解液。
本发明所述木质纤维素为秸秆、木片、稻草、棉花、纸浆、芦苇、微晶纤维素或羧甲基纤维素的一种或多种。
本发明所述酶制剂含有5-100IU纤维素酶/(克纤维素),5-300U木聚糖酶/(克纤维素),1-300U果胶酶/(克纤维素),1-300Uβ-葡萄糖苷酶/(克纤维素)。
本发明的有益效果是采用酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,乙醇产率达到理论产率的99%以上,乙醇峰值时间从传统同步糖化发酵的72小时提前到24小时,极大地缩短了发酵时间。而且,在本发明中,将生产酵母种子液和同步糖化发酵生产乙醇在一个生物反应器中进行,减少了生产环节,降低了生产成本。
附图说明:
图1为酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇与传统同步糖化发酵工艺的比较图
具体实施方式:
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
下述实施例和对比例中,所使用试剂制备方法如下:
1、本实施例所用培养基为每升含有:酵母粉10克,蛋白胨20克。
2、本实施例所用木质纤维素为玉米秸秆。
3、本实施例所用酵母为哈尔滨马利酵母有限公司生产的酵母。
实施例1:
一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,所述方法包括如下步骤:
1)酵母高密度发酵
向生物反应器中加入含有10克/升葡萄糖的培养基,灭菌后,按5%接种量接种酵母。通气,28℃发酵培养酵母,当培养基中葡萄糖浓度降低到1克/升后,流加500克/升的葡萄糖溶液,高密度发酵生产酵母。
2)同步糖化发酵
当发酵液中酵母浓度达到30克干重/升后,向发酵液中加入3%纤维素含量的秸秆,15FPU/(克纤维素)的纤维素酶,10U/(克纤维素)的木聚糖酶,5U/(克纤维素)果胶酶和30U/(克纤维素)的β-葡萄糖苷酶。停止通气,进行厌氧同步糖化发酵。在发酵24小时后,乙醇浓度达到最大16.81g/L,相当于理论产率的99%。
实施例2:
一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,所述方法包括如下步骤:
1)酵母高密度发酵
向生物反应器中加入含有20克/升葡萄糖的培养基,灭菌后,按10%接种量接种酵母。通气,30℃发酵培养酵母,当培养基中葡萄糖浓度降低到1克/升后,流加600克/升的葡萄糖溶液,高密度发酵生产酵母。
2)同步糖化发酵
当发酵液中酵母浓度达到35克干重/升后,向发酵液中加入3%纤维素含量的秸秆、25FPU/(克纤维素)的纤维素酶,50U/(克纤维素)的木聚糖酶,20U/(克纤维素)果胶酶和50U/(克纤维素)的β-葡萄糖苷酶。停止通气,进行厌氧同步糖化发酵。在发酵24小时后,乙醇浓度达到最大16.98g/L,相当于理论产率的100%。
实施例3:
一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,所述方法包括如下步骤:
1)酵母高密度发酵
向生物反应器中加入终浓度为10克/升葡萄糖的秸秆水解液和培养基,灭菌后,按5%接种量接种酵母。通气,30℃发酵培养酵母,当培养基中葡萄糖浓度降低到1克/升后,流加500克/升的葡萄糖溶液,高密度发酵生产酵母。
2)同步糖化发酵
当发酵液中酵母浓度达到40克干重/升后,向发酵液中加入3%纤维素含量的秸秆,15FPU/(克纤维素)的纤维素酶,10U/(克纤维素)的木聚糖酶,5U/(克纤维素)果胶酶和30U/(克纤维素)的β-葡萄糖苷酶。停止通气,进行厌氧同步糖化发酵。在发酵24小时后,乙醇浓度达到最大16.98g/L,相当于理论产率的100%。
对比例1:
一种传统同步糖化发酵生产乙醇的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)将酵母按5%接种量接种到生物反应器A中,28℃培养酵母,生产酵母种子液。
(2)向生物反应器B中加入3%纤维素含量的秸秆,15FPU/(克纤维素)的纤维素酶,10U/(克纤维素)的木聚糖酶,5U/(克纤维素)果胶酶,30U/(克纤维素)的β-葡萄糖苷酶和pH5.0柠檬酸缓冲液。从生物反应器A中取酵母种子液,按10%接种量接种到生物反应器B中,酵母浓度为1克干重/升。进行厌氧同步糖化发酵。在发酵72小时后,乙醇浓度达到最大11.01g/L,相当于理论产率的65%。
结论:
由实施例1和对比例1的结果可以看出,与传统同步糖化发酵生产乙醇相比,采用高密度发酵耦合同步糖化发酵明显地增加了乙醇的浓度,使得乙醇浓度增加了34%。此外,采用高密度发酵耦合同步糖化发酵使得产乙醇的峰值时间由传统同步糖化发酵的72h提前到24h,明显地缩短了发酵时间。
对比例2:
一种传统同步糖化发酵生产乙醇的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)将酵母按5%接种量接种到生物反应器A中,30℃培养酵母,生产酵母种子液。
(2)向生物反应器B中加入3%纤维素含量的秸秆、25FPU/(克纤维素)的纤维素酶,50U/(克纤维素)的木聚糖酶,20U/(克纤维素)果胶酶,50U/(克纤维素)的β-葡萄糖苷酶和pH5.0柠檬酸缓冲液。从生物反应器A中取酵母种子液,按10%接种量接种到生物反应器B中,酵母浓度为1克干重/升。进行厌氧同步糖化发酵。在发酵72小时后,乙醇浓度达到最大13.12g/L,相当于理论产率的77%。
由实施例2和对比例2的结果可以看出,与传统同步糖化发酵生产乙醇相比,采用高密度发酵耦合同步糖化发酵明显地增加了乙醇的浓度,使得乙醇浓度增加了23%。此外,采用高密度发酵耦合同步糖化发酵使得产乙醇的峰值时间由传统同步糖化发酵的72h提前到24h,明显地缩短了发酵时间。
Claims (5)
1.一种酵母高密度发酵耦合同步糖化发酵生产乙醇的方法,其特征在于,在生物反应器中,先在好氧条件下高密度发酵生产酵母,然后向生物反应器中添加木质纤维素和酶制剂,在厌氧条件下同步糖化发酵生产乙醇。其步骤如下:
①酵母高密度发酵
向生物反应器中加入含有10-100克/升葡萄糖的培养基,灭菌后,按2%-10%接种量接种酵母。通气,28-37℃发酵培养酵母,当培养基中葡萄糖浓度降低到2克/升以下后,流加50-800克/升的葡萄糖溶液,高密度发酵生产酵母。
②同步糖化发酵
当发酵液中酵母浓度达到5-150克干重/升后,向发酵液中加入10-300克木质纤维素/(升发酵液)以及酶制剂,停止通气,进行厌氧同步糖化发酵,发酵12-144小时,生产乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述通气为通入空气或氧气。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述葡萄糖是商品葡萄糖或由木质纤维素水解所得的葡萄糖水解液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述木质纤维素为秸秆、木片、稻草、棉花、纸浆、芦苇、微晶纤维素或羧甲基纤维素的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述酶制剂含有5-100IU纤维素酶/(克纤维素),5-300U木聚糖酶/(克纤维素),1-300U果胶酶/(克纤维素),1-300Uβ-葡萄糖苷酶/(克纤维素)。
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