CN113215203B - 共发酵酵母菌扩培发酵产乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙醇生产领域，具体涉及共发酵酵母菌扩培发酵产乙醇的方法，该方法包括将活化后的酵母菌进行扩培得到种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵得到乙醇；其中，控制扩培过程中的搅拌转速为40‑100rpm，通气比为0‑0.4vvm，装液量为60‑70体积％；所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC No.16830。相比较传统的酵母菌扩培方法，在扩培过程采用微厌氧繁殖，能够减少过程能耗，提高设备利用率，提高菌种发酵性能。然后，所述种子液进行发酵能够显著提高菌种对阿拉伯糖和木糖的代谢效率，提高乙醇产率。
Description
技术领域
本发明涉及乙醇生产领域，具体涉及一种共发酵酵母菌扩培发酵产乙醇的方法。
背景技术
纤维质原料是自然界最丰富的可再生资源，仅秸秆我国每年有6-7亿吨的产出，如能利用1亿吨生产乙醇，产量可达2000万吨，可以缓解石油供应紧张的问题和粮食紧缺问题。但利用生物技术转化纤维资源面临着一定的困难，纤维质原料通过预处理，产生半纤维虽然很容易被水解，但半纤维素水解的产物(木糖、阿拉伯糖)，不能被通常的酿酒酵母高效利用，因此发酵产乙醇的效率受到了一定的限制，因此，提高发酵过程木糖、阿拉伯糖的利用率，对以纤维质原料生产酒精提高酒精产率起着决定性作用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的传统酵母菌利用纤维素原料产乙醇时对木糖和阿拉伯糖利用效率低、乙醇产率低的问题，提供一种共发酵酵母菌扩培发酵产乙醇的方法，该方法能够显著提高纤维素原料产乙醇过程中木糖和阿拉伯糖的利用效率，进而提高乙醇产率。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种酵母菌发酵产乙醇的方法，该方法包括将活化后的酵母菌进行扩培得到种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵得到乙醇；
其中，控制扩培过程中的搅拌转速为40-100rpm，通气比为0-0.4vvm，装液量为60-70体积％；
所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCCNo.16830。
本发明在所述酿酒酵母的扩培过程中采用微厌氧繁殖，相比较传统扩培的方法，该扩培方法减少过程能耗，能够提高设备利用率，提高菌种发酵性能。然后，将扩培后的种子液接种到发酵培养基中，能显著提高菌种对阿拉伯糖和木糖的代谢效率，提高乙醇产率。
采用本发明所述的方法，能够使得菌种充分利用纤维素原料酶解产物中可发酵性葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，以达到提高纤维素乙醇发酵液中乙醇浓度的目的。在本发明所述的技术方案中，最高能够使得阿拉伯糖的利用率达到80％以上，木糖利用率达到90％以上，乙醇得率达到85％以上。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种酵母菌发酵产乙醇的方法，该方法包括将活化后的酵母菌进行扩培得到种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵得到乙醇；
其中，控制扩培过程中的搅拌转速为40-100rpm，通气比为0-0.4vvm，装液量为60-70体积％；
所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCCNo.16830。
在本发明中，本发明的发明人发现虽然使用本领域常规采用的好氧扩培+厌氧发酵的模式，也能够使本发明所述的菌株代谢产乙醇，但是其利用阿拉伯糖和/或木糖代谢产乙醇的乙醇产率以及阿拉伯糖和/或木糖的利用率低，经过研发发现，采用本发明所述的微厌氧扩培+厌氧发酵的方法能够显著提高酿酒酵母利用纤维素原料生产乙醇时原料的利用率。
在本发明中，通过控制装液量、通气量和搅拌转速控制微厌氧状态。不同的发酵罐的操作条件对发酵过程中溶氧的影响不同。
在本发明中，在扩培过程中，搅拌转速在40-100rpm范围内即可，本领域技术人员可以根据实际操作的情况对搅拌转速进行调整。
在本发明中，通气量为一分钟内通过发酵液的空气体积与发酵液的体积之比，即通气比＝通气速率(立方米/分钟)/发酵液体积(立方米)，以vvm计。
在本发明中，所述扩培过程中，通气比为0-0.4vvm，比如可以为0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4vvm以及任意两个值之间组成的任意范围，优选为0-0.2vvm，更优选为0-0.1vvm，进一步优选为0-0.05vvm。
在本发明中，所述扩培过程中，所述装液量为60-70体积％，比如可以为60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％以及任意两个值之间组成的任意范围。
本发明的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年11月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16830，已经在专利文件CN 109609540A中公开。
在本发明中，所述活化的方法可以为本领域常规采用的方法，优选地包括：将酵母菌菌种接种到活化培养基中，在好氧条件、28-32℃下培养20-24h。
在本发明中，虽然使用常规的活化培养基即可实现活化酵母菌菌种的目的，但是采用本发明优选的活化培养基能够进一步提高发酵步骤中的发酵效率。优选地，所述活化培养基包含酵母膏、蛋白胨和单糖，所述单糖选自葡萄糖、阿拉伯糖和木糖中的至少一种。
在本发明中，相对于100重量份的所述活化培养基，所述酵母膏的含量为0.5-1.5重量份，所述蛋白胨的含量为1-3重量份，所述单糖的含量为1-3重量份。
在本发明中，优选地，所述活化培养基中还包含青霉素，所述青霉素的用量使得所述活化培养基中的青霉素含量为5-20ppm，更优选为8-15ppm。
在本发明中，虽然通过扩培就能够得到用于发酵的种子液，但是为了提高发酵效率，还优选控制种子液的参数。优选地，所述种子液中酵母数为1*108-1*109个/mL，生芽率在10％以上，死亡率在5％以下。
在本发明中，对活化后的酵母菌进行扩培处理时，扩培的条件可以是本领域常规使用的技术手段。优选地，所述扩培的条件包括：培养温度为28-32℃，培养基pH为4.5-5.5，培养时间为10-14h。在所述优选的情况下，能够进一步提高酵母菌的发酵效率和原料利用率。
在本发明中，扩培和活化过程中使用的培养基可以相同或不同。
优选地，所述扩培过程中使用的扩培培养基包含酵母膏、蛋白胨和单糖，所述单糖选自葡萄糖、阿拉伯糖和木糖中的至少一种。
在本发明中，所述扩培过程中使用的扩培培养基优选包含酵母膏、蛋白胨和单糖，所述单糖选自葡萄糖、阿拉伯糖和木糖中的至少一种。
在本发明的一种优选的实施方式中，相对于100重量份的所述扩培培养基，所述酵母膏的含量为0.5-1.5重量份，所述蛋白胨的含量为1-3重量份，所述单糖的含量为1-3重量份。优选地，所述扩培培养基中还包含青霉素，所述青霉素的用量使得所述扩培培养基中的青霉素含量为5-20ppm，更优选为8-15ppm。
在本发明中，所述扩培可以包括一级扩培和二级扩培，其中，一级扩培和二级扩培的条件可以相同或者不同。
在本发明中，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵，所述接种量可以为本领域常规使用的接种量，优选地，所述接种量为2-10重量％。
在本发明中，所述发酵培养基可以为本领域常规使用的发酵培养基，优选地，所述发酵培养基包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
其中，所述发酵培养基中各组分的含量可以在较宽的范围内选择，优选地，所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为60-100g/L，木糖的浓度为20-45g/L，阿拉伯糖的浓度为5-10g/L。在所述优选的范围内，能够提高原料的利用率。
在本发明中，优选地，所述发酵培养基中的至少部分葡萄糖、木糖和阿拉伯糖由纤维素原料酶解产物提供。
其中，所述纤维素原料酶解产物的来源可以不受特别的限制，优选地，在纤维素酶的存在下，将纤维素原料酶解得到纤维素原料酶解产物。具体的操作步骤可以参见CN101376903A。
在本发明中，所述发酵的条件可以是本领域常规培养酵母菌的条件，优选地，所述发酵的条件包括：温度为28-34℃，发酵培养基初始pH为4.5-5.5，时间为40-72h；更优选地，所述发酵的条件包括：温度为28-32℃，发酵培养基初始pH为4.8-5.2，发酵过程中不控制pH，时间为48-56h。优选地，所述发酵的温度高于扩培和活化过程中的温度。
在本发明中，通过显微镜检测酵母菌的活菌数。
通过液相色谱仪对纤维素原料酶解产物、发酵液中的产物和副产物进行分析。液相色谱仪购自安捷伦科技有限公司，型号Aglient1260。
醪液中各种糖含量、醇含量及其它各种有机酸检测均采用液相色谱仪进行分析。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，使用的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC No.16830，名为S.CaraABD。
各种糖含量、醇含量及其它各种有机酸检测均采用液相色谱仪进行分析。
木糖为上海惠世生化试剂有限公司牌号为D-木糖的市售品。
阿拉伯糖为麦克林公司牌号为L-阿拉伯糖的市售品。
YEPX培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L，青霉素10ppm。
通过液相色谱仪对纤维素原料酶解产物、发酵液中的产物和副产物进行分析。液相色谱仪购自安捷伦科技有限公司，型号Aglient1260。
乙醇得率的计算公式为：乙醇得率(％)＝(发酵结束乙醇浓度—发酵开始乙醇浓度)/0.511*(发酵初始葡萄糖浓度+发酵初始木糖浓度+发酵初始阿拉伯糖浓度)，其中，0.511为糖醇转化理论值。
以下实施例中使用的扩培罐的体积为10L，发酵罐的体积为30L。
制备例1
本制备例用于说明纤维素原料酶解产物的制备方法
(1)纤维素原料的预处理
将1000克没有杂质的玉米秸秆(含水量10％)切成不超过1.2厘米×0.5厘米×1.0厘米的小段，在195℃下维持1.70兆帕的压力5分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。将所得蒸汽爆破产物与70℃水按照质量比1：3搅拌混合30分钟，然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟的转速下进行固液分离，共得到3000克水洗蒸汽爆破产物(含水量为70重量％)。
(2)酶解
向酶解罐中加入水，并在搅拌下，加入第一批步骤(1)水洗蒸汽爆破产物，第一批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)的水洗蒸汽爆破产物重量的15％，然后调节pH值为4，加热至52℃后，以每克秸秆的干重计，加入20酶活力单位的酶计算，全部秸秆的干重为900克，共加入18000酶活力单位(约120克)的纤维素酶(诺维信生物技术有限公司)，并在52℃下保温混合20分钟；然后连续加入剩余的水洗蒸汽爆破产物，所述剩余的含纤维素的原料的加入速度使含纤维素的原料在反应体系中的浓度为140克/升，加料结束后，在52℃下保温酶解至加酶后36小时(连续加入剩余的水洗蒸汽爆破产物的时间占酶解时间的30％)，得到纤维素原料酶解产物。
测定得到每1L酶解产物中葡萄糖含量为78.5g，木糖含量为35.1g，阿拉伯糖含量为7.5g，乙醇含量为0g。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
(1)活化
对酵母菌株(S.C araABD)，用YEPX培养基进行活化，活化条件包括：转速200rpm，30℃恒温摇床，活化20h，得到活化液。
(2)扩培
将活化液按1.0％(V/V)接入装有一级扩培培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)的扩培罐中进行扩培，装液量为60体积％，扩培条件30±1℃，pH5.0±0.1(氨水调节)，搅拌转速80-100rpm，扩培过程中不通气，扩培12h，得到一级扩培种子液。
二级扩培工艺条件、扩培培养基与一级相同，接种量为2％(V/V)。二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.89亿/mL，芽生率：20.8％，死亡率：0.2％。
(3)发酵
以制备例1所述的方法制备得到的纤维素原料酶解产物作为发酵培养基进行发酵。在装有18L纤维素原料酶解产物的发酵罐中，种子液按照接种量为10％接种至所述酶解液中。在接种前，将一定体积的种子液在8000rpm下离心5min后弃去上清液，然后用生理盐水对离心后的酵母菌进行清洗后再次离心，得到接种用的酵母菌。发酵过程中控制发酵温度为30±1℃，发酵培养基初始pH为5.0±0.2，发酵过程中不控制pH，时间为54h。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例1所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，一级扩培和二级扩培过程中通入无菌空气，所述通气量为0.05vvm，装液量为65体积％，搅拌转速为60-80rpm。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.84亿/ml，芽生率：18.3％，死亡率：0.5％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例1所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，一级扩培和二级扩培过程中通入无菌空气，所述通气量为0.1vvm，装液量为70体积％，搅拌转速为40-60rpm。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.72亿/ml，芽生率：18.6％，死亡率：1.6％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
实施例4
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例3所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，一级扩培和二级扩培过程中通入无菌空气，所述通气量为0.2vvm。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.58亿/ml，芽生率：15.2％，死亡率：3.8％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
实施例5
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例3所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，一级扩培和二级扩培过程中通入无菌空气，所述通气量使得溶氧值为0.4vvm。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.29亿/ml，芽生率：15.0％，死亡率：4.3％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
实施例6
本实施例用于说明本发明所述的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例1所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，所述一级扩培和二级扩培过程中使用的扩培培养基均为稀释后的玉米糖化醪，其中，扩培培养基中的葡萄糖含量为45.6g/L，木糖含量为18.9g/L。
所述玉米糖化醪的制备方法为玉米粉和水以1:2的比例混合，按0.4kg/吨玉米粉的比例加入淀粉酶(购自诺维信生物技术有限公司)，升温至98℃液化1h，得到液化醪。向液化醪中加入糖化酶进行糖化，糖化酶加量为0.3kg/吨玉米面，得到玉米糖化醪。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：2.01亿/ml，芽生率：19.0％，死亡率：0.7％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
对比例1
本对比例用于说明参比的酵母菌发酵产乙醇的方法
按照实施例3所述的方法进行发酵产乙醇，不同的是，一级扩培和二级扩培过程中通入无菌空气，所述通气量为0.5vvm(好氧)。
二级扩培后，使用光学显微镜检测酵母数：1.05亿/ml，芽生率：12.1％，死亡率：5.0％。
发酵结束后测定发酵产物中乙醇、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量，并计算乙醇得率、木糖消耗率和阿拉伯糖消耗率，具体结果见表1。
表1
通过表1的结果可以看出，本发明中采用微厌氧扩培方法，能够显著促进发酵，提高乙醇得率及木糖、阿拉伯糖消耗率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种酵母菌发酵产乙醇的方法，其特征在于，该方法包括将活化后的酵母菌进行扩培得到种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵得到乙醇；
其中，控制扩培过程中的搅拌转速为40-100rpm，通气比为0-0.4vvm，装液量为60-70体积％；
所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCCNo.16830。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活化的方法包括：将酵母菌菌种接种到活化培养基中，在好氧条件、28-32℃下培养20-24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述活化培养基包含酵母膏、蛋白胨和单糖，所述单糖选自葡萄糖、阿拉伯糖和木糖中的至少一种；
相对于100重量份的所述活化培养基，所述酵母膏的含量为0.5-1.5重量份，所述蛋白胨的含量为1-3重量份，所述单糖的含量为1-3重量份。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述活化培养基中还包含青霉素，所述青霉素的用量使得所述活化培养基中的青霉素含量为5-20ppm。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述青霉素的用量使得所述活化培养基中的青霉素含量为8-15ppm。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扩培的条件包括：培养温度为28-32℃，培养基pH为4.5-5.5，培养时间为10-14h。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，所述扩培过程中使用的扩培培养基包含酵母膏、蛋白胨和单糖，所述单糖选自葡萄糖、阿拉伯糖和木糖中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，相对于100重量份的所述扩培培养基，所述酵母膏的含量为0.5-1.5重量份，所述蛋白胨的含量为1-3重量份，所述单糖的含量为1-3重量份。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述扩培培养基中还包含青霉素；
所述青霉素的用量使得所述扩培培养基中的青霉素含量为5-20ppm。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述青霉素的用量使得所述扩培培养基中的青霉素含量为8-15ppm。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为28-34℃，发酵培养基初始pH为4.5-5.5，时间为40-72h。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为29-32℃，发酵培养基初始pH为4.8-5.2，发酵过程中不控制pH，时间为48-56h。
13.根据权利要求1、11和12中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养基包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为60-100g/L，木糖的浓度为20-45g/L，阿拉伯糖的浓度为5-10g/L。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子液中酵母数为1*108-1*109个/mL，生芽率在10％以上，死亡率在5％以下。
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