CN111118071B - 一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

针对现有纤维素乙醇制备技术中所存在的纤维素水解液中抑制物抑制发酵问题、木糖不能全部转化问题、葡萄糖抑制木糖发酵问题、纤维素酶作用温度与微生物发酵温度不一致的问题，本发明提供了一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其包括菌种的培养，木糖发酵、添加纤维素酶、同步糖化发酵等步骤。本发明采用基于一种乙酸和木糖共利用的马克斯克鲁维酵母菌株实现木糖和抑制物的同时利用，免去抑制物脱除的难题；采用高温的同步糖化发酵，免除了纤维素酶与发酵温度不匹配的问题，与现有纤维素乙醇发酵技术相比，实现了生产成本的显著降低。

Description

一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方 法，具体地，其是利用纤维素原料采用两步发酵法生产木糖醇和乙醇的方法。
背景技术
过去三十年来，由于全球工业化快速发展，城市化进程加快，全世界对能源的需求翻倍 [Popp J,Biofuels and Their Co-Products as Livestock Feed:Global Economicand Environmental Implications[J].Molecules,2016,21(3):285.]，不可再生的石油资源面临的枯竭问题也日趋凸 显。其次，化石燃料的燃烧产生大量温室气体，加剧环境污染等问题。截止到2015年，空气 中的CO2浓度较中世纪提高了40％，其中大部分来自于化石燃料的燃烧。对于能源的需求日 益增长，促使人们大力发展绿色可持续的能源。燃料乙醇因具有较高的能量密度、易于运输、 可再生性好等特点成为目前全世界最主要的生物能源之一，也是目前发展最快、应用最成熟 的生物能源。
纤维素原料来源广泛、价格低廉，是生产燃料乙醇的最佳选择。除可降低生产成本外， 还可显著降低温室气体的排放、利于农村经济，提高农民收入。
尽管在全球范围内已经进行了数十年的研发工作(例如中国专利201110304843.7、 201210572124.8、201710181161.9、201711472264.7、201710004115.1、201410765651.X、 201710198921.7、201510081638.7、201710897535.7、201810939170.4)，但仍然缺少具有经 济竞争力的纤维素原料水解和发酵方法。纤维素乙醇的发展面临着一些问题仍未解决，诸如： ①纤维素原料不能被微生物直接利用，需要对原料进行预处理，但是预处理过程产生的抑制 物影响后续发酵。虽然可以通过水解液脱毒的方法来改善，但是提高了生产成本并且产生废 水污染环境；②目前的乙醇生产菌株不能利用纤维素物料中半纤维素的水解物木糖和阿拉伯 糖。虽然通过基因工程的手段改造菌株，使其能够利用木糖，但是重组菌在真实水解液中的 发酵表现不能满足工业生产要求，糖利用率和产物得率较低；③目前最优的发酵工艺为同步 糖化发酵，但菌株的发酵温度与纤维素酶的最适温度差距较大，纤维素酶用量大，成本较高 [Ojeda K,Energy analusis and processintegration of bioethanol production from acid pretreated biomass:comparisionof SHF,SSF and SSCF pathways[J].Chemical Engineering Journal,2011, 176-177(3):195-201.]。
近年来，非传统工业酵母如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)(SilvaGM, Ethanol production from sugarcane bagasse using SSF process andthermotolerant yeast[J]. Transactions of the ASABE,2015,58(2):193-200.8-9)(Cong Du,The production of ethanol from lignocellulosic biomass byKluyveromycesmarxianusCICC 1727-5and Spathasporapassalidarum ATCC MYA-4345。Applied Microbiology and Biotechnology,2019,103:2845–2855)在纤维素乙醇生产领域受到了越来越多的关注。相比于 酿酒酵母S.cerevisiae，这个非传统工业酵母具有良好的乙醇生产应用潜质，表现出显著的 高温、高浓度乙酸、糠醛等多压力耐受性及良好的底物及产物耐受性。我们通过微生物诱变 和长期驯化选育，获得了一种乙酸和木糖共利用的马克斯克鲁维酵母菌株菌株，生物保藏编 号为：CGMCC No.16757(专利CN 109593662 A)。在这基础上，利用该菌株，开发了针 对未脱毒纤维素水解液的两步法发酵，能够将水解液中的木糖转化为木糖醇，将水解液中的 葡萄糖转化为乙醇，解决了水解液中抑制物抑制发酵问题、木糖不能全部转化问题、葡萄糖 抑制木糖发酵问题、纤维素酶作用温度与微生物发酵温度不一致导致用量多等问题。
发明内容
本发明提供了一种能够在未脱毒及高温下条件下发酵纤维素水解液联产木糖醇乙醇和的 方法，提高了糖利用率、降低了纤维素酶用量，大大降低纤维素乙醇生产成本。
本发明的技术方案为：
一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，包括以下步骤：
步骤1)取马克斯克鲁维酵母1727-5菌种进行种子培养、扩大培养；
步骤2)将纤维素物料进行预处理，获得未脱毒纤维素处理液，在未脱毒纤维素处理液 中，料液比为1：3～1：10；
步骤3)将经过步骤1)种子培养、扩大培养后的菌种接种至步骤2)中获得的未脱毒纤维素处理液中进行发酵，其中，初始菌种浓度OD620＝1-20，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，0～2vvm的微量通入无菌空气，以获得木糖醇；
步骤4)步骤3)中进行发酵48-72h后添加纤维素酶，纤维素酶用量10FPU/g～20FPU/g，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，发酵96～144h得到乙醇。
在一个具体的实施方案中，在步骤4)中进行批式补料发酵，以提高终点乙醇浓度：在 添加纤维素酶后每24-48h补加步骤2)中预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖，使预处 理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖在发酵液中的浓度为50-200g/L。
在一个具体的实施方案中，在步骤1)中：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5菌株接种至所述种子液培养基，培养16～24 h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；
扩大培养：将酵母浸粉取10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L以及木糖10g/L经 121℃、20min灭菌制备得到扩培培养基，按接种量5-10％(v/v)将种子培养中获得的菌液 接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速100-300rpm，培养时间36～48h至 菌种浓度达到OD620至2～4。
在一个具体的实施方案中，在步骤2)中所述的纤维素物料选自玉米秸秆、麦秸、灌木 条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理选自碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理中的一种或多种的组合。
在一个具体的实施方案中，步骤3)中，可通过使用螺旋型搅拌桨提高搅拌效率。
在一个具体的实施方案中，步骤4)中，发酵温度为40-50℃。
在一个具体的实施方案中，将经步骤1)扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬， 控制OD620＝1-20并接种至步骤2)中获得的未脱毒纤维素处理液中。
本发明具有以下优点：
1.本发明利用两步法进行未脱毒纤维素原料的发酵，避免了原料的脱毒过程，避免了葡 萄糖对木糖的抑制作用。
2.两步发酵法的第一步是利用稀酸预处理后的带渣物料(含有木糖、纤维素、木质素、 抑制物混合物等)进行发酵，木糖转化成木糖醇，木糖醇得率为0.8g/g。抑制物同时被利用。
3.两步发酵法的第二步是添加纤维素酶后进行纤维素的同步糖化发酵，将葡萄糖转化成 乙醇，乙醇得率为0.4g/g以上。避免葡萄糖对木糖发酵的抑制作用。
4.两步发酵法的第二步添加纤维素酶后，同步糖化发酵是在高温条件下进行，纤维素酶 活力高、降低使用量、降低成本。
5.与同步糖化共发酵相比，两步发酵法基本无木糖的剩余，木糖利用率高。
6.本发明所述的以木质纤维素为原料发酵生产乙醇的方法，原料来源广泛且成本低廉， 所有步骤在同一反应器中进行，为纤维素乙醇的商业化生产提供了技术支持，填补了现有技 术的空白。
附图说明
图1显示未脱毒纤维素水解液的两步发酵结果。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了 本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的， 并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材 料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
对比例
本实施例利用纤维素原料同步糖化发酵生产木糖醇和乙醇，包括以下步骤：
1)取马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株进行种子培养、扩大培养； 其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株接种至培养基，培养16～24h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；
扩大培养：将酵母浸粉取10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L以及木糖10g/L经 121℃、20min灭菌制备得到扩培培养基，按接种量10％将上述种子接种到含有扩培培养基 的摇瓶中，扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间36～48h至菌种浓度达到OD620至2～4；
2)取扩大培养中得到的菌液，离心收集菌体，无菌水重悬，调节初始接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，同时添加纤维素酶进行同步糖化共发酵，纤维素酶用量为20FPU/g， 发酵温度保持在40℃，转速150rpm/min，调节pH值至5；
发酵的培养基为稀酸预处理后的未脱毒玉米芯水解液；玉米芯固体含量为1：8(质量 体积比)，含2g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，调pH至5；发酵于500mL摇瓶中进行；
3)发酵产物中木糖醇4.0g/L，乙醇12g/L。
实施例1
本实施例利用纤维素原料二步法发酵生产木糖醇和乙醇，取马克斯克鲁维酵母1727-5 (K.marxianus1727-5)菌株，采用与对比例相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用 相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别仅在于：在发酵进行48h后添加纤维素酶；结果： 以稀酸预处理的玉米芯水解液为发酵培养基，两步发酵法(Two-step)和同步糖化发酵 (SSCF)的发酵性能区别明显；两步发酵法的木糖消耗速度、木糖醇产量和乙醇产量均较同步糖化发酵高；木糖醇浓度7.44g/L，乙醇产量13.53g/L。说明与同步糖化发酵(SSCF) 相比，两步发酵法(Two-step)的发酵性能更好。
实施例2
本实施例采用两步法发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，包括以下步骤：
1)取马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株进行种子培养、扩大培养； 其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株接种至培养基，培养18～24h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；
扩大培养：取种子培养中得到的菌体，按接种量10％接种到含有扩培培养基的摇瓶中， 扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间36～48h至菌种浓度达到OD620至2～4；
扩大培养的培养基为混合糖培养基；含有葡萄糖20g/L、木糖10g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 5min)，无菌水重悬调节初始 接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在40℃，转速200rpm/min，调节 pH值至5，保持0.2vvm通气量，发酵120h，于60h添加纤维素酶；
发酵的培养基为稀酸预处理后的未脱毒玉米芯水解液；玉米芯固体含量为1：8，含2 g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，调pH至5，纤维素酶用量为20FPU/g；发酵于5L发酵罐中进 行。
实施例3
本实施例采用两步法发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，取马克斯克鲁维酵母1727-5 (K.marxianus1727-5)菌株，采用与实施例2相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采 用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别仅在于：第一步发酵通气保持1.4vvm。
结果：在以稀酸预处理玉米芯水解液为发酵培养基条件下，随着通气量的增加，耗糖速 率增加，相应的木糖醇和乙醇生产速度加快，乙酸消耗加快；在0.2vvm和1.4vvm通气量 条件下，发酵至120h残糖分别为20.06g/L、4.13g/L，木糖消耗速度明显加快木糖利用率从34％提高至86％；且通气量的增加使木糖醇产量明显增多，从7.44g/L提高至20.47g/L；在1.4vvm时的乙醇生产速度较0.2vvm时快，但是最终产率并无明显差别，结果说明增加 通气量可提高木糖发酵速度，增加木糖醇产量。
实施例4
本实施例采用两步法发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，包括以下步骤：
1)取马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株进行种子培养、扩大培养； 其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5(K.marxianus1727-5)菌株接种至培养基，培养18～24h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；
扩大培养：取种子培养中得到的菌体，按接种量10％接种到含有扩培培养基的摇瓶中， 扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间36～48h至菌种浓度达到OD620至2～4；
扩大培养的培养基为混合糖培养基；含有葡萄糖20g/L、木糖10g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 5min)，无菌水重悬调节初始 接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在40℃，转速200rpm/min，调节 pH值至5，保持1.4vvm通气量，发酵120h，于60h添加纤维素酶；
发酵的培养基为稀酸预处理后的未脱毒玉米芯水解液；玉米芯固体含量为1：8，含2 g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，调pH至5，纤维素酶用量为20FPU/g；发酵于5L发酵罐中进 行。
实施例5
本实施例采用两步发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，取马克斯克鲁维酵母1727-5(K. marxianus1727-5)菌株，采用与实施例4相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同 的发酵液、发酵条件进行发酵，区别仅在于：纤维素酶用量为10FPU/g；
结果：加酶量为10FPU/g时木糖消耗加快，木糖利用率最高为91％，整体发酵时间从 20FPU/g下的120h缩短至96h。纤维素酶的用量大大减少，降低成本。在此条件下K.marxianus1727-5的木糖醇得率为0.8g/g，乙醇得率为0.41g/g。
实施例6
1)本实施例采用两步发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，取马克斯克鲁维酵母1727-5 (K.marxianus1727-5)菌株，采用与实施例5相同的方法进行种子培养与扩大培养；
2)取扩大培养中得到的菌液，离心收集菌体，无菌水重悬调节初始接种OD620至2，并 接种至发酵培养基中开始发酵，温度为40℃，转速200rpm/min，调节pH值至5，通气量为1.4vvm；
发酵的培养基为稀酸预处理后的未脱毒玉米芯水解液；玉米芯固体含量为11％，含2 g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，调pH至5，于5L反应器中发酵；
3)在发酵进行48h后添加纤维素酶；
4)在发酵进行72h后开始补料，补料2次；
补料策略为补充玉米淀粉糖化液，每24h补料一次，每次补加的糖化液中葡萄糖含量 为50g/L。
结果：水解液中的木糖基本耗尽，木糖醇浓度为24.23g/L，得率为0.81g/g，乙醇浓度 为53.48g/L，本工艺可实现木质纤维素原料的完全利用，并能获得较高的木糖醇和乙醇得率， 生产成本低。

Claims (7)

1.一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）取马克斯克鲁维酵母1727-5菌种进行种子培养、扩大培养；
步骤2）将纤维素物料进行预处理，获得未脱毒纤维素处理液，在未脱毒纤维素处理液中，料液比为1：3~1：10；
步骤3）将经过步骤1）种子培养、扩大培养后的菌种接种至步骤2）中获得的未脱毒纤维素处理液中进行发酵，其中，初始菌种浓度OD620 =1-20，发酵温度30-50℃ ，转速100-300rpm/min，pH值4-6，1.4~2vvm的微量通入无菌空气，以获得木糖醇；
步骤4）步骤3）中进行发酵48-72 h后添加纤维素酶，纤维素酶用量10 FPU/g ~ 20FPU/g，发酵温度30-50℃ ，转速100-300 rpm/min，pH值4-6，发酵96～144 h得到乙醇；
在步骤2）中所述的纤维素物料选自玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为稀酸法。
2.根据权利要求1所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤4）中进行批式补料发酵，以提高终点乙醇浓度：在添加纤维素酶后每24-48h补加步骤2）中预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖，使预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖在发酵液中的浓度为50-200 g/L。
3.根据权利要求1或2所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤1）中：
种子培养：将酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L经121℃ 、20 min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5菌株接种至所述种子液培养基，培养16~24h至菌种浓度达到OD620至2~2.5；
扩大培养：将酵母浸粉取10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L以及木糖10 g/L经121℃ 、20 min灭菌制备得到扩培培养基，按接种量5-10%（v/v）将种子培养中获得的菌液接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃ ，转速100-300 rpm，培养时间36~48 h至菌种浓度达到OD620至2~4。
4.根据权利要求1或2所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，步骤4）中，发酵温度为40-50℃ 。
5.根据权利要求3所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，步骤4）中，发酵温度为40-50℃ 。
6.根据权利要求1、2或5所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤3）中，将经步骤1）扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬，控制OD620 =1-20并接种至步骤2）中获得的未脱毒纤维素处理液中。
7.根据权利要求4所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤3）中，将经步骤1）扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬，控制OD620 =1-20，并接种至步骤2）中获得的未脱毒纤维素处理液中。
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Aerobic and sequential anaerobic fermentation to produce xylitol and ethanol using non-detoxified acid pretreated corncob;Ke-Ke Cheng等;《Biotechnology for Biofuels》;20141123;摘要、第4页右栏-第5页左栏、图6、第8-9页materials and methods部分 *
The production of ethanol from lignocellulosic biomass by Kluyveromyces marxianus CICC 1727-5 and Spathaspora passalidarum ATCC MYA-4345;Cong Du等;《Applied mnicrobiology and biotechnology》;20190131;摘要、第2846页右栏第2段、第2847页左栏第3段、第2851页右栏、第2852页表2、第2853-2854页 *

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