JP2013524797A - アラビノースを転化できる細胞を製造する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アラビノースを転化できる細胞を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）アラビノースを転化できない宿主株に、遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを導入する工程であって、この細胞は構築細胞と呼ばれる工程；
ｂ）アラビノースを転化する細胞が得られるまで、この構築細を適応進化にかける工程、
ｃ）任意選択的に、第１のアラビノース転化細胞を適応進化にかけて、アラビノース転化を改良する工程；工程ｂ）または工程ｃ）で製造される細胞は、第１アラビノース転化細胞と呼ばれる工程；
ｄ）第１アラビノース転化細胞および構築細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部を分析する工程；
ｅ）第１アラビノース転化細胞における一塩基変異多型（ＳＮＰ’ｓ）を同定する工程；および
ｆ）ＳＮＰ’ｓの情報を、アラビノースを転化できる細胞の合理的設計で使用する工程；
ｇ）工程ｆ）で設計される、アラビノースを転化できる細胞の構築の工程；
を含む、方法に関する。

Description

発明の詳細な説明
［発明の分野］
本発明は、アラビノースを転化できる細胞を製造する方法に関する。本発明はまた、本方法で製造され得る細胞にも関する。本発明はさらに、このような細胞がたとえばエタノール等の発酵産物の製造に使用される方法に関する。
［発明の背景］
ここ数十年間における従来の、化石燃料（石油燃料）の大量消費は、高レベル汚染の一因となっている。このことは、化石燃料の世界備蓄は制限されないという認識および環境意識の高まりに加えて、リットル当たりの基準で無鉛ガソリンよりＣＯ２の放出が少ない粒状物質非含有燃料である、エタノール等の代替燃料の実現可能性を研究する新たな試みを促進した。バイオマス由来のエタノールは、さまざまな起源から得られるヘキソース糖類の発酵によって製造することが可能であるが、燃料アルコールの工業規模製造に一般的に使用される基質、たとえば甘蔗糖やコーンスターチ等は、高価である。したがって、燃料エタノールの増産には廉価な原料の使用が必要であろう。現在エタノール製造に使用されている作物の代わりに使用するのに十分な量が入手できるのは、植物バイオマス由来のリグノセルロース原料のみである。大抵のリグノセルロース物質では、２番目に多い糖は、Ｃ６糖に次いで、アラビノースを含む、かなりの量のＣ５糖類を含有する。したがって、経済的に実現可能な燃料製造方法のためには、ヘキソースとペントースの両糖類を発酵してエタノールを形成しなければならない。酵母サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、頑強でありエタノール製造によく適応するが、アラビノースを転化できない。また、高エタノール収率と高エタノール生産性の両者を具有する、キシロースをエタノールに転化できる天然の微生物は全く知られていない。したがって、商業的に実現可能なリグノセルロース原料からエタノールへの製造を可能にするために、これらの特性を有する微生物が必要である。
［発明の概要］
本発明の目的は、細胞、特にアラビノースを転化できる酵母細胞を、提供することである。
この目的は、アラビノースを転化できる細胞を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）アラビノースを転化できない宿主株に、遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを導入する工程であって、この細胞は構築細胞と呼ばれる工程；
ｂ）アラビノースを転化する細胞が得られるまで、この構築細を適応進化にかける工程、
ｃ）任意選択的に、第１のアラビノース転化細胞を適応進化にかけて、アラビノース転化を改良する工程であって；工程ｂ）または工程ｃ）で製造される細胞は、第１アラビノース転化細胞と呼ばれる工程；
ｄ）第１アラビノース転化細胞および構築細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部を分析する工程；
ｅ）第１アラビノース転化細胞における一塩基変異多型（ＳＮＰ’ｓ）を同定する工程；および
ｆ）ＳＮＰ’ｓの情報を、アラビノースを転化できる細胞の合理的設計で使用する工程；
ｇ）工程ｆ）で設計される、アラビノースを転化できる細胞の構築の工程；
を含む方法を提供する本発明に従って達成される。
本発明はさらに、電気泳動法で決定されるとき、酵母細胞ＢＩＥ２０１を除き、染色体ＶＩＩが１３００〜１６００Ｋｂのサイズである、ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子を有する酵母細胞を提供する。
本発明はさらに、ポリペプチド類：
ａ．ＳＳＹ１に置換Ｅ４５５ｓｔｏｐを有するポリヌクレオチド配列番号１４によりコード化される配列を有するポリペプチド、およびその他の位置の１つ以上がＡＡトランススーパーファミリーにおける既存のアミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド類；
ｂ．ＹＪＲ１５４ｗに置換Ｄ１７１Ｇを有するポリヌクレオチド配列番号１６によりコード化される配列を有するポリペプチド、および、その他の位置の１つ以上がＰｈｙＨスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド類；
ｃ．ＣＥＰ３に置換Ｓ３９６Ｇを有するポリヌクレオチド配列番号１８によりコード化される配列を有するポリペプチド；
ｄ．ＧＡＬ８０に置換Ｔ１４６Ｐを有する配列番号２０によりコード化される配列を有するポリペプチド、および、その他の位置の１つ以上がＮＡＤＢ Ｒｏｓｓｍａｎｎスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸であるアミノ酸を含むアミノ酸の突然変異を有してもよい、その変異形ポリペプチド類
からなる群に属するポリペプチドに関する。
ベクターｐＰＷＴ００６の物理地図を提示する。 プラスミドｐＰＷＴ０１８の物理地図を提示し、その配列を配列番号１で示す。 ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤにおけるプラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組み込みを示すハイブリダイゼーション実験の結果を示すオートラジオグラムを提示する； プラスミドｐＰＷＴ０８０の物理地図を提示し、その配列を配列番号８で示す。 唯一の炭素源としての２％アラビノースでの、参考株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１好気的増殖曲線を提示する。 唯一の炭素源としての２％アラビノースでの、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃの嫌気的増殖曲線を提示する。 ２％グルコースで前培養し、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトース（％は全て重量／重量）を含むＶｅｒｄｕｙｎ培地で増殖させたＢＩＥ１０４に関する、増殖曲線（糖濃度、エタノール濃度およびグリセロール濃度、ＯＤ６００および生成したＣＯ２（ｍｌ／時間、副軸）を提示する。 ２％グルコースで前培養し、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地で増殖させた、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃに関する、増殖曲線（糖濃度、エタノール濃度およびグリセロール濃度、ＯＤ６００および生成したＣＯ２（ｍｌ／時間、副軸）を提示する。 ２％グルコースで前培養し、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトース（％は全て重量／重量）を含むＶｅｒｄｕｙｎ培地で増殖させたＢＩＥ２０１に関する、増殖曲線（糖濃度、エタノール濃度およびグリセロール濃度、ＯＤ６００および生成したＣＯ２（ｍｌ／時間、副軸）を提示する。 交雑の図式的概観を提示する。 「正規化融解曲線」（融解曲線；最上パネル）および「正規化溶融ピーク」曲線（下方のパネル）の一例を提示する。後者は第１のグラフから導かれ、蛍光シグナルの変化を温度の関数として表している。株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１およびＢＩＥ２０１を示す。この図で試験された遺伝子はＹＪＲ１５４ｗである。プローブの融解温度の差は、試験した２株、ＢＩＥ２０１とＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の間で明白である。 株ＢＩＥ２０１における染色体ＶＩＩの略図（カバレージプロット）を提示する。リードデプスは、染色体に沿った位置の関数として提示される。染色体ＶＩＩの一部は、複数のコピーに存在する、すなわち、２倍または３倍過剰提示される。 臭化エチジウムで染色された、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によりＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１から誘導された株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によりＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃから誘導された株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが観測される（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、マーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 ブロットされ、ａｒａＡプローブとハイブリダイズされた、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１由来の株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが認められる（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体のサイズの参考として使用されるマーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 ブロットされ、ＡＣＴ１プローブとハイブリダイズされた、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１由来の株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが認められる（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体のサイズの参考として使用されるマーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 ブロットされ、ＰＮＣ１プローブとハイブリダイズされた、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１由来の株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが認められる（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体のサイズの参考として使用されるマーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 ブロットされ、ＨＳＦ１プローブとハイブリダイズされた、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１由来の株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが認められる（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体のサイズの参考として使用される、マーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 ブロットされ、ＹＧＲ０３１ｗプローブとハイブリダイズされた、ＣＨＥＦゲルを提示する。染色体は、ＣＨＥＦ技術を使用して、それらのサイズに基づいて分離された。分析された株はＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の同義語）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１由来の株、アラビノースで増殖できる）、および株ＢＩＥ２０１（適応進化によるＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の株、嫌気的条件下でアラビノースで増殖できる）である。染色体のシフトが認められる（テキスト参照）。株ＹＮＮ２９５は、染色体のサイズの参考として使用される、マーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。 交雑ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ ｘ ＢＩＥ２０１から解剖した子嚢１０個の例を提示する。子嚢は、Ｓｉｎｇｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒで解剖した。各子嚢は、４つの子嚢胞子から成る。これらの子嚢胞子は互いに分離されており、区別できる距離で寒天プレートに置かれる。理論的には、４つの１倍体胞子分離株は４つの個々のコロニーを生じさせることができる。「縦列」の４つのコロニーは、１つの子嚢に由来する。 ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ，Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での株ＢＩＥ２５２の性能を例示する。本株を、Ｖｅｒｄｕｙｎ培地２％グルコースで前培養した。ＢＡＭでの適用は、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトースおよび０．５％マンノースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地（ｐＨ４．２）で、嫌気的条件下で行った。 ＢＡＭでの株ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０の性能を例示する。本株を、Ｖｅｒｄｕｙｎ培地２％グルコースで前培養した。ＢＡＭでの適用は、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトースおよび０．５％マンノースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地（ｐＨ４．２）で、嫌気的条件下で行った。 全アジピン酸経路のゲノムへの二重交差組み込みの概略図を提示する。 本分析方法で測定したアジピン酸標準およびアジピン酸試料の、結果として得られたクロマトグラムを提示する。 プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＢＤの物理地図を提示する。
［配列表の簡単な説明］
配列番号１ ｐＰＷＴ０１８の配列を提示する；
配列番号２ ｐＰＷＴ０１８の組み込みをチェックするためのプライマーの配列を提示する；
配列番号３ （配列番号２を用いて）ｐＰＷＴ０１８の組み込みをチェックするためおよび（配列番号４を用いて）コピー数ｐＰＷＴ０１８をチェックするためのプライマーを提示する；
配列番号４ コピー数ｐＰＷＴ０１８をチェックするためのプライマーの配列を提示する；
配列番号４ 配列番号４と組み合わせてゲノムにｐＰＷＴ０１８が存在することをチェックするためのプライマーの配列を提示する；
配列番号６ ＳＩＴ２プローブを生じさせるための順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７ ＳＩＴ２プローブを生じさせるための逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８ プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列を提示する；
配列番号９ （配列番号１０を用いて）ＧＲＥ３−遺伝子座の３’−末端におけるｐＰＷＴ０８０の正しい組み込みをチェックするため、および（配列番号１１を用いて）プラスミドｐＰＷＴ０８０のコピー数をチェックするための、順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号１０ ＧＲＥ３−遺伝子座の３’−末端におけるｐＰＷＴ０８０の正しい組み込みをチェックするための逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号１１ （配列番号１０を用いて）プラスミドｐＰＷＴ０８０のコピー数をチェックするための逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号１２ ＲＫＩ１−プローブを生じさせるための順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号１３ ＲＫＩ１−プローブを生じさせるための逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号１４ 野生型株ＢＩＥ１０４におけるＳＳＹ１−遺伝子の配列の配列を提示する；
配列番号１５ 株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１におけるＳＳＹ１−遺伝子の配列を提示する；
配列番号１６ 野生型株ＢＩＥ１０４におけるＹＪＲ１５４ｗ−遺伝子の配列を提示する；
配列番号１７ 株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１におけるＹＪＲ１５４ｗ−遺伝子の配列を提示する；
配列番号１８ 野生型株ＢＩＥ１０４におけるＣＥＰ３−遺伝子の配列を提示する；
配列番号１９ 株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１におけるＣＥＰ３−遺伝子の配列を提示する；
配列番号２０ 野生型株ＢＩＥ１０４におけるＹＰＬ２７７ｃ−遺伝子の配列を提示する；
配列番号２１ 株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１におけるＹＰＬ２７７ｃ−遺伝子の配列を提示する；
配列番号２２ 野生型株ＢＩＥ１０４におけるＧＡＬ８０−遺伝子の配列を提示する；
配列番号２３ 株ＢＩＥ２０１におけるＧＡＬ８０−遺伝子の配列を提示する；
配列番号２４ 順方向プライマーＳＳＹ１の配列を提示する；
配列番号２５ 逆方向プライマーＳＳＹ１の配列を提示する；
配列番号２６ 順方向プライマーＹＪＲ１５４ｗの配列を提示する；
配列番号２７ 逆方向プライマーＹＪＲ１５４ｗの配列を提示する；
配列番号２８ 順方向プライマーＣＥＰ３の配列を提示する；
配列番号２９ 逆方向プライマーＣＥＰ３の配列を提示する；
配列番号３０ 順方向プライマーＹＰＬ２７７ｃの配列を提示する；
配列番号３１ 逆方向プライマーＹＰＬ２７７ｃの配列を提示する；
配列番号３２ 順方向プライマーＧＡＬ８０の配列を提示する；
配列番号３３ 逆方向プライマーＧＡＬ８０の配列を提示する；
配列番号３４ Ｈｉ−ＲｅｓプローブＳＳＹ１の配列を提示する；
配列番号３５ Ｈｉ−ＲｅｓプローブＹＪＲ１５４ｗの配列を提示する；
配列番号３６ Ｈｉ−ＲｅｓプローブＣＥＰ３の配列を提示する；
配列番号３７ Ｈｉ−ＲｅｓプローブＹＰＬ２７７ｃの配列を提示する；
配列番号３８ Ｈｉ−ＲｅｓプローブＧＡＬ８０の配列を提示する；
配列番号３９ 順方向プライマーＹＧＬ０５７ｃの配列を提示する；
配列番号４０ 逆方向プライマーＹＧＬ０５７ｃの配列を提示する；
配列番号４１ 順方向プライマーＳＤＳ２３の配列を提示する；
配列番号４２ 逆方向プライマーＳＤＳ２３の配列を提示する；
配列番号４３ 順方向プライマーＡＣＴ１の配列を提示する；
配列番号４４ 逆方向プライマーＡＣＴ１の配列を提示する；
配列番号４５ 順方向プライマーａｒａＡの配列を提示する；
配列番号４６ 逆方向プライマーａｒａＡの配列を提示する；
配列番号４７ 順方向プライマーＡＣＴ１の配列を提示する；
配列番号４８ 逆方向プライマーＡＣＴ１の配列を提示する；
配列番号４９ 順方向プライマーＰＮＣ１の配列を提示する；
配列番号５０ 逆方向プライマーＰＮＣ１の配列を提示する；
配列番号５１ 順方向プライマーＨＳＦ１の配列を提示する；
配列番号５２ 逆方向プライマーＨＳＦ１の配列を提示する；
配列番号５３ 順方向プライマーＹＧＲ０３１ｗの配列を提示する；
配列番号５４ 逆方向プライマーＹＧＲ０３１ｗの配列を提示する；
配列番号５５ 順方向プライマー（ｍａｔＡ，ｍａｔα）の配列を提示する；
配列番号５６ 逆方向プライマーｍａｔＡの配列を提示する；
配列番号５７ 逆方向プライマーｍａｔα（アルファ）の配列を提示する；
配列番号５８ 順方向プライマーＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸの配列を提示する；
配列番号５９ 逆方向プライマーＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸの配列を提示する；
配列番号６０ ＩＮＴ１ＬＦの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６１ Ａｄｉ２１発現カセットと重なり合う５０ｂｐ隣接領域を有するＩＮＴ１ＬＦの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６２ ５０ｂｐ隣接領域ＩＮＴ１ＬＦを有するＡｄｉ２１発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６３ Ａｄｉ２１発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する
配列番号６４ Ａｄｉ２２発現カセットを増幅の増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６５ Ａｄｉ２２発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６６ Ａｄｉ２３発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６７ Ａｄｉ２３発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６８ Ａｄｉ２３と重複する５０ｂｐ隣接領域を有するｐＵＧ７からｋａｎＭＸマーカーを増幅するための順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号６９ Ａｄｉ８と重複する５０ｂｐ隣接領域を有するｐＵＧ７からｋａｎＭＸマーカーを増幅するための逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７０ ｐＵＧ７のｋａｎＭＸと重複する２５ｂｐ隣接領域を有するＡｄｉ８発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７１ 逆方向プライマーＡｄｉ８発現カセットの配列を提示する；
配列番号７２ Ａｄｉ２４発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７３ Ａｄｉ２４発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７４ Ａｄｉ２５発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７５ ＳｕｃＣと重複する５０ｂｐを有するＡｄｉ２５発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７６ Ａｄｉ２５と重複する５０ｂｐを有するＳｕｃＣの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７７ ＳｕｃＣ発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７８ ＳｕｃＤ発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号７９ ＳｕｃＤ発現カセットの増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８０ ａｃｄｈ６７発現カセットの増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８１ ＩＮＴＲＦと重複する５０ｂｐ隣接領域を構築するａｃｄｈ６７構築物の増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８２ 酵母ゲノム上のＩＮＴ１ＬＦ部位の増幅用順方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８３ 酵母ゲノム上のＩＮＴ１ＬＦ部位の増幅用逆方向プライマーの配列を提示する；
配列番号８４ ＡＤＩ２１ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号８５ ＡＤＩ２２ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号８６ ＡＤＩ２３ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号８７ ＡＤＩ８ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号８８ ＡＤＩ２４ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号８９ ＡＤＩ２５ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９０ ＳＵＣＣ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９１ ＳＵＣＤ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９２ ＡＣＤＨ６７ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９３ ＫＡＮＭＸマーカーフラグメントの配列を提示する；
配列番号９４ ＩＮＴ１ＬＦ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９５ ＩＮＴ１ＲＦ ＰＣＲフラグメントの配列を提示する；
配列番号９６ 順方向プライマーａｒａＡＢＤカセットの配列を提示する；
配列番号９７ 逆方向プライマーａｒａＡＢＤカセットの配列を提示する
配列番号９８ 順方向プライマーＴｙ１：：ａｒａＡＢＤの配列を提示する；
配列番号９９ 逆方向プライマーＴＹ１：：ａｒａＡＢＤの配列を提示する；
配列番号１００ 順方向プライマーＴｙ１：：ｋａｎＭＸの配列を提示する；
配列番号１０１ 逆方向プライマーＴｙ１：：ｋａｎＭＸの配列を提示する。
［発明の詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「包む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびに変形、たとえば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等は、包括的に解釈されるものとする。すなわち、これらの単語は前後関係が許す場合、明記されていない他の要素や整数の可能性ある包含を表すことを意図する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）を表すために使用される。例として「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素を意味することもあり、２つ以上の要素を意味することもある。
本明細書に記載の発明の様々な実施態様は、交差組合せしてもよい。
本発明は、より詳細に記述されるであろう工程ａ）〜ｇ）を含む、アラビノースを転化できる細胞を製造する方法を提供する：
工程ａ）アラビノースを転化できない宿主株に、遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを導入することであって、この細胞は構築細胞と呼ばれる
工程ａ）は、以下の説明で詳述されるほか、実施例でも例示されるであろう。
工程ｂ）および工程ｃ）アラビノースを転化する細胞が得られるまで、この構築細を適応進化にかけること、任意選択的に、第１のアラビノース転化細胞を適応進化にかけて、アラビノース転化を改良すること；工程ｂ）またはｃ）で製造される細胞は、第１アラビノース転化細胞と呼ばれる；
工程ｂ）およびｃ）は、以下の説明の適応進化のところで詳述されるほか、実施例でも例示される。
工程ｄ）第１アラビノース転化細胞および構築細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部を分析すること；
この工程ｄ）は、ゲノムリシーケンシングという一般の技術を使用して実行することが可能である。
工程ｅ）第１アラビノース転化細胞における一塩基変異多型（ＳＮＰ’ｓ）を同定すること；
第１アラビノース転化細胞と構築細胞のそれとの間の差を見ることによって、
工程ｆ）ＳＮＰ’ｓの情報を、アラビノースを転化できる細胞の合理的設計で使用すること；
工程ｆ）で、熟練者は、アラビノース転化がどのＳＮＰ’ｓに起因するかが分かり、またその情報に基づいて、一般の技能で改良された株を設計することができるであろう。
工程ｅ）、工程ｆ）および／またはｇ）で、熟練者は、好ましくは、表現型検査技術、すなわち望ましい形質を有する細胞の同定、および遺伝子型決定技術、すなわち、選択された形質と関連した候補遺伝子の同定を併用する。
表現型検査のための技術の例は、単一の糖または糖混合物の存在下、振盪フラスコ内または発酵槽内での増殖実験である。また、固体寒天培地上での増殖検定も適用することができる。しかし、他の適当な既知の方法を使用することも可能である。
遺伝子型決定のための技術の例は、リシーケンシング技術、たとえばＳｏｌｅｘａ等、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、サザンブロット法である。しかし、他の好適な既知の方法を使用することも可能である。
工程ｇ）工程ｆ）で設計される、アラビノースを転化できる細胞の構築。工程ｇ）で、新株構築の一般技術全てを使用することが可能である。一実施態様では、親の有利な特性を合併するために、異なる株（親）を組み合わせる。たとえば、工程ｂ）または工程ｃ）の株に存在する全てのＳＮＰ’ｓを具有しない株と交雑される工程ｂ）または工程ｃ）の株を含む交雑技術を使用してもよい。
たとえば、アラビノースを発酵する能力に必要なまたは能力を高める遺伝子で形質転換された（一緒にしてＡＲＡと呼ばれる）１倍体酵母株は、適応進化と呼ばれるプロセスで増強された。適応進化プロセス中に、ｍｕｔ１、ｍｕｔ２およびｍｕｔ３と呼ばれる３つの突然変異がゲノムに導入されていた。このような酵母株の遺伝子型は、ｍｕｔ１ ｍｕｔ２ ｍｕｔ３ ＡＲＡと表記されることもある。
このような酵母株は、やはりアラビノース形質転換に必要な遺伝子からなる、別の１倍体酵母株と交雑してもよいが、そうするための特別な変異を欠くため、そうすることはできない。しかし、この株は別の有益な特性、たとえば、インヒビターに対する耐性を有する。この特性はＡＢＣと呼ばれる。このようなプロセスを図１０に例示する。
ある実施態様では、上記プロセスで、アラビノースを転化できる酵母細胞は、宿主株と比較して増幅されている染色体を有し、ここで、増幅された染色体は、宿主株にａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子が導入された染色体と同数を有する。ある実施態様で、増殖される染色体は染色体ＶＩＩである。ある実施態様では、酵母細胞における、セントロメアを囲む、染色体ＶＩＩの一部が増幅される（宿主株と比較したとき）。ある実施態様では、染色体ＶＩＩの左腕上の領域が３倍増幅された。ある実施態様では、染色体ＶＩＩの右腕の一部が２倍増幅され、隣接部分は３倍増幅された（図１２参照）。
３倍増幅された染色体ＶＩＩの右腕部分は、アラビノース発現カセット、すなわち強力な構成的プロモーターの制御下にある遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを含む。
本発明はさらに、電気泳動法で測定するとき、酵母細胞ＢＩＥ２０１を除き、染色体ＶＩＩが１３００〜１６００Ｋｂのサイズを有するａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子を有する酵母細胞に関する。株ＢＩＥ２０１は、国際公開第２０１１００３８９３号パンフレットに開示されている。
ＢＩＥ２０１は、一塩基変異多型、ＳＳＹ１遺伝子におけるＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子におけるＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子におけるＡ１１８６Ｇ、およびＧＡＬ８０遺伝子におけるＡ４３６Ｃ全てを有する。
ある実施態様では、酵母細胞における、ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子のコピー数は２〜１０であり、ある実施態様ではそれぞれ２〜８または３〜５である。ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子のコピー数は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。コピー数は、熟練者に既知の方法で決定することが可能である。好適な方法を実施例に例示し、結果をたとえば図１２に示す。
ある実施態様では、酵母細胞は、突然変異ＳＳＹ１遺伝子におけるＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子における突然変異Ａ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子における突然変異Ａ１１８６Ｇ、およびＧＡＬ８０遺伝子における突然変異Ａ４３６Ｃからなる群から選択される一塩基多型の１つ以上を有するが、全てを有する訳ではない。ある実施態様で、酵母細胞はＧＡＬ８０遺伝子に単一多型Ａ４３６Ｃを有する。ある実施態様では、酵母細胞はＣＥＰ３遺伝子に単一多型Ａ１１８６Ｇを有する。
［性接合］
拡散性分子、フェロモン類、により仲介される酵母の交配は容易に証明することができる（Ｍａｎｎｅｙ，Ｄｕｎｔｚｅ ＆ Ｂｅｔｚ １９８１）。反対の交配型の細胞が、ペトリ皿の寒天増殖培地の表面上で混合されるとき、２〜３時間以内に変化が明らかになる。各型の細胞は、そのフェロモンを培地中に分泌するため、反対型により生成されるものに応答する（ＭａｃＫａｙ ＆ Ｍａｎｎｅｙ １９７４）。それらは、特化した機能形、配偶子に分化することによってそれぞれ応答する。細胞は分裂を止め、変形する。細胞は伸長し、梨型になる。これらの独特の細胞は、「シュムー」と呼ばれている。接触しているかまたはごく接近している反対の交配型の細胞は表面で結合し、中央の狭窄を有する特徴的な「ピーナッツ」形、すなわち小端で融合した２つのシュムー、を形成して融合する。各結合対内の２つの１倍体核は融合して２倍体核を生じ、真の接合体を形成する。この２倍体は狭窄部で直ちに出芽し、特徴的な「クローバーの葉」形を形成する。これらのステージは全て、顕微鏡下で容易に確認することができる。
１倍体細胞により分泌される接合フェロモンは、寒天中を拡散する小ペプチド分子である（Ｂｅｔｚ，Ｍａｎｎｅｙ ＆ Ｄｕｎｔｚｅ １９８１）。結果として、それらの存在および反対の交配型の細胞に対するそれらの影響は、容易に証明される。交配型α（アルファ）の細胞を寒天培地上で一晩増殖させると、増殖を囲む寒天中に高濃度のフェロモンが蓄積する。交配型ａ（ｍａｔＡまたはｍａｔａ）の細胞をこの寒天上に置くと、２時間以内に「シュムー」変形を受け始める。交配型α（アルファ）細胞を増殖させた液体培地中で、同じ作用を証明することができる。
［減数分裂］
シュムーは、酵母における配偶子である。シュムーは、反対の交配型の細胞が存在する時だけ、通常の栄養１倍体細胞から分化する。同様の方法で、どの２倍体細胞も、減数分裂を受けて、配偶子になる可能性を有する１倍体を形成することができる（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ＆ Ｋｌａｐｈｏｌｚ １９８１；Ｆｏｗｅｌｌ １９６９）。減数分裂は、２倍体細胞を栄養的にアンバランスな培地にトランスファーしたとき開始する胞子形成のプロセスの一部であるが、その変化は、子嚢が極めて特徴的になる３〜５日後にだけ、顕微鏡下で明らかになる。理論的には、全ての子嚢が４つの胞子を含むはずであるが実際には、２つまたは３つしか含まないものもある。子嚢は特徴的な形状を有する。胞子形成混合物を、消化酵素（たとえばチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）、グルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ））の入手しやすい粗調製品で処理することより、子嚢の壁が除去され、胞子が放出される。胞子は、子嚢内であれ放出された後であれ、栄養的に十分な環境に戻ると、発芽して安定した１倍体相で栄養増殖する。１倍体株は、ａおよびα（アルファ）と呼ばれる、２つの交配型で生じる。各子嚢内で、２つの胞子は通常交配型ａ（ｍａｔＡ）であり、残りの２つはα（ｍａｔα（アルファ））である。一方の交配型の細胞が、他方の交配型の１つと出会うと、それらは接合につながる一連の事象を開始する（性接合参照）。結果として２倍体細胞が生じ、これは安定した２倍体相で有糸細胞分裂によって増殖する。胞子形成した細胞培養をただ増殖培地にトランスファーするに過ぎなければ、その結果として、１倍体株と、２倍体高等生物間の交雑による子孫と類似した新たな２倍体株との、混合個体群を生じる。
通常、酵母遺伝学者は、１倍体株が交配して次世代の２倍体株を形成するのを防ぐために、無作為にまたは顕微鏡操作により、胞子を分離する。この調節度および１倍体相で遺伝形質を確認できることが、酵母における遺伝子解析を強力で効率的にする。
［適応］
適応は、個体または個体群がその生息環境にさらに良く適するようになる（適応する）進化のプロセスである。このプロセスは数世代から多世代にわたって起こり、また生物学の基本的現象の１つである。
用語適応はまた、生物の生存に特に重要な特徴も指すことがある。このような適応は、自然淘汰によって、よりうまく繁殖するより適した形で、可変個体群に生じる。
環境条件の変化は、新たな条件下での生物の適合性を改善する、その後の適応の選択的利益に影響を及ぼし、自然淘汰の結果を変える。極度の環境変化の場合、有益な適応の出現および固定が生存に不可欠であろう。多くの様々な因子、たとえば栄養利用性、温度、酸素の利用率等が適応進化を推進できる。
［合性］
適応（ａｄａｐｔｅｄｎｅｓｓ）（所与の生息環境で生物が生存および繁殖できる程度）と適合性（ｆｉｔｎｅｓｓ）との間には明らかな関係がある。適合性は自然淘汰率の推量であり予測変数である。自然淘汰の適用によって、二者択一的表現型の相対的頻度は、遺伝的である場合、やがて変化するであろう。
［遺伝子変化］
自然淘汰が個体群の遺伝的変異性に影響を与えるとき、遺伝子変化が基本的な機序である。この方法によって、個体群はその環境に遺伝的に適応する。遺伝子変化は、可視構造を生じることもあり、変化した生息環境に適する方法で生物の生理活動を調整することもある。
生息環境が頻繁に変化することもある。したがって、適応のプロセスは決して最終的に完結していないということになる。やがて、環境が徐々に変化し、種はその環境にますます適合するようになるかもしれない。一方、環境の変化が比較的急速に起こり、そして種が次第に適合できなくなるかもしれない。適応は遺伝的プロセスであって、個体群が生息環境や環境を変えないときも、ある程度は常に続く。
ＤＮＡ配列の単一ヌクレオチドが変わる（置換）、除去される（欠失）または加わる（挿入）ことがある。挿入ＳＮＰｓまたは欠失ＳＮＰｓ（ＩｎＤｅｌｓ）は、翻訳フレームをシフトする可能性がある。
一塩基変異多型は、遺伝子のコード配列（オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅｓ）すなわちＯＲＦ）内、遺伝子の非コード領域（プロモーター配列、ターミネーター配列等）内、または遺伝子の間の遺伝子間領域内にあるかもしれない。コード配列内のＳＮＰｓは、遺伝子コードの縮重のため、転写および翻訳の後で生成される対応する蛋白質のアミノ酸配列を必ずしも変えるとは限らない。両方の形が同一ポリペプチド配列をもたらすＳＮＰは、同義である（サイレント変異）と言われる。異なるポリペプチド配列が生成されるのであれば、それらは非同義である。非同義変化は、ミスセンスまたはナンセンスのいずれかである可能性がある。ミスセンス変化は、対応するポリペプチドに異なるアミノ酸をもたらすが、ナンセンス変化は、結果として未成熟終止コドンを生じ、時には短縮蛋白質の形成をもたらすこともある。
蛋白質コード領域中ではないＳＮＰｓは、たとえば変化した転写因子結合または対応するｍＲＮＡの安定性によって、遺伝子発現に影響を与える可能性がまだある。
ＤＮＡで起こり得る変化は、必ずしもただ一つのヌクレオチドの変化（置換、欠失または挿入）に限定されるわけではなく、２つ以上のヌクレオチドの変化（小核変異（Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ））を含むこともある。
加えて、染色体転座が生じることもある。染色体転座は、非相同染色体間の一部の再構成に起因する染色体異常である。
特に、本発明によれば、ＳＮＰは以下のリーディングフレーム：ＳＳＹ１、ＣＥＰ３およびＧＡＬ８０中に作られる。
ＳＳＹ１は、本明細書では、ＳＰＳ形質膜アミノ酸センサー系（Ｓｓｙ１ｐ−Ｐｔｒ３ｐ−Ｓｓｙ５ｐ）の構成要素であり、外部アミノ酸濃度を感知し、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子の発現を制御するという結果を招く細胞内シグナルを伝達する。
ＣＥＰ３は、本明細書では、セントロメアのＣＤＥＩＩＩ領域を結合するＣＢＦ３複合体の構成要素である、必須動原体蛋白質であり；Ｎ−末端Ｚｎ２Ｃｙｓ６型亜鉛フィンガードメイン、Ｃ−末端酸性ドメイン、および推定コイルドコイル二量体形成ドメインを含む。
ＧＡＬ８０は、本明細書では、ガラクトースの非存在下で、ＧＡＬ遺伝子の抑制に関与する転写制御因子である。一般に、ＧＡＬ８０はＧａｌ４ｐによる転写活性化を阻害し、その阻害はＧａｌ３ｐまたはＧａｌ１ｐ結合によって緩和される。
本発明によれば、遺伝子ＳＳＹ１、遺伝子ＣＥＰ３および遺伝子ＧＡＬ８０におけるＳＮＰ’ｓは、細胞が混合糖組成物を発酵できるために重要であることが証明されている。これらの遺伝子で発見されたＳＮＰ’ｓについてＢＬＡＳＴ探索が実施された。
同定されたＳＮＰの概要を表１に示す：
Figure 2013524797
ＳＮＰを含む一陣の遺伝子は、以下のデータをもたらした：
Ｓｓｙ１ｐ（ＡＡトランススーパーファミリーのメンバー）
ＳＰＳ形質膜アミノ酸センサー系（Ｓｓｙ１ｐ−Ｐｔｒ３ｐ−Ｓｓｙ５ｐ）の構成要素であって、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子の発現を制御するという結果を招く、細胞外アミノ酸濃度を感知して細胞内シグナルを伝達する［サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］
Figure 2013524797
Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ２０１で見られる短い蛋白質は、独特の特徴である。
［ＹＪＲ１５４ｗ（ＰｈｙＨスーパーファミリーのメンバー）］
機能未知の推定蛋白質；緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）−融合蛋白質は、細胞質に局在する［サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］
Figure 2013524797
これらの全蛋白質で、１７１位（またはＢＬＡＳＴ結果に基づく等価位置）のＤ残基が保存される。
ＣＥＰ３（ＧＡＬ４様Ｚｎ２Ｃｙｓ６二核クラスターＤＮＡ−結合ドメイン；ＧＡＬ４のような転写制御因子に見られる）
Figure 2013524797
これらの全蛋白質で、３９６位（またはＢＬＡＳＴ結果に基づく等価位置）のＳ残基が保存される。
［ＧＡＬ８０（ＮＡＤＢ Ｒｏｓｓｍａｎｎスーパーファミリーのメンバー）］
Figure 2013524797
これらの全蛋白質で、１４６位（またはＢＬＡＳＴ結果に基づく等価位置）のＴ残基が保存される。
［糖組成物］
本発明による糖組成物は、グルコース、アラビノースおよびキシロースを含む。このような基準を満たすあらゆる糖組成物を本発明で使用することが可能である。糖組成物における任意選択的な糖類はガラクトースおよびラムノースである。好ましい実施態様で、糖組成物は、１つ以上のリグノセルロース物質の加水分解物である。本明細書で、リグノセルロースはヘミセルロースおよびバイオマスのヘミセルロース部分を含む。またリグノセルロースは、バイオマスのリグノセルロース画分も含む。好適なリグノセルロース物質は、以下のリストにあるであろう：果樹プライミング、チャパラル、工場廃液、都市廃木材、都市廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、産業廃棄物、麦わら、燕麦わら、稲わら、大麦わら、ライ麦わら、生茎、大豆外皮、もみ殻、稲わら、トウモロコシグルテン飼料、燕麦外殻、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシの茎、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、スイッチグラス、茅、砂糖もろこし、キャノーラの茎、大豆の茎、プレ−リーグラス、ガマグラス、フォックステイルグラス；甜菜パルプ、柑橘類パルプ、種外皮、セルロース動物排泄物、刈り取った芝、綿、海藻、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、マツ、灌木、牧草、小麦、麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシの皮、トウモロコシホッブ、トウモロコシ穀粒、穀粒由来の維維、穀類の湿潤製粉または乾燥製粉からの生成物および副生成物、都市固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草本材、農業廃棄物、森林廃棄物、都市固形廃棄物、紙屑、パルプ、製紙工場廃棄物、枝、低木、茎、トウモロコシ、トウモロコシの皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀類、草、草本作物、葉、樹皮、針、丸太、根、苗木、灌木、スイッチグラス、樹木、野菜、果実の皮、つる、甜菜パルプ、粗挽小麦粉、燕麦外皮、硬材または軟材、農産プロセスから発生する有機廃棄物、森林廃材、またはそれらの任意の２つ以上の組合せ。
リグノセルロース由来の若干の好適な糖組成物およびそれらの加水分解物の糖組成物の概要を表１に示す。記載のリグノセルロースは：トウモロコシの穂軸、トウモロコシ繊維、もみ殻、メロンシェル、甜菜パルプ、麦わら、サトウキビバガス、木、草およびオリーブ窄油を含む。
Figure 2013524797
これらのリグノセルロースには、多量の糖がグルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの形で存在することが、表１から明らかである。グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの発酵産物への転化は、このように経済上極めて重要である。またラムノースは、前述した糖類より少量でも、一部のリグノセルロース物質に存在する。したがって、ラムノースが混合糖細胞によって転化されることもまた有利である。
［前処理および酵素加水分解］
本発明に従って発酵され得る糖類をリグノセルロース物質（ヘミセルロース物質を含む）から遊離するために、前処理および酵素加水分解を必要とすることがある。これらの工程は、従来の方法で実行することが可能である。
［混合糖細胞］
遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを含む混合糖細胞を、以下に定義する通りに、混合糖細胞ゲノムに組み込んだ。それは、グルコース、アラビノース、キシロース、ガラクトースおよびマンノースを発酵することができる。本発明の一実施態様で、混合糖細胞は１つ以上のさらなる糖、好ましくはＣ５糖および／またはＣ６糖を、発酵することができる。本発明のある実施態様で、混合糖細胞は：混合糖細胞がキシロースを発酵できるようにする、ｘｙｌＡ−遺伝子および／またはＸＫＳ１−遺伝子；アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞内でペントース経路を通る流量を増加できるようにするＰＰＰ−遺伝子ＴＡＬ１、ＰＰＰ−遺伝子ＴＫＬ１、ＰＰＰ−遺伝子ＲＰＥ１およびＰＰＰ−遺伝子ＲＫＩ１の過剰発現；の１つ以上を含む。
［混合糖株の構築］
宿主細胞への導入によって、遺伝子を混合糖細胞に導入することが可能である：
ａ）強力なプロモーターの制御下にあるＰＰＰ−遺伝子ＴＡＬ１、ＰＰＰ−遺伝子ＴＫＬ１、ＰＰＰ−遺伝子ＲＰＥ１およびＰＰＰ−遺伝子ＲＫＩ１からなるクラスター；
ｂ）共に構成的プロモーターの制御下にあるｘｙｌＡ−遺伝子およびＸＫＳ１−遺伝子からなるクラスター
ｃ）遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤからなるクラスターおよび／またはｘｙｌＡ−遺伝子および／またはＸＫＳ１−遺伝子からなるクラスター；
ならびに
ｄ）アルドースレダクターゼ遺伝子の欠失
および混合糖細胞を製造するための適応進化。上記細胞は、組み換え発現技術を使用して構築することが可能である。
［組み換え発現］
本発明の細胞は、組み換え細胞である。すなわち、本発明の細胞は、問題になっている細胞中に本来存在しないヌクレオチド配列を含むか、またはそのヌクレオチド配列で形質転換されるか遺伝子改変されている。
細胞における酵素の組み換え発現のための技術も、本発明の細胞の追加的遺伝子改変のための技術も、当業者に周知である。一般にこのような技術は、関連配列を含む核酸構築物を用いた細胞の形質転換を含む。このような方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）等の、標準ハンドブックから分かる。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変のための方法は、たとえば、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５ ５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から分かる。
一般に、核酸構築物は、プラスミド、たとえば低コピープラスミドまたは高コピープラスミドであってもよい。本発明による細胞は、たとえば、ヌクレオチド構築物の複数のコピーによって、あるいは酵素配列の複数のコピーを有する構築物を使用することによって、酵素をコード化するヌクレオチド配列の１つまたは複数のコピーを含むことが可能である。
核酸構築物はエピソームに保持されてもよく、したがって、常染色体複製配列配列等の自律複製のための配列を含んでもよい。好適なエピソーム性核酸構築物は、たとえば酵母２μプラスミドまたはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５）、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づいていてもよい。あるいは、各核酸構築物を１つ以上のコピーで細胞のゲノム中に組み込んでもよい。細胞ゲノムへの組み込みは異種組み換えで無作為に起きる可能性があるが、好ましくは核酸構築物は、当該技術分野で周知のような、同種組み換えによって細胞ゲノムに組み込むことが可能である（たとえば国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照）。
大抵のエピソーム性プラスミドまたは２μプラスミドは比較的不安定であり、各世代の後、およそ１０−２以上の細胞が失われている。選択的増殖条件下でさえも、細胞の６０％〜９５％のみがエピソーム性プラスミドを保持する。大抵のエピソーム性プラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主細胞当たり１０〜４０の範囲である。しかし、プラスミドは細胞間で均等に分布しておらず、個体群における細胞当たりのコピー数は極めて多様である。組み込みプラスミドで形質転換された株は、選択圧の非存在下でさえも極めて安定している。しかし、縦列反復ＤＮＡ間の同種組み換えによっておよそ１０−３〜１０−４の頻度でプラスミド損失が起きる可能性があり、ベクター配列のループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ ｏｕｔ）を招くことがある。好ましくは、安定した組み込みがこのような場合のベクター設計は、選択マーカー遺伝子損失（やはり、分子内の、同種組み換えにより起きる）の際に、組み込まれた構築物のループアウトはもはやあり得ないものである。好ましくは、遺伝子はこのように安定的に組み込まれる。安定した組み込みは、本明細書では、組み込まれた構築物のループアウトがもはやあり得ない、ゲノムへの組み込みと定義される。好ましくは、選択マーカーは存在しない。一般に、酵素コード化配列は、酵素配列の転写および／または翻訳を提供できるかまたは援助できる、１つ以上の核酸配列に操作可能に連結される。
用語「操作可能に連結される」は、記述されている諸構成要素が、所期の方法でそれらを機能させる関係である、並置を指す。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に操作可能に連結され、前記プロモーターまたはエンハンサーはそのコード配列の転写に影響を及ぼす。
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置する１つ以上の遺伝子の転写を制御するように機能し、そしてＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位および当業者に周知の他のＤＮＡ配列のための結合部位の存在によって構造的に同定される、核酸フラグメントを指す。「構成的」プロモーターは、大抵の環境条件下および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境制御下または発生制御下で活性なプロモーターである。
本発明による酵素をコードしているヌクレオチド配列の発現を達成するために使用できるであろうプロモーターは、発現させるべき酵素をコードしているヌクレオチド配列に本来備わっていなくてもよい、すなわち操作可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）と異種であるプロモーターである。しかし、プロモーターは、宿主細胞と同種、すなわち内因性であってもよい。
プロモーターは広く入手可能であり、熟練者に知られている。このようなプロモーターの好適な例としては、たとえば、解糖系遺伝子由来のプロモーター、たとえば酵母または糸状菌由来のホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどがあり；酵母由来のこのようなプロモーターに関するさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見られるであろう。他の有用なプロモーターは、遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨｌ、ＡＤＨ４等）、およびエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）をコード化する、リボソーム蛋白質である。他のプロモーター（構成プロモーターも誘導プロモーターも）、およびエンハンサーまたは上流活性化配列は、当業者に分かるであろう。本発明の宿主細胞で使用されるプロモーターは、必要に応じて、それらの制御特性に影響を及ぼすように改変してもよい。これに関連して、好適なプロモーターは、構成的および誘導的な天然プロモーターおよび遺伝子操作プロモーターを含み、当業者に周知である。真核宿主細胞で好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、およびＡＯＸ１であろう。他の好適なプロモーターとしては、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨ３などがある。
本発明の細胞で、酵素をコード化するヌクレオチド酸配列の３’−末端は好ましくは転写ターミネーター配列に操作可能に連結される。好ましくは、ターミネーター配列は、最適な宿主細胞、たとえば、最適な酵母種等で、操作可能である。いずれにせよ、ターミネーターの選択は重大ではない；たとえば、ターミネーターは任意の酵母遺伝子に由来してもよく、時には非酵母、真核の、遺伝子由来でも働くこともある。通常、酵素をコード化するヌクレオチド配列は、ターミネーターを含む。好ましくは、このようなターミネーターは、本発明の宿主細胞内で、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解を防止する変位と結合される（たとえばＳｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１：１４６５−１４８２参照）。
転写終結配列はさらに好ましくは、ポリアデニル化信号を含む。
任意選択的に、本発明で使用するのに好適な核酸構築物に選択可能マーカーが存在してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「マーカー」は、そのマーカーを含む宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコード化する遺伝子を指す。マーカー遺伝子は、適切な抗生物質を使用して形質転換されていない細胞の中から形質転換細胞を選択できる、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。好適な抗生物質耐性マーカーの例としては、たとえばジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性およびＧ４１８耐性）などがある。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換に最も便利かもしれない。また、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰｌ、ＬＥＵ２）やＳ．ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ ４０：１２５−１３０により記述されている）等の、非抗生物質耐性マーカーも使用することが可能である。好ましい実施態様で、核酸構築物で形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含んでいない。組み換えマーカー遺伝子を含まない微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開第Ａ−Ｏ６３５５７４号明細書に開示されており、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子や酵母ＵＲＡ３遺伝子およびＬＹＳ２遺伝子等の、双方向マーカーの使用に基づいている。あるいは、緑色蛍光蛋白質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ等の、スクリーニング可能マーカーを、形質転換細胞のスクリーニングを可能にする本発明の核酸構築物に組み込んでもよい。
本発明で使用するのに好適な核酸構築物に存在してもよい任意選択的なさらなる要素としては、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、組み込み因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス付着（ＭＡＲ）配列等があるが、これらに限定されない。本発明の核酸構築物は、ＡＲＳ配列等の、自律複製のための配列をさらに含んでもよい。
組み換えプロセスはしたがって、既知の組み換え技術で実行することが可能である。本発明の細胞における酵素の発現および過剰発現のための様々な手段が、当業者に知られている。特に、たとえば、宿主細胞のゲノムに遺伝子の追加的コピーを組み込むことによって、エピソームの多コピー発現ベクターから遺伝子を発現させることによって、または遺伝子の複数のコピーを含むエピソーム性発現ベクターを導入することによって、宿主細胞内の酵素をコードしている遺伝子のコピー数を増加することにより、酵素を過剰発現させることが可能である。
あるいは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現させるべき酵素をコードしている配列に本来備わっていないプロモーター、すなわち操作可能に連結されるコード配列と異種であるプロモーターを使用することにより達成することが可能である。プロモーターは好ましくは、プロモーターが操作可能に連結されるコード配列と異種であるが、プロモーターは同種であること、すなわち宿主細胞内因性であることも好ましい。好ましくは異種プロモーターは、そのコード配列に本来備わっているプロモーターより高い定常状態レベルの、コード配列を含む転写産物を生成することができる（または、単位時間当たり、より多い転写産物分子、すなわちｍＲＮＡ分子、を生成することができる）。これに関連して、好適なプロモーターとしては、構成的および誘導的な天然プロモーターおよび遺伝子操作プロモーターなどがある。
上述の酵素の過剰発現に使用されるコード配列は、好ましくは本発明の宿主細胞と同種である。しかし、本発明の宿主細胞と異種であるコード配列を使用してもよい。
遺伝子改変された細胞における酵素の生成に言及するとき、酵素の過剰発現は、同一条件下で、酵素が、非改変宿主細胞に比べて特定の酵素活性が高レベルで、生成されることを意味する。通常、これは、同一条件下で、非改変宿主細胞に比べて多量に、というよりむしろ高い定常状態レベルで、酵素的に活性な蛋白質（または多サブユニット酵素の場合には蛋白質類）が生成されることを意味する。同様に、これは通常、同一条件下で、非改変宿主細胞に比べて多量に、というよりやはりむしろ高い定常状態レベルで、酵素的に活性な蛋白質をコードしているｍＲＮＡが生成されることを意味する。好ましくは、本発明の宿主細胞で、過剰発現されるべき酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除けば遺伝学的に同一である株に比べて、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０という係数だけ過剰発現される。こうしたレベルの過剰発現は、定常状態レベルの酵素の活性、定常状態レベルの酵素の蛋白質、ならびに定常状態レベルの、その酵素をコードしている転写産物に当てはまる可能性があると理解すべきである。
［適応進化］
混合糖細胞は、調製時に、適応進化を受ける。本発明の細胞は、好ましくは唯一の炭素源としての所望の糖で、そしてさらに好ましくは嫌気的条件下で増殖するために、自然発生的であれ誘発的（たとえば、放射線または薬剤による）であれ、突然変異体の選択によって、糖利用に適応させることが可能である。突然変異体の選択は、たとえば、Ｋｕｙｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）により記述されているように、培養の連続トランスファーを含む技術によって、またはケモスタット培養における選択圧下での培養によって、実施することが可能である。たとえば、本発明の好ましい宿主細胞で、突然変異体の選択により得られる改変を含む、上記遺伝子改変の少なくとも１つは、炭素源としての、好ましくは唯一の炭素源としての、キシロースで、そして好ましくは嫌気的条件下で、増殖する能力を宿主細胞に与える。好ましくは、その細胞は、キシリトールを本質的に全く生成しない、たとえば、生成されるキシリトールは検出限界未満である、すなわち、たとえば、モル基準で、消費された炭素の約５、約２、約１、約０．５、または約０．３％未満である。
適応進化はまた、たとえばＷｉｓｓｅｌｉｎｋ Ｈ．Ｗ．ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａｕｇ．２００７，ｐ．４８８１−４８９１にも記述されている。
適応進化の一実施態様では、異なる培地、たとえば、組成が異なる３培地（グルコース、キシロース、およびアラビノース；キシロースおよびアラビノース）中で連続増殖のサイクルを繰り返す反復バッチ培養からなるレジメンが適用される。Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００９，ｐ．９０７−９１４を参照されたい。
［宿主細胞］
宿主細胞は、有用な生成物の生成に好適な任意の宿主細胞であってもよい。本発明の細胞は、任意の好適な細胞、たとえば細菌等の原核細胞、または真核細胞等であってもよい。一般に、その細胞は真核細胞、たとえば酵母または糸状菌であろう。
酵母は、本明細書では真核微生物と定義され、単細胞形で主に成長するユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）。
酵母は、単細胞葉状体の出芽によっても増殖でき、また生物体の分裂によっても増殖できる。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属してもよい。好ましい酵母は、嫌気性発酵ができるもの、より好ましくは嫌気性アルコール発酵ができるものである。
糸状菌は、本明細書では亜門ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の全ての糸状形を含む真核微生物と定義される。これらの真菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖類で構成される栄養菌糸体を特徴とする。本発明の細胞として使用するのに好適な糸状菌は、形態学的、生理学的および遺伝学的に酵母とは異なる。大抵の真菌は増殖に無菌状態を必要とせず、またバクテリオファージ感染に鈍感であるため、糸状菌の細胞は有利に使用することが可能である。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、また大抵の糸状菌の炭素異化は偏性好気性である。本発明の宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属してもよい。より好ましくは、この糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）細胞、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）細胞、またはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞であってもよい。
一実施態様で、宿主細胞は酵母であってもよい。
好ましくは、宿主は産業用宿主であり、より好ましくは産業用酵母である。産業用宿主および産業用酵母細胞は、以下のように定義することが可能である。産業プロセスにおける酵母細胞の生活環境は、研究室におけるものと著しく異なる。産業用酵母細胞は、プロセス中に変化する可能性がある多種多様な環境条件下で首尾よく働かなければならない。このような変化としては、栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度等があり、それらは一緒に、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞増殖およびエタノール生成に潜在的影響を及ぼす。環境耐性株は、不利な産業環境で活発な増殖および生成ができなくてはならない。産業用酵母株は概して、使用される用途で、たとえば製パン業、醸造業、ワイン醸造業およびエタノール産業等で、生じる可能性があるこうした環境条件の変化に対してより頑強である。産業用酵母（Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
ある実施態様で、宿主はインヒビター耐性である。インヒビター耐性宿主細胞は、たとえば、インヒビター耐性Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ ２６６０２が選択された、Ｋａｄａｒ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８に例示されているような、インヒビター含有物質での増殖に関して株をスクリーニングすることにより選択することが可能である。
好ましくは、宿主細胞は産業用でありかつインヒビター耐性である。
［ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子］
本発明の細胞はアラビノースを使用できる。本発明の細胞はしたがって、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸、および／または所望の発酵産物、たとえば本明細書に記載のものの１つに、転化できる。
Ｌ−アラビノースからエタノールを生成できる生物、たとえばＳ．セルビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な起源ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）遺伝子、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）遺伝子およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入する細胞の改変によって製造することが可能である。このような遺伝子は、アラビノースを使用できるように、本発明の細胞に導入することが可能である。このような手法は国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに記述されている。ラクトバチルス・プランタナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｎｕｍ）由来のａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、また国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｒａＡ遺伝子ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子を使用してもよく、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示されている。
［ＰＰＰ−遺伝子］
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路の流量を増加する１つ以上の遺伝子改変を含んでもよい。特に、その遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の非酸化的部分を通る流量増加につながる可能性がある。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量増加を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、流量増加を引き起こす遺伝子改変を除けば遺伝学的に同一である株に比べて、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０という係数だけ流量を増加する改変を意味すると理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、キシロース比消費速度を測定し、キシリトールが生成される場合、キシリトール比生成速度をキシロース比消費速度から減算し、唯一の炭素源としてのキシロースでの、改変宿主の増殖によって測定することが可能である。しかし、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量は、唯一の炭素源としてのキシロースでの増殖速度と、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロースでの嫌気的増殖速度と、正比例している。唯一の炭素源としてのキシロースでの増殖速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量との間には直線関係がある。糖でのバイオマスの収率は一定であるため、キシロース比消費速度（Ｑｓ）は、糖でのバイオマスの収率（Ｙｘｓ）で割った増殖速度（μ）に等しい（所与の条件下：嫌気的、増殖培地、ｐＨ、株の遺伝学的背景等；すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）。したがって、輸送がない（取り込みが限定的である）のであれば、こうした条件下で、最大増殖速度の増加からペントースリン酸経路の非酸化的部分の流量増加を推定することが可能である。
ペントースリン酸経路の流量を増加する１つ以上の遺伝子改変は、様々な方法で宿主細胞に導入することが可能である。この中には、たとえば、より高い定常状態活性レベルのキシルロースキナーゼおよび／またはペントースリン酸経路の非酸化的部分の酵素の１つ以上および／または低下した定常状態レベルの不特定のアルドースレダクターゼ活性を達成することが含まれる。定常状態活性レベルのこうした変化は、（自然発生的なまたは薬剤または放射線によって誘発された）突然変異体の選択および／または組み換えＤＮＡテクノロジーによって、たとえば酵素をコード化する遺伝子またはこれらの遺伝子を制御する因子の、それぞれ、過剰発現または不活性化によって、遂行することが可能である。
好ましい宿主細胞で、遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の（非酸化的部分の）少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは、酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコード化する酵素類からなる群から選択される。ペントースリン酸経路の（非酸化的部分の）酵素類の様々な組合せを過剰発現させることが可能である。たとえば、過剰発現される酵素は、少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素およびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素およびトランスケトラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素およびトランスケトラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともトランスケトラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素、トランスケトラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素、トランスケトラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素、およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素、およびトランスケトラーゼ酵素であってもよい。本発明の一実施態様で、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素、トランスケトラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素はそれぞれ、宿主細胞で過剰発現される。そのような宿主細胞は既にキシロースで嫌気的増殖できるため、遺伝子改変が少なくともトランスケトラーゼ酵素およびトランスアルドラーゼ酵素の両者の過剰発現を含む宿主細胞はさらに好ましい。事実、ある条件下で、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は、４酵素全部、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じ、キシロースでの嫌気的増殖速度を既に有する。さらに、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ酵素およびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両者を過剰発現する宿主細胞は、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞より好ましく、それはこれらの酵素の１つのみが過剰発現するとき代謝不均衡を招来する可能性があるためである。
酵素「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」（ＥＣ ５．１．３．１）は本明細書では、Ｄ−キシルロース ５−リン酸のＤ−リブロース ５−リン酸へのエピマー化を触媒し、またその逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリスロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース ３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸 ３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース ５−リン酸 ３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース ５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸 ３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸 ３−エピメラーゼ；またはＤ−リブロース−５−リン酸 ３−エピメラーゼとしても知られる。リブロース ５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されることがある。同様に、リブロース ５−リン酸エピメラーゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、リブロース ５−リン酸エピメラーゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。リブロース ５−リン酸エピメラーゼをコード化するヌクレオチド配列を、本明細書ではＲＰＥ１と呼ぶ。
酵素「リブロース ５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ ５．３．１．６）は本明細書では、Ｄ−リボース ５−リン酸のＤ−リブロース ５−リン酸への直接異性化を触媒し、またその逆も触媒する、酵素と定義される。酵素は、ホスホペントースイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース ５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；またはＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されることがある。同様に、リブロース ５−リン酸イソメラーゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、リブロース ５−リン酸イソメラーゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。リブロース５−リン酸イソメラーゼをコード化するヌクレオチド配列を、本明細書ではＲＰＩ１と呼ぶ。
酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ ２．２．１．１）は本明細書では、反応：Ｄ−リボース ５−リン酸＋Ｄ−キシルロース ５−リン酸＜−＞セドヘプツロース ７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド ３−リン酸を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼまたはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても知られる。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸によってさらに定義されることがある。同様に、トランスケトラーゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、トランスケトラーゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。トランスケトラーゼをコード化するヌクレオチド配列を、本明細書ではＴＫＬ１と呼ぶ。
酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ ２．２．１．２）は本明細書では、反応：セドヘプツロース ７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド ３−リン酸＜−＞Ｄ−エリスロース ４−リン酸＋Ｄ−フルクトース ６−リン酸を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；またはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても知られる。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されることがある。同様に、トランスアルドラーゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、トランスアルドラーゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。トランスケトラーゼをコード化するヌクレオチド配列を、本明細書ではＴＡＬ１呼ぶ。
［キシロースイソメラーゼ遺伝子］
キシロースイソメラーゼをコード化するヌクレオチド配列の存在は、キシロースをキシルロースに異性化する能力を細胞に与える。本発明によれば、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５コピーが宿主細胞に導入される。
一実施態様では、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５コピーが宿主細胞に導入される。
「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ ５．３．１．５）は本明細書では、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの直接異性化および／またはその逆を触媒する酵素と定義される。その酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。キシロースイソメラーゼは本明細書では、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の転化を触媒できる可能性がある（したがってグルコースイソメラーゼと呼ばれることもある）。キシロースイソメラーゼは本明細書では、補因子として、マグネシウム、マンガンまたはコバルト等の二価カチオンを必要とすることがある。
したがって、本発明の細胞は、キシロースをキシルロースに異性化できる。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、定義されたキシロースイソメラーゼをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸構築物を用いた宿主細胞の形質転換によって宿主細胞に与えられる。本発明の細胞は、キシロースのキシルロースへの直接異性化によってキシロースをキシルロースに異性化する。キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼによってそれぞれ触媒される、キシロースがキシリトール中間体を経てキシルロースに２工程で転化されるのとは対照的に、これは、キシロースイソメラーゼにより触媒される単一反応でキシロースがキシルロースに異性化されることを意味すると理解される。
キシロースイソメラーゼ活性の単位は、Ｋｕｙｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４：６９−７８）により記述されている条件下で、１分当たり１ｎｍｏｌのキシルロースを生成する酵素の量と、本明細書では定義することが可能である。キシロースイソメラーゼ遺伝子は、例えば国際公開第２００６／００９４３４号パンフレットに開示されているピロミセス種（Ｐｙｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）等の、様々な起源を持ってもよい。他の好適な起源は、バクテロデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／５２６２３号明細書に記載のバクテロイデス・ユニフォミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｍｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２５号明細書に記載のバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２１号明細書に記載のサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２０号明細書に記載のクロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）である。
［ＸＫＳ１遺伝子］
本発明の細胞は、特定のキシルロースキナーゼ活性を高める１つ以上の遺伝子改変を含んでもよい。好ましくは、遺伝子改変は、たとえばキシルロースキナーゼをコード化するヌクレオチド配列の過剰発現によって、キシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコード化する遺伝子は、宿主細胞内因性であってもよく、宿主細胞とは異種であるキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞でキシルロースキナーゼの過剰発現用に使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列である。
酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ ２．７．１．１７）は本明細書では、反応ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース ５−リン酸を触媒する酵素と定義される。この酵素は、リン酸化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼまたはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース ５−ホスホトランスフェラーゼとしても知られる。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によってさらに定義されることもある。同様に、キシルロースキナーゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、キシルロースキナーゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。
本発明の細胞で、特定のキシルロースキナーゼ活性を高める遺伝子改変は、上記の通り、ペントースリン酸経路の流量を増加する改変のいずれと組み合わせてもよい。しかし、これは必須ではない。
このように、本発明の宿主細胞は、特定のキシルロースキナーゼ活性を高める唯一の遺伝子改変または遺伝子改変を含んでもよい。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現を達成および分析するために当該技術で利用できる様々な手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上述した手段と同じである。好ましくは、本発明の宿主細胞で、過剰発現されるべきキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除けば遺伝学的に同一である株に比べて、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０という係数だけ過剰発現される。こうしたレベルの過剰発現は、定常状態レベルの酵素の活性、定常状態レベルの酵素の蛋白質、ならびに定常状態レベルの、その酵素をコードする転写産物に適用できると理解すべきである。
［アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子欠失］
本発明の細胞は、宿主細胞における不特定のアルドースレダクターゼ活性を低下させる１つ以上の遺伝子改変を含んでもよい。好ましくは、不特定のアルドースレダクターゼをコード化する遺伝子の発現を減少させるか遺伝子を不活性化させる１つ以上の遺伝子改変によって、宿主細胞における不特定のアルドースレダクターゼ活性を低下させる。好ましくは、遺伝子改変は、宿主細胞における不特定のアルドースレダクターゼをコード化する遺伝子の各内因性コピーの発現を減少または不活性化させる（本明細書ではＧＲＥ３欠失と呼ばれる）。宿主細胞は、２倍性、倍数性または異数性の結果として、不特定のアルドースレダクターゼをコード化する遺伝子の複数のコピーを含む可能性があり、そして／または宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、それぞれ異なる遺伝子によってコード化される、アルドースレダクターゼ活性を有する幾つかの異なる（イソ）酵素を含む可能性がある。またこのような場合には、好ましくは不特定のアルドースレダクターゼをコード化する各遺伝子の発現は減少または不活性化される。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、または遺伝子の破壊によって不活性化され、そしてこれに関連して、用語遺伝子はコード配列の上流または下流の非コード配列も含み、その（部分的）欠失または不活性化は、宿主細胞における不特定のアルドースレダクターゼ活性の発現減少をもたらす。
本発明の宿主細胞で活性を低下させるべきアルドースレダクターゼをコード化するヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列である。
したがって、宿主細胞における不特定のアルドースレダクターゼ活性を低下させる唯一の遺伝子改変または改変を含む本発明の宿主細胞は、本発明に明確に含まれる。
酵素「アルドースレダクターゼ」（ＥＣ １．１．１．２１）は本明細書では、キシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元できる任意の酵素と定義される。本発明に関連して、アルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞に本来備わっており（内因性）、そしてキシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元できる、任意の不特定のアルドースレダクターゼであってもよい。不特定のアルドースレダクターゼは反応：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋⇔アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
を触媒する。
この酵素は広い特異性を有し、またアルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋ １−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨ−アルドペントースレダクターゼ；またはＮＡＤＰＨ−アルドースレダクターゼとしても知られる。
Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内因性であり、ＧＲＥ３遺伝子によりコード化されている、このような不特定のアルドースレダクターゼの特定の例（Ｔｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。したがって、本発明のアルドースレダクターゼはそのアミノ酸配列によってさらに定義されることもある。同様に、アルドースレダクターゼは、その酵素をコード化するヌクレオチド配列によっても、アルドースレダクターゼをコード化する参考ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によっても、定義されることがある。
［バイオプロダクツ生成］
長年にわたり、農作物糖類からバイオエタノールを製造するための様々な生物の導入について提案がなされてきた。しかし、実際には、全ての主要なバイオエタノール製造プロセスは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母をエタノール生産者として使い続けてきた。これは、産業プロセスにとって、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種が多くの魅力的な特徴を有すること、すなわち高い酸耐性、エタノール耐性および浸透圧耐性、嫌気的増殖能、およびもちろんその高いアルコール発酵能に起因する。宿主細胞として好ましい酵母種としては、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エキスグース（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マーキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラジリス（Ｋ ｆｒａｇｉｌｉｓ）などがある。
本発明の細胞は、植物バイオマス、セルロース類、ヘミセルロース類、ペクチン類、ラムノース、ガラクトース、フルコース、マルトース、マルトデキストリン類、リボース、リブロース、または澱粉、澱粉誘導体、スクロース、ラクトースおよびグリセロールを、たとえば発酵性糖類に転化できる可能性がある。したがって、本発明の細胞は、セルロースをグルコースモノマーに、そしてヘミセルロースをキシロースおよびアラビノースモノマーに転化するのに必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンドキシラナーゼまたはエキソキシラナーゼあるいはアラビナーゼ）、ペクチン類をグルクロン酸およびガラクツロン酸に転化できるペクチナーゼ、あるいは澱粉をグルコースモノマーに転化するためのアミラーゼ等の、１つ以上の酵素を発現することが可能である。
この細胞はさらに好ましくは、ピルベートを所望の発酵産物に、たとえばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリン等に、転化するのに必要な酵素活性を含む。
本発明の好ましい細胞は、アルコール発酵、好ましくは、嫌気的アルコール発酵が自然にできる細胞である。本発明の細胞は好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低ｐＨに対する高い耐性（すなわち、約５、約４、約３、または約２．５未満のｐＨで増殖できる）および乳酸、酢酸またはギ酸のような有機酸および／またはフルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラール等の糖分解生成物への耐性および／または高温に対する高い耐性を有する。
本発明の細胞の上記特徴または活性のいずれも、細胞に自然に存在していてもよく、あるいは遺伝子改変により導入または改変をしてもよい。
本発明の細胞は、エタノール生成に好適な細胞であってもよい。しかし、本発明の細胞は、エタノール以外の発酵産物の生成に好適であってもよい。このような、非エタノール発酵産物は原則として、酵母または糸状菌等の真核微生物により生成され得るあらゆるバルクケミカルまたはファインケミカルを含む。
このような発酵産物は、たとえば、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンであってもよい。非エタノール発酵産物の生成に好ましい本発明の細胞は、結果としてアルコールデヒドロゲナーゼ活性低下をもたらす遺伝子改変を含む宿主細胞である。
さらなる態様で、本発明は、キシロース等のキシロース源を含む炭素源の発酵に本発明の細胞が使用される発酵プロセスに関する。キシロース源に加えて、発酵培地中の炭素源はグルコース源も含んでもよい。キシロース源またはグルコース源はキシロース自身またはグルコース自身であってもよく、キシロース単位またはグルコース単位を含む任意の炭水化物オリゴマーまたはポリマー、たとえばリグノセルロース、キシラン類、セルロース、澱粉等であってもよい。キシロース単位またはグルコース単位をこのような炭水化物から放出するのに適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ類、グルカナーゼ類、アミラーゼ類等）は、発酵培地に添加されてもよく、または細胞により生成されてもよい。後者の場合、このようなカルボヒドラーゼを生成して分泌するように、細胞を遺伝子操作することが可能である。オリゴマーまたはポリマーのグルコース源を使用する追加的利点は、たとえば律速量のカルボヒドラーゼを使用することによって、発酵期間中、低濃度の遊離グルコースの維持を可能にすることである。これは、次には、キシロース等の非グルコース糖類の代謝および輸送に必要な系の抑制を防止するであろう。
好ましいプロセスで、細胞はキシロースとグルコースの両者を、好ましくは同時に発酵し、その場合、好ましくはジオーキシー増殖を防止するためにグルコース抑制に鈍感な細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）源に加えて、発酵培地は、細胞の増殖に必要な適切な成分をさらに含むであろう。酵母等の微生物の増殖用発酵培地の組成は当該技術分野で周知である。発酵プロセスは、発酵産物、たとえばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧまたはペニシリンＶおよびその発酵誘導体等のβ−ラクタム抗生物質、およびセファロスポリン等を生成するためのプロセスである。
［バイオプロダクツ生成］
長年にわたり、農作物糖類からバイオエタノールを製造するための様々な生物の導入について提案がなされてきた。しかし、実際には、全ての主要なバイオエタノール製造プロセスは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母をエタノール生産者として使い続けてきた。これは、産業プロセスにとって、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種が多くの魅力的な特徴を有すること、たとえば高い酸耐性、エタノール耐性および浸透圧耐性、嫌気的増殖能、およびもちろんその高いアルコール発酵能に起因する。宿主細胞として好ましい酵母種としては、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エキスグース（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マーキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラジリス（Ｋ ｆｒａｇｉｌｉｓ）などがある。
混合糖細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であってもよい。しかし、混合糖細胞は、エタノール以外の発酵産物の生成に好適であってもよい。このような、非エタノール発酵産物は原則として、酵母または糸状菌等の真核微生物により生成され得るあらゆるバルクケミカルまたはファインケミカルを含む。
非エタノール発酵産物の生成に使用することが可能な混合糖細胞は、結果としてアルコールデヒドロゲナーゼ活性低下をもたらす遺伝子改変を含む宿主細胞である。
ある実施態様では、リグノセルロースを起源とする糖類がエタノールに転化されるプロセスで、混合糖細胞を使用することが可能である。
［リグノセルロース］
リグノセルロースは、潜在的再生可能原料と考えられ、一般に多糖類セルロース（グルカン類）およびヘミセルロース類（キシラン類、ヘテロキシラン類およびキシログルカン類）を含む。加えて、一部のヘミセルロースはグルコマンナン類として、たとえば木材由来の原料に存在することがある。モノマー類とマルチマー類の両者を含む可溶性糖類、たとえばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルコロン酸および他のヘキソース類およびペントース類への、こうした多糖の酵素加水分解は、協力して作用する異なる酵素の作用を受けて起こる。
加えて、ペクチン類および他のペクチン質たとえばアラビナン等は、非木材植物組織由来の一般的に細胞壁の乾燥質量のかなりの割合を構成する可能性がある（乾燥質量の約４分の１から半分はペクチン類の可能性がある）。
［前処理］
酵素処理の前に、リグノセルロース物質を前処理してもよい。前処理は、リグノセルロース物質を酸、塩基、溶剤、熱、過酸化物、オゾン、機械的破砕、研削、粉砕または急速減圧、あるいはそれらの任意の２つ以上の組合せに暴露することを含んでもよい。この化学的前処理は、たとえば１５０〜２２０℃で１〜３０分間の、熱前処理としばしば組み合わされる。
［酵素加水分解］
前処理した材料は通常、本発明にしたがって発酵され得る糖類を放出するために酵素加水分解にかけられる。これは、従来の方法で、たとえば、セルラーゼ類、たとえばセロビオヒドロラーゼ（類）、エンドグルカナーゼ（類）、β−グルコシダーゼ（類）および任意選択的に他の酵素との接触で実行することが可能である。セルラーゼ類を用いた転化は、周囲の温度またはそれより高温で、十分量の糖（類）を放出する反応時間で、実行することが可能である。酵素加水分解の結果、本明細書では糖組成物と呼ばれる、Ｃ５／Ｃ６糖類を含む加水分解生成物が生じる。
［発酵］
発酵プロセスは好気的発酵プロセスであってもよく、嫌気的発酵プロセスであってもよい。嫌気的発酵プロセスは本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵プロセス、または実質的に何も酸素が消費されない、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間が消費され（すなわち酸素消費が検出不可能である）、そしてそこでは有機分子が電子供与体と電子受容体の両役割を果たす発酵プロセスと定義される。酸素の非存在下では、解糖およびバイオマス形成で生成されるＮＡＤＨが酸化的リン酸化によって酸化されることはない。この問題を解決するために、多くの微生物はピルベートまたはその誘導体の１つを電子および水素受容体として使用し、それによってＮＡＤ＋を再生する。
このように、好ましい嫌気的発酵プロセスで、ピルベートは電子（および水素受容体）として使用され、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン等の発酵産物に還元される。
発酵プロセスは、好ましくは細胞に最適な温度で実行される。したがって、大抵の酵母または真菌宿主細胞では、発酵プロセスは約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度で実施される。酵母または糸状菌宿主細胞では、発酵プロセスは好ましくは約３５℃、約３３℃、約３０℃または約２８℃より低い温度で、かつ約２０℃、約２２℃、または約２５℃より高い温度で実施される。
このプロセスで、キシロースおよび／またはグルコースでのエタノール収率は好ましくは少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％である。エタノール収率は本明細書では、理論的最大収量のパーセンテージと定義される。
本発明はまた、発酵産物を生成するためのプロセスにも関する。
発酵プロセスは、バッチ方式、フェッドバッチ方式または連続方式で実施することが可能である。独立した加水分解と発酵（ＳＨＦ）プロセスまたは同時糖化と発酵（ＳＳＦ）プロセスも使用することが可能である。最適生産性には、こうした発酵プロセス方式の組合せもあり得るかもしれない。
本発明による発酵プロセスは、好気的条件下および嫌気的条件下で実行することが可能である。好ましくは、本プロセスは微好気性条件下、または酸素制限条件下で実施される。
嫌気的発酵プロセスは本明細書では、酸素の非存在下で実行される発酵プロセス、または実質的に酸素が何も消費されない、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間未満が消費され、そしてそこでは有機分子が電子供与体と電子受容体の両者の役割を果たす、発酵プロセスと定義される。
酸素制限発酵プロセスは、気体から液体への酸素移動によって酸素消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、入ってくるガス流の量および組成ならびに使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。好ましくは、酸素制限条件下のプロセスで、酸素消費速度は少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、たとえば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／時間等である。本発明のプロセスは、発酵産物の回収を含む。
［発酵産物］
本発明の発酵産物は任意の有用な生成物であってもよい。一実施態様で、発酵産物は、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、たとえばリシン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸等、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン類、医薬品、動物飼料サプリメント、特殊化学品、化学原料、プラスチック、溶剤、バイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーを含む燃料、および工業用酵素、たとえばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ類、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼ等からなる群から選択される生成物である。たとえば発酵産物は、本発明による細胞により、さらに先行技術細胞調製方法および発酵プロセスに従って、生成することが可能であるが、しかしその例は、本明細書で制限するものとして解釈されるべきではない。たとえば、ｎ−ブタノールは国際公開第２００８１２１７０１号パンフレットまたは国際公開第２００８０８６１２４号パンフレットに記述されている細胞によって生成することが可能であり；乳酸は、米国特許出願公開第２０１１０５３２３１号明細書または米国特許出願公開第２０１０１３７５５１号明細書に記述されている細胞によって；３−ヒドロキシ−プロピオン酸は国際公開第２０１００１０２９１号パンフレットに記述されている細胞によって；アクリル酸は国際公開第２００９１５３０４７号パンフレットに記述されている細胞によって、生成することが可能である。全種類の発酵産物の概要および酵母での調製方法は、Ｒｏｍａｎｏｓ，ＭＡ，ｅｔ ａｌ，「Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ：：ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，ｙｅａｓｔ ｖｏｌ．８：４２３−４８８（１９９２）に示されており、たとえば表７を参照されたい。グリセロール、１，３プロパンジオール、有機酸類、およびビタミンＣの生成（表２）は、Ｎｅｇｖｏｉｇｔ，Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７２（３）３７９−４１２（２００８）に記述されている。Ｇｉｄｄｉｊａｌａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（２９）（２００８）は、酵母でのβ−ラクタム類の生成について記述している。
［発酵産物の回収］
発酵産物の回収には、既存のテクノロジーが使用される。異なる発酵産物には、異なる回収プロセスが適している。エタノールを水性混合物から回収する既存の方法は通常、分画技術および吸着技術を使用する。たとえば、今でもなおビールを使用して、水性混合物中にエタノールを含む発酵産物を処理して濃縮されたエタノール−含有混合物を製造し、次いでこれを分画（たとえば、分留または他の類似技術）にかけることがある。次に、最高濃度のエタノールを含む画分を、吸着装置を通過させて、エタノールから残留水を、全部ではなくても、その大部分を除去することができる。
以下の実施例は本発明を例示するものである：
［実施例］
特に指定のない限り、本明細書に記載の方法は標準的な生化学的技術である。好適な一般的方法論教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．などがある。
［培地組成］
増殖実験：サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、以下の組成を有する培地で増殖させる：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素原基礎培地または合成培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８： ５０１−５１７，１９９２）および様々な濃度の、グルコース、アラビノース、ガラクトースまたはキシロース、あるいはこれらの基質の組合せ（具体的詳細については実施例を参照されたい；重量を体積で割った（ｗ／ｖ）％で表した濃度）。寒天プレートの場合、培地に２％（ｗ／ｖ）細菌学的寒天を加える。
［エタノール生成］
１００ｍｌ振盪フラスコ中、２％グルコースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８：５０１−５１７，１９９２）２５ｍｌに、凍結保存培養または寒天プレート由来の単一コロニーを接種することによってプレカルチャーを調製した。オービタルシェーカー（２８０ｒｐｍ）内、３０℃で約２４時間インキュベートした後、この培養を回収してＣＯ２発生の測定およびエタノール生成実験に使用した。
エタノール生成用の培養は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ，Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８：５０１−５１７，１９９２））１００ｍｌ中、３０℃で実施した。培地のｐＨは、滅菌前に２Ｍ ＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４で４．２に調整した。嫌気的培養用の合成培地には、エタノールに溶解した０．０１ｇｌ−１エルゴステロールおよび０．４２ｇｌ−１ Ｔｗｅｅｎ ８０を加えた（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６，１９５３；およびＡｎｄｒｅａｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１，１９５４）。約２という初期ＯＤ６００で培地に接種した。培地をマグネティックスターラーで撹拌した。培養に通気しなかったため、発酵中に嫌気的条件が急速に生じた。ＣＯ２生成を常時監視した。糖転化および産物形成（エタノール、グリセロール）は、ＮＭＲで分析した。増殖は、下記の、ＬＫＢ Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｋ分光光度計を用いた６００ｎｍにおける、培養の光学濃度によって監視した。
［Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換］
Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（２００２；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｔｈｅ ＬｉＡｃ／ＳＳ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ＰＥＧ ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０：８７−９６）によって記述されている通りに実施した。
［コロニーＰＣＲ］
単一コロニー分離株コロニー分離株をプラスチック製爪楊枝で採取してｍｉｌｌｉＱ水５０μｌ中に再懸濁させた。この試料を９９℃で１０分間インキュベートした。製造業者により提供される取扱説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して、インキュベートした試料５μｌをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
Figure 2013524797
［染色体ＤＮＡ分離］
酵母細胞は、ロータリーシェーカー内で、２％グルコースを含むＹＥＰ−培地中で増殖させた（３０℃および２８０ｒｐｍで一晩）。こうした培養１．５ｍｌをエッペンチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）にトランスファーして最高速度で１分間遠心分離した。上澄を傾瀉し、ペレットをＹＣＰＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中０．１％ＳＢ３−１４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌおよびＲＮａｓｅ（２０ｍｇ／ｍｌウシ膵臓由来ＲＮａｓｅ Ａ，Ｓｉｇｍａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１μｌ中に再懸濁した。この細胞懸濁液を６５℃で１０分間インキュベートした。この懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機内、７０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上澄を傾瀉した。ペレットを、ＣＬＳ（２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ ＳＤＳ）２００μｌおよびＲＮａｓｅ Ａ １μｌ中に注意深く溶解した。６５℃で１０分間インキュベートした後、この懸濁液を氷で冷却した。ＰＰＳ（１０Ｍ酢酸アンモニウム）７０μｌを加えた後、この混合液をボルテックスミキサーで完全に混合した。遠心分離（エッペンドルフ遠心分離機内、最高速度で５分）後、上澄を氷冷イソプロパノール２００μｌと混合した。ＤＮＡは容易に沈殿し、遠心分離（５分、最高速度）でペレット化させた。このペレットを氷冷７０％エタノール４００μｌで洗浄した。このペレットを室温で乾燥させ、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌに溶解した。
［実施例１］
［株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の構築］
［１．１ アラビノース経路用遺伝子を含む発現ベクターの構築］
図２に提示されている、プラスミドｐＰＷＴ０１８は、以下の通りに構築した：ベクターｐＰＷＴ００６（図１、ＳＩＴ２−遺伝子座からなる（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６，ｎｏ．６，２１８５−２１９７）および抗生物質Ｇ４１８を用いた形質転換体の選択およびアセトアミドでの増殖を可能にするマーカーを、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＭｌｕＩで消化した。Ｇ４１８に対する耐性を与える、ｋａｎＭＸ−マーカーは、ｐ４２７ＴＥＦから分離されており（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ａｍｄＳ−マーカーを含むフラグメントは文献（Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒ，Ａ．Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｅｎｎｉｅｒｓ，Ａ．Ｃ．Ｈ．Ｍ（１９９５） Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｄＳ ｃＤＮＡ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｓ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ，ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｙｅａｓｔ Ｖｏｌｕｍｅ １１，Ｉｓｓｕｅ １９９５Ａ，ｐａｇｅ Ｓ５７９；および米国特許第６０５１４３１号明細書）に記述されている。特許出願国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている、ラクトバチルス・プランタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のアラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコード化する遺伝子を、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により合成した。Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の強力なプロモーター、すなわちａｒａＡ−遺伝子の発現を制御するＴＤＨ３−プロモーター、ａｒａＢ−遺伝子を制御するＥＮＯ１−プロモーターおよびａｒａＤ−遺伝子を制御するＰＧＩ１−プロモーター、の制御下にある（または、に操作可能に連結されている）、上述した３つのアラビノース−遺伝子を内部にもつ、１つの大きいフラグメントを合成した。このフラグメントを、独特の制限酵素Ａｃｃ６５ＩおよびＭｌｕＩで包囲した。このフラグメントを、ＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩで消化したｐＰＷＴ００６にクローニングし、結果としてプラスミドｐＰＷＴ０１８（図２）を生じた。プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列を配列番号１に提示する。
［１．２ 酵母形質転換］
製造業者の取扱説明書に従って、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて事前に直線化した、プラスミドｐＰＷＴ０１８で、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ ＵＲＡ３ ＨＩＳ３ ＬＥＵ２ ＴＲＰ１ ＭＡＬ２−８ＳＵＣ２）を形質転換した。合成ＳｆｉＩ部位を、ＳＩＴ２−遺伝子の５’−隣接領域内に設計した（図２参照）。形質転換混合物を、１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＹＰＤ−寒天（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ、１リットル当たり２０ｇのペプトン、１リットル当たり２０ｇのデキストロース、寒天２０ｇ）上にプレーティングした。２〜４日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験でＤＮＡ無添加）は空のＹＰＤ／Ｇ４１８−プレートに終わった。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組み込みは、ＳＩＴ２−遺伝子座に向けられる。形質転換体は、ＰＣＲ技術およびサザンブロット技術を使用して特性化した。
プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーの正しい組み込みを示す、ＰＣＲ反応を、配列番号２および配列番号３、ならびに配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いて実施した。配列番号２と配列番号３のプライマー対を用いて、ＳＩＴ２−遺伝子座における正しい組み込みをチェックした。プラスミドｐＰＷＴ０１８が複数のコピーで組み込まれる場合（頭−尾組み込み）、配列番号３と配列番号４のプライマー対はＰＣＲ産物を与える。後者のＰＣＲ産物がない場合、これはｐＰＷＴ０１８の１コピー組み込みを示す。プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーがＳＩＴ２−遺伝子座に組み込まれた株は、ＢＩＥ１０４Ｒ２と呼ばれる。
［１．３ マーカーレスキュー］
同じ選択マーカー類を使用した他の構築物で酵母株を形質転換できるためには、選択可能マーカーを除去することが必要である。プラスミドｐＰＷＴ０１８の設計は、ｐＰＷＴ０１８を染色体に組み込むとき、相同配列が互いにごく近接しているというものであった。この設計は、こうした相同領域の自然発生的分子内組み換えによって、選択可能マーカーが失われることを可能にする。
栄養増殖の際に、低頻度ではあるが、分子内組み換えが起こる。この組み換え頻度は、相同性の長さおよびゲノムにおける遺伝子座に左右される（未発表の結果）。培養の副画分を用時調製培地に連続トランスファーするとき、やがては分子内組み換えが蓄積する。
この目的を達成するために、株ＢＩＥ１０４Ｒ２を、単一コロニー分離株から開始して、ＹＰＤ−培地（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ、１リットル当たり２０ｇのペプトン、１リットル当たり２０ｇのデキストロース）中で培養した。一晩培養２５μｌを使用して、用時調製ＹＰＤ培地に接種した。少なくとも５回のこのような連続トランスファーの後、培養の光学濃度を測定して細胞を１ｍｌ当たり約５０００の濃度に希釈した。この細胞懸濁液１００μｌを、３０ｍＭＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１．８％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含む酵母炭素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）上にプレーティングした。株ＢＩＥ１０４Ｒ２の細胞と同一の細胞、すなわち細胞内組み換えがない細胞は、まだａｍｄＳ−遺伝子を含む。こうした細胞に対して、フルオロ−アセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロ−アセトアミドを含む培地で増殖できず、コロニーを形成しないであろう。しかし、分子内組み換えが起こっている場合、選択可能マーカーを喪失したＢＩＥ１０４Ｒ２−変異形は、フルオロ−アセトアミドを増殖阻害化合物に転化できないため、フルオロ−アセトアミド培地で増殖することができるであろう。こうした細胞は、この寒天培地上でコロニーを形成するであろう。
このようにして得られたフルオロ−アセトアミド耐性コロニーを、配列番号２および配列番号３、ならびに配列番号４および配列番号５のプライマーを使用するＰＣＲ分析にかけた。意図した通りに選択可能マーカーの組み換えが起こっていれば、配列番号２および配列番号３のプライマーはバンドを与えるであろう。結果として、強力な酵母プロモーターの制御下にある遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを含むカセットが、宿主株のゲノムのＳＩＴ２−遺伝子座に組み込まれていた。その場合、プライマー４は、組み換えのために喪失したはずの領域でプライミングするため、配列番号４および配列番号５のプライマーを使用するＰＣＲ反応は、ＰＣＲ産物をもたらさないはずである。後者のプライマーでバンドが得られるのであれば、これは完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８がゲノム中に存在すること、したがって組み換えが何も起こらなかったことを示す。
配列番号２および配列番号３のプライマーがＰＣＲ産物をもたらさなければ、ゲノムの外で完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８が組み換わったという方法で、組み換えが起こっていた。選択可能マーカーのみならず、アラビノース−遺伝子も喪失した。事実、野生型酵母が回収されている。
ｐＰＷＴ０１８の１コピー組み込みと一致したＰＣＲを示した分離株をサザンブロット分析にかけた。株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの染色体ＤＮＡおよび正しい組み換え体をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した（二重消化）。ｐＰＷ０１８を鋳型として使用して、配列番号６および配列番号７のプライマーでＳＩＴ２−プローブを調製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図３に示す。
野生型株で、野生型遺伝子の予想サイズと一致する、２．３５ｋｂのバンドが観測される。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組み換えによる組み込みおよび部分的喪失に際して、１．０６ｋｂのバンドが予想された。事実、図３（レーン２）に示す通り、このバンドが観測される。
サザンブロットで正しいバンドパターンを示した（図３から推定できる通り）株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２と呼ばれる株である。
［１．４ 非酸化的ペントースリン酸経路の、構成的に発現される４遺伝子の導入］
遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを構成的に発現する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セルビシエ）ＢＩＥ１０４Ａ２を、プラスミドｐＰＷＴ０８０（図４）で形質転換した。プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列は配列番号８で提示される。１コピー組み込み形質転換体を選択した後の、形質転換および選択の手順は、セクション１．１、１．２および１．３で上述したものと同じである。要するに、ＢＩＥ１０４Ａ２をＳｆｉＩ消化したｐＰＷＴ０８０で形質転換した。形質転換混合物を、１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＹＰＤ−寒天（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ、１リットル当たり２０ｇのペプトン、１リットル当たり２０ｇのデキストロース、寒天２０ｇ）上にプレーティングした。
２〜４日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験でＤＮＡ無添加）は空のＹＰＤ／Ｇ４１８−プレートに終わった。
プラスミドｐＰＷＴ０８０の組み込みはＧＲＥ３−遺伝子座に向けられる。形質転換体は、ＰＣＲ技術およびサザンブロット技術を使用して特性化した。ＧＲＥ３−遺伝子座におけるプラスミドｐＰＷＴ０８０の正しい組み込みは、配列番号９および配列番号１０のプライマー対を使用するＰＣＲでチェックし、配列番号９および配列番号１１のプライマー対を使用してプラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピー組み込みまたは多コピー組み込みを検出した。サザン分析用に、配列番号１２および配列番号１３を使用し、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＲＫＩ１−遺伝子の一部を増幅するＰＣＲによってプローブを調製した。本来備わっているＲＫＩ１−遺伝子の隣に、プラスミドｐＰＷＴ０８０の組み込みに起因する追加のシグナルが得られた（不掲載データ）。
予想されるハイブリダイゼーションパターンと一致する、プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組み込みを示す形質転換体を、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１と呼んだ。
ラスミドｐＰＷＴ０８０の組み込みによって導入された選択マーカーを除去するために、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１を、１つのコロニー分離株から開始して、ＹＰＤ−培地中で培養した。一晩培養２５μｌを使用して、用時調製ＹＰＤ培地に接種した。５回の連続トランスファーの後、培養の光学濃度を測定して、細胞を１ｍｌ当たり約５０００の濃度に希釈した。この細胞懸濁液１００μｌを、３０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１．８％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含むＹｅａｓｔ Ｃａｒｂｏｎ Ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｄｉｆｃｏ）上にプレーティングした。フルオロ−アセトアミド耐性コロニーを、配列番号９および配列番号１０のプライマーを使用するＰＣＲ分析にかけた。正しいＰＣＲプロフィールの場合には、正しい組み込みを検証するために、ＲＫＩ１−遺伝子のプローブを再度使用して、サザンブロット分析を実施した。サザンブロットで正しいバンドパターンを示した株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１と呼ばれる株である。
［実施例２］
［ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１につながる振盪フラスコ内での適応進化］
［２．１ 適応進化（好気的）］
株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の単一コロニー分離株を使用して、２％ガラクトースを加えたＹＮＢ−培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した。この前培養を、３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を回収し、１％ガラクトースおよび１％アラビノースを含むＹＮＢ培地に、０．２という開始ＯＤ６００で接種した（図５）。細胞を、３０℃および２８０ｒｐｍで増殖させた。６００ｎｍにおける光学濃度を定期的に監視した。
光学濃度が５という値に達したとき、培養のアリコートを、同じ培地を含む用時調製ＹＮＢ培地にトランスファーした。細胞添加量は、培養の開始ＯＤ６００が０．２というものであった。ＯＤ６００が再度５に達した後、培養のアリコートを、唯一の炭素源として２％アラビノースを含むＹＮＢ培地にトランスファーした（図５の（１）で表示の事象）。
唯一の炭素源として２％アラビノースを含むＹＮＢへにトランスファーしたとき、約２週間後に増殖を見ることができた。６００ｎｍにおける光学濃度が少なくとも１という値に達したとき、２％アラビノースを加えた用時調製ＹＮＢ−培地が入っている振盪フラスコに、０．２という開始ＯＤ６００で、細胞をトランスファーした（図５、２８日）。
図５に提示されている通り、連続トランスファーを３回繰り返した。結果として得られた、アラビノースで急速に増殖できた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃと呼んだ。
［２．２ 適応進化（嫌気的）］
適応後、好気的条件下、アラビノースで増殖したとき、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ由来の単一コロニーを、２％グルコースを加えたＹＮＢ培地に接種した。この前培養を、３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を回収し、２％アラビノースを含むＹＮＢ培地に、０．２という初期光学濃度ＯＤ６００で接種した。フラスコをウォーターロックで閉じ、培地およびヘッドスペースから酸素を排出した後、嫌気的増殖条件を確実にした。最低限３というＯＤ６００に達した後、培養のアリコートを、２％アラビノースを含む用時調製ＹＮＢ培地に、毎回０．２という初期ＯＤ６００値で、トランスファーした（図６）。数回のトランスファー後、結果として得られた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｄ（＝ＢＩＥ２０１）と呼んだ。
［実施例３］
［適応進化がアラビノース転化をもたらした（改良した）ことを示すＢＡＭでの株の性能試験。ガラクトースとの共発酵。］
株ＢＩＥ１０４、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１の単一コロニー分離株を使用して、２％グルコースを加えたＹＮＢ−培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した。この前培養を、３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。ＢＡＭで、細胞を回収し、約２という初期ＯＤ６００で、合成モデル培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８：５０１−５１７，１９９２；５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトース）に接種した。ＣＯ２生成を常時監視した。糖転化および産物形成をＮＭＲで分析した。データは、指示された糖類の残量（１リットル当たりのグラム数で表した、グルコース、アラビノース、ガラクトースおよびキシロース）および（副）産物（エタノール、グリセロール）の形成を表す。増殖は、６００ｎｍにおける、以下の培養の光学濃度によって監視した（図７、図８および図９）。実験は、約１４０時間実行していた。
参考株ＢＩＥ１０４はグルコースを急速に転化したが、アラビノース、キシロースおよび／またはガラクトースを１４０時間以内に転化できなかったことを、実験は明らかに表す（図７）。しかし、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１は、アラビノースおよびガラクトースを転化できた（それぞれ、図８および９）。ガラクトース利用およびアラビノース利用は、２０時間未満後、グルコース枯渇直後に開始した。両糖は同時に転化された。しかし、嫌気条件下でのアラビノース増殖のために改良された株ＢＩＥ２０１は、両糖類をさらに急速に消費した（図９）。全ての発酵で、副産物としてグリセロールのみが生成された。
［実施例４］
［株のリシーケンシングおよびアラビノース発酵に関与するＳＮＰｓの同定］
実施例１、実施例２および実施例３から結論づけられる通り、アラビノースの利用に必要な、または利用を増進する、酵素をコード化する遺伝子を単に導入しただけでは、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖できるようにするのに十分ではない。実施例２に示す通り、唯一のＣ源としてアラビノースを利用する細胞を選択するためには、適応進化と呼ばれるプロセスが必要である。
多分、ゲノムにおける自然突然変異（一塩基変異多型では、ＳＮＰｓ）がこの表現型の変化の原因である。あるいは、ゲノムにおけるより大きい変異（ヌクレオチド１つの置換、挿入または欠失に限定されない）が起こったかもしれない。
どの突然変異またはＳＮＰｓがこの表現型の変化の原因であるかを学習するために、Ｓｏｌｅｘａ（登録商標）テクノロジーとして知られる技術を使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、その形質転換体のゲノムＤＮＡをリシーケンシングした。
この目的を達成するために、株ＢＩＥ１０４、一次形質転換体ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１、進化した形質転換体ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびさらに進化した形質転換体ＢＩＥ２０１由来の染色体ＤＮＡを、ＹＥＰ２％グルコース一晩培養から分離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用するリシーケンシング（５０ｂｐリード、ペアエンドシーケンシング）のために、ＤＮＡをＳｅｒｖｉｃｅＸＳ（Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に送った。
１株当たり、１４０という平均ゲノムカバレージに相当する、約１８００Ｍｂの配列が得られ、これは平均すると、どの塩基も１４０回読まれたことを意味する。
ＮｅｘｔＧｅｎｅソフトウェア（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ ＬＬＣ，Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ １６８０３，ＵＳＡ）を使用し、Ｓ２８８ｃを鋳型として使用してシーケンシングリードを整列させた。ＮｅｘｔＧｅｎｅソフトウェアを使用して突然変異（一塩基変異多型および３０ｂｐまでの挿入／欠失）が検出され、変異レポートに要約した。株間の独特の変異を同定するために、異なる株のアラインメントを互いに比較した。シーケンシングカバレージが低すぎて裏付けることができない区域における、リードのミスアラインメント、シーケンスエラーまたは突然変異コールの可能性を排除するために、変異レポートのあらゆる記載事項を手作業でチェックした。偽陽性突然変異を変異レポートから除去した。
一次形質転換体（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１）の配列は、導入された配列およびプラスミドの組み込みおよびそれに続く組み換えによるマーカーの配列除去によって削除された配列を除き、野生型株ＢＩＥ１０４の配列と同一であった。
進化した形質転換体、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃでは、限られた数のＳＮＰｓが導入された。
Figure 2013524797
さらなる進化した形質転換体、株ＢＩＥ２０１では、上述した４つのＳＮＰｓの隣に、１つの追加的ＳＮＰが確認された：
Figure 2013524797
野生型株ＢＩＥ１０４ならびに進化した株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１の両者における、ＳＮＰｓを含む遺伝子の５つのオープンリーディングフレームの配列を、配列番号１４、配列番号１５（ＳＳＹ１）、配列番号１６、配列番号１７（ＹＪＲ１５４ｗ）、配列番号１８、配列番号１９（ＣＥＰ３）、配列番号２０、配列番号２１（ＹＰＬ２７７ｃ）、配列番号２２および配列番号２３（ＧＡＬ８０）で表す。
［実施例５］
［ＳＮＰｓの確認］
上述の実施例で検出されたＳＮＰｓを（再）確認するために、２つの方法を使用した。第１の方法は、ＳＮＰｓを含む領域の増幅に続いてＡＢＩ３７３０ＸＬシーケンサーを用いたシングルリード（Ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄ）（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ ＢＶ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに外注）を含んでいた。第２の方法は、高解像度融解曲線分析（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｈｉ−Ｒｅｓ）で構成されていた。
［５．１ シングルリードサンガーシーケンシング（Ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄ Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）］
株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１およびＢＩＥ２０１の培養から分離されたゲノムＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用するＰＣＲ反応用の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、製造業者によって作成された注意事項に従って実施した。以下のプライマーを使用して、ＳＮＰを有すると予期された、以下の遺伝子を増幅した。
Figure 2013524797
ＰＣＲ産物をｐＴＯＰＯＢｌｕｎｔＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にクローニングした。制限酵素分析に基づいて、正しいクローンを選択した。一本鎖サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングのために、正しいクローンをＢａｓｅＣｌｅａｒ ＢＶ（Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に送った。
ＣＥＰ３フラグメントのＴＯＰＯクローニングは成功しなかった。この遺伝子について、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングデータは何も得られなかった。
ＹＰＬ２７７ｃの配列は、野生型株ＢＩＥ１０４の配列と同一のようであった。
Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの結果から、遺伝子ＳＳＹ１、ＹＪＲ１５４ｗおよびＧＡＬ８０におけるＳＮＰｓが確認された、すなわち、ＳＮＰｓは実施例４に記載のものと同じであった。
［５．２ Ｈｉ−Ｒｅｓ分析］
Ｈｉ−Ｒｅｓテクノロジーは、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ ８４１０８，ＵＳＡ）によって商業化された。要するに、ＰＣＲ産物の突然変異は、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）色素によって最適に検出されるヘテロ二本鎖の存在によって検出される。変異は、参考試料と比較した融解プロフィールの形状の変化によって同定される。多数の調査研究および臨床応用で、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）を用いるＨｉ−Ｒｅｓ Ｍｅｌｔｉｎｇ（登録商標）（ＨＲＭ）が突然変異発見に使用されている。
ＳＮＰまたは野生型配列を含むおよそ１００〜２００ｂｐの領域を増幅するために、各ＳＮＰについて、２つのプライマーが設計された。加えて、溶融プロフィールを検出する実験でプローブの役割を果たす第３のプライマーが設計された。後者のプライマーは、ＳＮＰ領域をカバーし、そして野生型配列に正確に相補的であるように、設計された。ＳＮＰ配列とのマッチングは不完全である、すなわち、プローブのヌクレオチドの中の１つを除く全てが対象の領域に相補的である。ミスマッチＤＮＡ鎖はマッチＤＮＡ鎖より早く融解し、野生型およびＳＮＰアンプリコンの異なる融解曲線を生じる結果となり、これはＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標） （Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）を使用して検出される。
下表に、対象の遺伝子またはＯＲＦの増幅に使用されたプライマー配列をまとめてあり、そのＳＮＰは鎖ＢＩＥ２０１で検証されるはずである。
Figure 2013524797
下表に、株ＢＩＥ２０１におけるＳＮＰｓの検証に使用されてきた配列番号（プローブ）をまとめる。
Figure 2013524797
ＰＣＲ反応は、プローブがないこと以外はＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供された取扱説明書に従い、配列番号２４および配列番号２５（ＳＳＹ１）、配列番号２６および配列番号２７（ＹＪＲ１５４ｗ）、配列番号２８および配列番号２９（ＣＥＰ３）、配列番号３０および配列番号３１（ＹＰＬ２７７ｃ）ならびに配列番号３２および配列番号３３（ＧＡＬ８０）のプライマー対を使用し、株ＢＩＥ１０４（野生型酵母株）および株ＢＩＥ２０１（アラビノースで嫌気的に増殖できる酵母株）の染色体ＤＮＡを使用して、実施した。増幅されたフラグメントは、収率および完全性について、２％アガロースゲルでチェックした。
ＨｉＲｅｓ分析は、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供されたプロトコールと類似した、下記の通りに実施した：プローブ（５μＭ）２μｌを、ＰＣＲマイクロプレート（４ｔｉｔｕｄｅ Ｆｒａｍｅｓｔａｒｔ ９６、黒枠、白壁（Ｂｉｏｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））中のＰＣＲ産物１０μｌに加えた。混合後、マイクロプレートを遠心沈殿させた。このプレートを９９℃で３０秒間インキュベートし、室温（約２０℃）まで冷却した。その後、開始温度５５℃、終了温度９４℃および露出設定「自動」でＬｉｇｈｔｓｃａｎｎｅｒを用いて溶融プロトコールに従った。測定の完了後、データ解析を実施した。蛍光変化を分析する境界温度を、ＰＣＲ産物からプローブが溶融すると予想された温度間隔に、手動で設定した。
融解曲線の一例を図１１に表す。図１１は、「正規化融解曲線」（融解曲線；最上パネル）および「正規化溶融ピーク」曲線（下方のパネル）の両者の一例を表示する。後者は第１のグラフから導かれ、蛍光シグナルの変換を温度の関数として表している。株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１およびＢＩＥ２０１を表示する。この図で試験された遺伝子はＹＪＲ１５４ｗである。試験した２株、ＢＩＥ２０１とＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１との間で、プローブの融解温度の差は明らかである。
ＹＰＬ２７７ｃにおける１つを除き、全ての予期されるＳＮＰｓが確認された。ＢＩＥ２０１におけるこのＯＲＦ（ＹＰＬ２７７ｃ）配列は、野生型株ＢＩＥ１０４の配列と同一のようであった。
要約すると、実施例５で、ＯＲＦ ＳＳＹ１（ＹＤＲ１６０ｗ）、ＹＪＲ１５４ｗ、ＣＥＰ３（ＹＭＲ１６８ｃ）およびＧＡＬ８０（ＹＭＬ０５１ｗ）におけるＳＮＰｓが確認された。ＹＰＬ２７７ｃのＯＲＦで既に同定されたＳＮＰ（実施例４）は、２つの独立した方法を使用して反証された。
［実施例６］
［染色体ＶＩＩの部分増幅］
［６．１ 染色体ＶＩＩの部分増幅］
実施例４に記述の通り、野生型株ＢＩＥ１０４、一次形質転換体ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１、進化した形質転換体ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびさらなる進化した株ＢＩＥ２０１のリシーケンシングにより、幾つかの興味深いＳＮＰを得た。
ゲノムのあらゆる一ヌクレオチドのリードデプスを示す、カバレージプロットを使用して、過剰提示または過小提示されたゲノム中の領域を探査してきた。実際に、過剰提示された染色体ＶＩＩ上の領域を同定した（図１２参照）。
リードデプスから、セントロメアを囲む、染色体ＶＩＩの一部が増幅されたと結論付けられた。染色体ＶＩＩの左腕上の領域は３倍増幅された。染色体ＶＩＩの右腕上の一部は２倍増幅され、隣接する部分は３倍増幅された（図１２参照）。
３倍増幅された染色体ＶＩＩの右腕上の部分は、アラビノース発現カセット、すなわち強力な構成的プロモーター類の制御下にある遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを含む。
第一に、幾つかの遺伝子のコピー数をＱ−ＰＣＲで確認した。第二に、同一染色体上で増幅が起きたかどうか（２倍化ｃｑ．３倍化）または増幅領域が別の染色体に組み込まれたかどうか（転座）を調査した。
［６．２ Ｑ−ＰＣＲによるコピー数決定］
図１２のカバレージプロットにより示される、染色体ＶＩＩの一部の増幅を検証するために、Ｑ−ＰＣＲ実験を実施した。具体的には、この方法は、対象の遺伝子を、既知のコピー数を有する別の遺伝子と比較することによって、対象の遺伝子の相対的コピー数を測定する。
この目的を達成するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＢｉｏ−Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱシステムを使用した。ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。提供元の説明書で提案された通りに、実験を組み立てた。
カバレージプロット（リードデプス）から、遺伝子ＳＤＳ２３および遺伝子ＹＧＬ０５７ｃは染色体ＶＩＩの左腕上の増幅領域部分であると予想されることが推定された。参考一コピー遺伝子として、ＡＣＴ１遺伝子を選択した。
遺伝子ＹＧＬ０５７ｃ、遺伝子ＳＤＳ２３および遺伝子ＡＣＴ１を検出するためのプライマーを下表にまとめる。
Figure 2013524797
Ｑ−ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
１）９５℃で３分間

４０サイクルの場合、工程２〜４
２）９５℃で１０秒間
３）５８℃で４５秒間
４）７２℃で４５秒間
５）６５℃で１０秒間
６）１０秒当たり０．５℃で９５℃までの温度上昇
融解曲線は、６５℃で１０秒間、蛍光を測定し始めることにより決定されている。温度は、９５℃という温度に達するまで、１０秒毎に０．５℃上昇させる。リードから、対象の遺伝子のコピー数が算出および／または推定された。結果を下表に示す。
Figure 2013524797
実施例６（セクション６．１）でのリードデプス分析から明らかなように、結果は増幅を裏付ける。観測値は、予想されるコピー数３．０より高い。その差は、Ｋｌｅｉｎによって既述されている通り（Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．（２００２）ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．８ Ｎｏ．６，２５７−２６０）、多くの要因に起因する可能性がある。
［６．３ 二倍化の性質の分析］
増殖された領域が、その遺伝子がもともと位置している染色体と同じ染色体上、すなわち染色体ＶＩＩ上に位置しているか、または別の染色体に転座されていたかを決定するために、ＣＨＥＦ電気泳動法（クランプ均一電場電気泳動法（Ｃｌａｍｐｅｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；ＣＨＥＦ−ＤＲ（登録商標） ＩＩＩ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ａｎｇｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ ９４５４７，ＵＳＡ）を適用した。酵母株のアガロースプラグ（以下参照）は、製造業者の取扱説明書に従って、ＣＨＥＦ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｌｕｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して調製した。１％アガロースゲル（Ｐｕｌｓｅ Ｆｉｅｌｄ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）は、製造業者の取扱説明書に従って、０．５ｘ ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）で調製した。ゲルは、以下の設定に従って泳動させた：
Figure 2013524797
染色体のサイズ決定用マーカーとして、株ＹＮＮ２９５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のアガロースプラグを実験に含めた。
電気泳動法後、１リットル当たり７０μｇという最終濃度で臭化エチジウムを使用して、３０分間、ゲルを染色した。図１３に、染色されたゲルの一例を表す。
染色後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上にゲルをブロットした。
増幅された遺伝子が１つの染色体上に位置するかまたは他の染色体に転座しているかどうかを立証できるために、ブロットされた膜とのハイブリダイゼーション用にプローブを作成した。プローブ（下表参照）は、製造業者の取扱説明書に従って、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ａｌｍｅｒｅ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して調製した。
以下のプローブを調製した。
Figure 2013524797
ａｒａＡ−遺伝子は、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１で３倍増幅されると予想される。
ＡＣＴ１−遺伝子は染色体ＶＩ上に位置し、増殖されないと予想される。それ故、このプローブは対照の役割をする。
ＰＮＣ１は染色体ＶＩＩの左腕上に位置し、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１で３倍増幅されると予想される。
ＨＳＦ１は染色体ＶＩＩの左腕上に位置し、そして増殖される領域の上流に位置する。それ故、この遺伝子は、試験した株では、単一遺伝子としてゲノム中に存在すると予想される。
ＹＧＲ０３１ｗは染色体ＶＩＩの右腕上に位置する。この遺伝子は、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１のゲノム中に２コピーで存在すると予想される。
膜は、製造業者の取扱説明書に従って、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）中でプレハイブリダイズさせた。プローブは、９９℃で５分間変性させ、氷で５分間冷やし、プレハイブリダイズした膜に添加した。ハイブリダイゼーションは、４２℃で一晩行った。
ハイブリダイズしたプローブ検出を実施する前の、膜の洗浄および膜のブロッキングは、製造業者の取扱説明書に従って、ＤＩＧ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。検出は、抗−ジオキシゲニン−ＡＰ Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ）とインキュベーションし、続いてＣＤＰ−Ｓｔａｒ使用準備済（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出試薬を添加することにより行った。化学発光シグナルの検出は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍを使用し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ａｐｐａｒａｔｕｓにより提供された適切な設定を使用して実施した。
結果を、図１３、図１４、図１５、図１６、図１７および図１８に示す。
ＢＩＥ１０４からＢＩＥ２０１までの株系統で、染色体のサイズに差があることは、図１３から、既に推測できる。ＢＩＥ１０４と比較するとき、一次形質転換体、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１（ａ）では、染色体のサイズに関して大きな差はみられない。しかし株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよび株ＢＩＥ２０１では、染色体ＶＩＩのサイズは増加していた。株ＢＩＥ１０４では、染色体ＶＩＩは染色体ＸＶに近い；しかしＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１では、染色体はサイズが増加しており、染色体ＩＶとほぼ同じ大きさである。
遺伝子ａｒａＡのプローブ（図１４）、遺伝子ＰＮＣ１のプローブ（図１６）および遺伝子ＨＳＦ１のプローブ（図１７）とのハイブリダイゼーションは、同じイメージを与える。このことから、増幅が同一染色体内で起こったこと、すなわち、全ての増幅領域がそれまでどおり染色体ＶＩＩ上にあることが、示唆される。転座が起こっていたのであれば、多重信号が予想され、この場合は当てはまらない。株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１（ａ）では、全３プローブで、染色体ＶＩＩのバンドの下に、より小さいバンドが観測された。このことから、第２の、より小さいバージョン染色体ＶＩＩが存在することが示唆される。より大きいバンドより強度が低いため、細胞の一画分のみに存在する可能性がある。それは、電気泳動人工産物を想定することによっても説明することが可能である。
ＡＣＴ１プローブとのハイブリダイゼーション（図１５）は、予想通り、全株で単一バンドを生じる結果となり、染色体ＶＩを示している。
ＹＧＲ０３１ｗプローブとのハイブリダイゼーション（図１８）は最終的に、多くのバンドを生じる結果となった。明らかに、クロスハイブリダイゼーションが起こり、各株で多重信号が生じる結果となった。したがって、この結果は、この実験目的で使用することはできない。
株間で若干の強度差が観測されたが、増幅が表されるかどうかをこれらのデータから結論づけることは難しい。信号強度の増加から、ある遺伝子のコピー数増加が示唆されるかもしれないが、ゲルに適用したＤＮＡ量、ブロッティング効率、検出飽和等のような、他の要因も信号強度に影響する可能性がある。
総合すれば、実施例６の結果は、増幅が染色体ＶＩＩ内で起こっていたことを明らかに示す。遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤ（周囲の配列を含む）が別の染色体に転座した遺伝学的状況を示す証拠は皆無である。
［実施例７］
［ＳＮＰｓおよび増幅の表現型的立証］
発見されたＳＮＰｓおよび増幅、ならびにそうである場合その程度が、（導入された同種経路および異種経路は別として）酵母細胞によりアラビノースをエタノールに転化する能力の一因となるかどうかを立証するために、交雑育種実験を実施した。この目的を達成するために、以下の実験を実施した：株ＢＩＥ２０１の交配型スイッチ、交配型スイッチＢＩＥ２０１と非進化親株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１との交雑育種、２倍体株の胞子形成に続く４子嚢胞子の解剖、１倍体子孫での、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアラビノースを利用する能力の決定、Ｈｉ−Ｒｅｓを使用した１倍体子孫におけるＳＮＰ検出、およびこれらのデータセットの解析。
進化した、交配型スイッチＢＩＥ２０１を非進化一次形質転換体ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１と交雑することによって、同定される遺伝子の変化（ＳＮＰｓおよび増幅）を除けば、完全にホモ接合である２倍体細胞が構築される。その後、この２倍体細胞の胞子形成に続いて子嚢胞子を解剖することにより、適応進化中に導入されたゲノムの変化を何も持たない、あるいは若干または全て有する１倍体細胞が得られるであろう。４つの１倍体誘導体全体で、ＳＮＰ、ＤＩＰまたは増幅１つ当たり、２：２分離が予想されるが、１つの２倍体細胞の４つの１倍体誘導体全体のゲノム変化の分布はランダムである。それ以上の理論的背景については、たとえばＭｏｒｔｉｍｅｒ Ｒ．Ｋ． ａｎｄ Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ Ｄ．Ｃ．（１９７５） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：２２１−３３を参照されたい。
［７．１ 株ＢＩＥ２０１の交配型］
プラスミドｐＧａｌ−ＨＯ（ＫＡＮ）は、プラスミドｐＧＡＬ−ＨＯの誘導体である（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｅ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１３２−１４６）。ｐＧＡＬ−ＨＯにおけるＵＲＡ３−マーカーは、ｐＧＡＬ−ＨＯをＥｃｏＲＶで切断し、続いてｐＵＧ６由来のｋａｎＭＸフラグメントに連結することにより、ｋａｎＭＸマーカーに置換されている（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２５１９−２５２４）。Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でＧ４１８選択を可能にする、ｋａｎＭＸマーカーを、制限酵素ＸｂａＩおよび制限酵素ＸｈｏＩでｐＵＧ６から切断し、続いて突出末端にＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを満たした。結果として生じるプラスミドはｐＧａｌ−ＨＯ（ＫＡＮ）である。
プラスミドｐＧａｌ−ＨＯ（ＫＡＮ）を用いるＧｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（２００２）の方法に従って、株ＢＩＥ２０１（この実験に関して関連遺伝子型：ｍａｔＡ）を形質転換した。形質転換体は、グルコース（２％）およびＧ４１８（１００μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ／寒天プレート上で選択した。コロニーは、３０℃で２日間インキュベートした後出現した。コロニー８個を、グルコースおよびＧ４１８を含む用時調製ＹＥＰ／寒天プレート上に再画線した。各形質転換のコロニー２個を使用して、１％ガラクトースおよび０．１％グルコースを含むＹＥＰ−培地２０ｍｌに接種した。３０℃および２８０ｒｐｍで２日間インキュベートした後、細胞をＹＥＰＤプレート上に再画線した。プレートを、３０℃で２日間ずっとインキュベートするとコロニーが目に見えた。交配型を決定するために、配列番号５５および配列番号５６のプライマー（ｍａｔＡ細胞の同定の場合）、および配列番号５５および配列番号５７のプライマー（ｍａｔα（アルファ）細胞の同定の場合）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。
ＢＩＥ２０１のｍａｔα（アルファ）変異形数個が得られた。こうした誘導体がその交配型を本当にスイッチしたかどうかを試験するために、それらを用時調製ＹＥＰＤプレート上に再画線した。また、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１（一次形質転換体、この実験における関連遺伝子型：ｍａｔＡ）を、別個の用時調製ＹＥＰＤプレート上に再画線した。
その後、白金耳量の各株を用時調製ＹＥＰＤ−寒天プレート上で混合することにより、両株を交配させた。３０℃で６時間インキュベートした後、顕微鏡下で交配を点数化した。若干の分離株が接合体、すなわち反対の交配型の２細胞が融合して２倍体株を形成した構造を、本当に形成しているようであった。こうしたＢＩＥ２０１誘導体は本当に、交配型をｍａｔα（アルファ）に変えた。
［７．２ 交配型スイッチＢＩＥ２０１と非進化親株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１との交雑育種］
ハイブリッド（接合体）の形成が顕微鏡で確認された調製物（セクション７．１）を、ＹＥＰＤ−寒天プレート上にプレーティングした。プレートを、３０℃で２日間インキュベートした。より大きいコロニーを摘み取り、用時調製ＹＥＰＤプレート上に再画線した。その後、配列番号５５および配列番号５６ならびに配列番号５５および配列番号５７のプライマーを使用して、コロニーＰＣＲを実施した。２倍体は、両プライマー対を有するＰＣＲ産物を形成するであろう。こうしたコロニーの幾つかを獲得し、２％グルコースを含むＹＥＰ−培地への接種に使用した（３０℃、２８０ｒｐｍ）。
［７．３ ２倍体株の胞子形成および子嚢胞子の解剖］
３０℃および２８０ｒｐｍで一晩増殖させた後、２．５ｍｌを、（滅菌）水道水中１．５％のＫＡｃ ２５ｍｌにトランスファーした。インキュベーションは、３０℃および２８０ｒｐｍで続けた。毎日、胞子形成度を顕微鏡でチェックした。子嚢と栄養細胞の比率が２より大きいとき、Ｓｉｎｇｅｒ ＭＳＭ Ｓｙｓｔｅｍ（著作権）シリーズ３００（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＵＫ）装置を使用し、製造業者の取扱説明書およびプロトコールを使用して、子嚢６０個を解剖した。解剖は、ＹＥＰＤプレート上で行った。プレートを、３０℃で２日間インキュベートした。結果の一例を図１９に提示する。
図１９は、解剖された１０個の子嚢を表す。子嚢由来の子嚢胞子を互いに分離し、区別できる距離で、寒天プレート上に置いた。一「列」のコロニー（１０列を表示）は１個の子嚢に由来する。
図１９から明らかなように、あらゆる場合に全４個の胞子が生育可能とは限らない。少数の事例では、３個だけ、時には２個だけの子嚢胞子が生育可能コロニーに成長する。
また、１個の子嚢胞子に由来するコロニー間でコロニーサイズに若干の差が認められた。
［７．４ １倍体子孫における、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアラビノースを利用する能力の決定］
１個の子嚢から４個の生育可能な胞子が得られた場合である、１倍体誘導体の完全なセット全部を、９６ウェルマイクロプレート内のＹＥＰＤ−寒天に接種した。対照ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１および対照ＢＩＥ２０１を、少なくとも二重に、対照として各マイクロプレート上に含めた。プレートを、３０℃で２日間インキュベートした。こうしたプレートは「マスタープレート」と呼ばれる。
１回の移動で、マイクロプレート内の全９６株の細胞物質をトランスファーできる、使い捨てピンツールを使用して、２００μｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地および２％グルコースが入っている９６ウェルマイクロプレートに、マスタープレートからコロニー物質を接種した。
２％グルコースを含むＶｅｒｄｕｙｎ液体培地が入っているマイクロプレートを、湿度８０％のＩｎｆｏｒｓマイクロプレートシェーカー内、３０℃および５５０ｒｐｍで２日間増殖させた。
その後、グルコース増殖マイクロプレート培養１０μを、炭素源として２％アラビノースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地２００μｌが入っているマイクロプレートにトランスファーした。３０℃、５５０ｒｐｍおよび湿度８０％のＩｎｆｏｒｓシェーカー内でのインキュベーションは４日間続いた。毎日、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、６２０ｎｍでの光学濃度を測定することにより増殖を監視した。アラビノースを利用できる能力は、唯一の炭素源としてのアラビノースで４日間インキュベートした後の最終光学濃度を、同一マイクロプレートの初期光学濃度で割ることによって表した。結果の一例を表８にまとめる。
Figure 2013524797
予想される通り、２つの対照株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１およびＢＩＥ２０１の間に大きな差があることが、表８から明らかである。ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１は、実際には増殖が何も得られなかったことを意味する、レベル５に達する。係数５は若干の増殖が起こったことを示唆するが、これは前培養からの栄養の持ち越しに（残余グルコース、エタノール）起因する可能性が最も高いであろう。株ＢＩＥ２０１は、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１より著しく高い、増殖比２５に達する。
１倍体誘導体は、低増殖（ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１同様）から高レベルの増殖（ＢＩＥ２０１同様およびＢＩＥ２０１のレベルを超える）まで、広範な増殖表現型を示す。また、中間の増殖レベルを有する株も得られた。たとえば、第１の子嚢、子嚢Ａでは、４つの１倍体株Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４を生じる結果となり、アラビノース増殖表現型の２：２分離が得られる。得られた低増殖レベルと高増殖レベルの間の分離が２：２パターンに従わない子嚢もある。たとえば、子嚢Ｂでは、高レベル増殖表現型株１つ、中間レベル（９という値）を有する株１つ、および低増殖表現型を有する１倍体２つが得られる。他の子嚢に由来する１倍体株から、同様の観察が行える。
［７．５Ｈｉ−Ｒｅｓを使用した、１倍体子孫におけるＳＮＰ検出］
２％グルコースを加えたＹＥＰ−培地が入っている９６ウェルマイクロプレートに、マスタープレートからコロニー物質を接種した（セクション７．４）。細胞を、Ｉｎｆｏｒｓシェーカー内、３０℃、５５０ｒｐｍおよび湿度８０％で２日間、増殖させた。対照として、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１および株ＢＩＥ２０１を含めた。
染色体ＤＮＡは、小規模化した様式で上記プロトコールを使用して、分離した。染色体ＤＮＡは、セクション５．２に記述されている通り、Ｈｉ−Ｒｅｓ分析用の鋳型の役割をする。Ｈｉ−Ｒｅｓ分析は、交雑ＢＩＥ２０１（ｍａｔα） Ｘ ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１（ｍａｔＡ）由来の各１倍体分離個体におけるＳＮＰの同定を可能にする。同様に、染色体ＶＩＩ上の増殖領域の存在は、セクション６．２に記述されている方法に従って決定された。ＳＮＰｓおよび増幅に関して、各１倍体分離個体の遺伝子型が決定された。結果を表９に示す。
Figure 2013524797
大抵の子嚢で、ＳＮＰｓおよび増幅の２：２分離が観察される。これには若干の例外があり、たとえば減数分裂遺伝子変換に起因する可能性がある。
［７．６これらのデータセットの解析］
セクション７．４および７．５（それぞれ表８および９）のデータセットを組み合わせることにより、下表、表１０を生じる。しかし、表Ｚでは、結果を、アラビノースでの高増殖から低増殖まで、分類されている。
Figure 2013524797
表１０の結果から、増幅は、アラビノースで比較的高い増殖速度で増殖する能力を決定する、重要事象であることが強く示唆される。増幅を有する株のほとんどが、表１０の上位９つにある。こうした株の３分の２はＧＡＬ８０遺伝子中にＳＮＰも有し、ＧＡＬ８０遺伝子におけるＳＮＰの存在と増幅の存在との間の相互作用が示唆される。
統計学的に、どの因子が高増殖と関連しているか、また相乗効果があるかどうかを決定するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用した。その設計は不均衡であるが、データの統計学的検定に基づけば、増幅の存在（ｐ＜＜０．０１）が増殖に対してプラス効果があることは明かである。結果から、ＧＡＬ８０ ＳＮＰと増幅の存在との間に強い相互作用が存在する（ｐ＜＜０．０１）が、その他のＳＮＰには有意な作用がない（ｐ＞０．０１）ことも明らかである。
増幅がない場合には、８．４という中央値増殖が推定されるが、増幅が存在する場合には中央値増殖は１７．６である。ＧＡＬ８０ ＳＮＰも増幅もない場合には８．７という中央値増殖が推定されるが、両者が存在する場合には中央値増殖は２６．８である。
また、ＣＥＰ３ ＳＮＰの存在と増幅の存在との相互作用には、相乗効果があるようであるが、ＧＡＬ８０ ＳＮＰの存在と増幅の存在との間の相互作用より程度は低い。
要するに、ＳＮＰｓおよび／または増幅の存在に起因する、増殖に対する効果および効果の有意性を決定することができた。増幅は、増殖に対して有意な効果を有する。この効果は、増幅とＧＡＬ８０ ＳＮＰの組合せを介して増強する。増幅とＣＥＰ３ＳＮＰの組合せならびに増幅、ＧＡＬ８０ＳＮＰおよびＣＥＰ３ＳＮＰの組合せで、小さな相互作用効果が検出された。
［実施例８］
［ＧＡＬ８０の欠失は、さらに良いアラビノース転化につながる］
染色体ＶＩＩの一部の増幅も存在する場合、ＧＡＬ８０遺伝子中で同定されたＳＮＰは、アラビノースでの増殖に対してプラスの相加効果を有することが、実施例７で証明された。
ＧＡＬ８０は、ガラクトースに応答して転写制御に関与する転写リプレッサーをコード化する（Ｔｉｍｓｏｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３６３（Ｐｔ ３）：５１５−２０）。Ｇａｌ８０ｐは、Ｇａｌ４ｐおよびＧａｌ３ｐと併せて、ＧＡＬ代謝遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ２、およびＧＡＬ７を含む、プロモーター（ＵＡＳ−ＧＡＬ）におけるＧＡＬ上流活性化部位を含む遺伝子の発現を協調的に制御する（Ｌｏｈｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ ９（９）：７７７−８７で概説）。ｇａｌ８０に対するヌル細胞は、非誘導培地中であっても、ＧＡＬ遺伝子を構成的に発現する（Ｔｏｒｃｈｉａ ＴＥ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ４（８）：１５２１−７）。
仮説は、ＧＡＬ８０遺伝子で同定されたＳＮＰは、Ｇａｌ８０ｐ、Ｇａｌ３ｐおよびＧａｌ４ｐの間の相互作用に影響を及ぼすということである。それ故、ガラクトースパーミアーゼをコード化するＧＡＬ２を含む、ガラクトース代謝遺伝子の発現が変更され、かつ野生型ＧＡＬ８０対立遺伝子を有する酵母細胞と比較されるであろう。Ｇａｌ２ｐ（ガラクトースパーミアーゼ）はアラビノースの主要糖輸送体である（Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ（１９７０）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０３（３）：６７１−６７８；Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｂｏｌｅｓ（２００３）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（７）：４１４４−４１５０）。
明らかに、ＧＡＬ８０遺伝子中のＳＮＰは、Ｌ−アラビノースを転化する能力に対してプラスの効果を有する。アラビノース増殖表現型をさらに改良できるかどうかを調査するために、ＰＣＲ−介在遺伝子置換戦略を使用して、ＧＡＬ８０遺伝子のコード配列をそっくりそのまま削除した。
［８．１ ＧＡＬ８０遺伝子の破壊］
配列番号５８および配列番号５９のプライマー（それぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマー）を、プラスミドｐ４２７−ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）由来のｋａｎＭＸ−マーカーの増幅に使用した。プライマーの隣接領域は、ＧＡＬ８０遺伝子の５’−領域および３’−領域と相同であった。Ｗａｃｈ（Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｙｅａｓｔ１０，１７９３−１８０８）による記述と同様に、同種組み換えの際に、ＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦはｋａｎＭＸマーカーと置換されるであろう。得られたフラグメントは、ＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸフラグメントと呼ばれる。
株ＢＩＥ２５２の酵母形質転換は、Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（２００２），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０：８７−９６）により記述されたプロトコールに従って、精製ＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸフラグメントを用いて実施された。株ＢＩＥ２５２の構築は、欧州特許第１０１６０６２２．６号明細書に記述されている。株ＢＩＥ２５２は、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のキシロースおよびアラビノース発酵株であり、ＢＩＥ２０１の誘導体である。株ＢＩＥ２５２はまたＧＡＬ８０ ＳＮＰも含む。
選択のため、形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＥＰＤ−寒天上にプレーティングした。コロニーが目に見えるまで、このプレートを３０℃でインキュベートした。プラスミドｐ４２７−ＴＥＦを陽性対照として含め、多くのコロニーを生じた。ＭｉｌｌｉＱ（すなわちＤＮＡなし）を陰性対照として含め、コロニーは何も生じなかった。ＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸフラグメントは多くのコロニーを生じた。正しい組み込みを検証するために、２つの独立したコロニーをサザンブロット法で試験した（不掲載データ）。ＧＡＬ８０遺伝子の正しい欠失を有する１コロニーは、ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０と呼ばれた。
［８．２ ＢＡＭにおける性能に対するＧＡＬ８０遺伝子置換の影響］
ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ；Ｈａｌｏｔｅｃ ＢＶ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）実験を実施した。株ＢＩＥ２５２および株ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０（ｋａｎＭＸマーカーによってＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦが正しく置換された形質転換体）の単一コロニー分離株を使用して、２％グルコースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８：５０１−５１７，１９９２）に接種した。この前培養を、３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を回収し、培地１ｋｇ当たり約１グラム乾燥重量という細胞密度で、合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトースおよび０．５％マンノースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地、ｐＨ４．２）に接種した。ＣＯ２生成を常時監視した。糖転化および産物形成をＮＭＲで分析した。データは、指示された時点の糖類の残量（１リットル当たりのグラム数で表した、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノースおよびキシロース）および（副）産物（エタノール、グリセロール等）の形成を表す。増殖は、６００ｎｍにおける、培養の光学濃度を追跡することによって監視した。実験は、約７２時間実行されていた。
グラフを、図２０（ＢＩＥ２５２）および図２１（ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０）に示す。
実験は、参考株ＢＩＥ２５２がグルコースおよびマンノースを急速に転化することを明らかに表す。グルコース枯渇（約１０時間）後、キシロースおよびアラビノースの転化が始まった。約１０時間の時点で幾らかのガラクトースは既に発酵されており、それはグルコースとガラクトースの（部分的）同時利用を可能にしたであろう、この株のＧＡＬ８０ＳＮＰに起因する可能性があった。約７２時間の実験の終わりに、ほぼ全ての糖類が転化された。糖１グラム当たりエタノール０．３７グラムというエタノール収率が得られた。
株ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０は株ＢＩＥ２５２より速い糖転化能力を示す。また、この株の場合には、発酵の最初の数時間に、マンノースおよびグルコースが転化される。しかし、株ＢＩＥ２５２とは対照的に、この形質転換体では、アラビノースおよび特にキシロースと共に、グルコース、ガラクトースおよびマンノースが幾らか共消費される。概して、糖消費は速く、全ての利用可能な糖類の、より完全な使用につながる。このことは、時間内のＣＯ２発生からも明らかである。ＢＩＥ２５２の場合には、基本的にグルコースおよびマンノースから形成されるＣＯ２である、第１のピークが観測される。１０ｍｌ／時間のすぐ上という最低値に達した後（図２０）、第２の、より平たいピークが観測される。しかしＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０の場合には（図２１）、ＮＭＲによる糖分析から明らかなように、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノースおよびガラクトースの共使用増強のため、第２のピークは第１のピークの尾部として現れる。親株ＢＩＥ２５２では、異なる糖類の使用はより逐次的である。それ故、株ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０の収率は、実験の終わり（７２ｈ）に、より高い：糖１グラム当たりエタノール０．４０グラム。
要するに、ＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦの欠失は、株ＢＩＥ２５２で試験された通り、さらなる改良された性能を生じる結果となった。
［実施例９］
［株ＢＩＥ２０１におけるアジピン酸生成］
［９．１ ＤＮＡ２．０で注文した合成ＤＮＡフラグメント］
効率的発現のために、アジピン酸経路に関与する９つのオープンリーディングフレームを含む９つのＤＮＡフラグメント（２０１１年３月２８日出願の欧州特許出願第１１１６００００．３号明細書参照）およびＳ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロモーターおよびターミネーターの合成をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ ９４０２５，ＵＳＡ）で注文した。場合により、ＢＩＥ２０１に形質転換後、経路のインビボ組み換えのために、アジピン酸経路の隣接部分との相同性を合成フラグメントに加えた。ＤＮＡ２．０は、標準クローニングベクター中のクローン化挿入物として、合成フラグメントを納品した。この結果として以下のプラスミドが得られた（括弧内は省略形）、ｐＡＤＩ１４１（Ａｄｉ２１）、ｐＡＤＩ１４２（Ａｄｉ２２）、ｐＡＤＩ１４３（Ａｄｉ２３）、ｐＡＤＩ１９９（Ａｄｉ８）、ｐＡＤＩ１４５（Ａｄｉ２４）、ｐＡＤＩ１４６（Ａｄｉ２５）、ｐＡＤＩ１４９（ＳｕｃＣ）、ｐＡＤＩ１５０（ＳｕｃＤ）およびｐＡＤＩ２００（Ａｃｄｈ６７）。表１１は経路に関与する遺伝子、使用された省略形、起源、Ｕｎｉｐｒｏｔコードおよび経路への関与を表す。
Figure 2013524797
［９．２ ＢＩＥ２０１への形質転換のためのＰＣＲフラグメントの調製］
インビボ同種組み換えを使用して、完全なアジピン酸経路を組み立ててＢＩＥ２０１に組み込んだ。完全な経路（５０〜２５０ｂｐ）の組み換えに必要な相同性は、合成フラグメントの合成中に加えるか、またはフラグメントの増幅に使用されるプライマーにその配列を付加することによって、加えた。プライマー配列を表１２に記載する。
Figure 2013524797
完全なアジピン酸経路をＢＩＥ２０１のゲノムに組み込むためには、アジピン酸経路に属する遺伝子発現カセットを含む９つのＰＣＲフラグメント（配列番号８４〜９２）、Ｇ４１８に耐性を与えるｋａｎＭＸ−マーカーを含む１つのＰＣＲフラグメント（配列番号９３）、および最後にＩＮＴ１ＬＦ（ＩＮＴｅｇｒａｔｉｏｎ Ｌｅｆｔ Ｆｌａｎｋ）およびＩＮＴ１ＲＦ（ＩＮＴｅｇｒａｔｉｏｎ Ｒｉｇｈｔ Ｆｌａｎｋ）組み込み隣接領域（それぞれ配列番号９４および配列番号９５）の、総計で１２のフラグメント（図２２参照）が必要だった。全てのフラグメントは、二重交差によって経路をゲノムに組み込むために、ＩＮＴ１ＬＦおよびＩＮＴ１ＲＦへの経路内および経路外の各隣接フラグメントと重複する相同性を備えて、作成された。経路の同種組み換え事象、完全な組み立ておよび組み込みを、図２２の図面に示す。形質転換に使用された、作成されたＰＣＲフラグメントを、表１３に記載する。その配列は、配列番号８４から配列番号９５まで、として本明細書に含まれる。表１３は、形質転換用フラグメントを作成するためのＰＣＲ増幅反応で使用された遺伝子およびプライマーに使用されたプロモーターおよびターミネーターに関する情報を表す。
Figure 2013524797
全てのＰＣＲ反応は、説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した。ＤＮＡ２．０で注文したプラスミドは、９つのアジピン酸経路遺伝子を増幅するための鋳型として使用された。ｋａｎＭＸ−マーカーは、マーカー配列を担持するプラスミドｐＵＧ７から増幅された。ｐＵＧ７は以下の通りに構築された：プラスミドｐＵＧ６（（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２５１９−２５２４）のｌｏｘＰ部位は、改変ｌｏｘＰ−部位ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１を含むリンカーをクローニングすることにより、２工程で置換された（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４，ｐｐ８６８−８７２）。正しい置換を確認するために、切断解析およびシーケンシングを実施した。
「ＩＮＴ１遺伝子座」における組み込みのためのＩＮＴ１ＬＦおよびＩＮＴ１ＲＦ（それぞれ左隣接領域および右隣接領域）は、ＢＩＥ１０４から分離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用して増幅された。
ＰＣＲフラグメントのサイズは、標準アガロース電気泳動技術でチェックした。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントは、説明書に従って、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを用いて精製し濃縮した。ＤＮＡ濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＮａｎｏｄｒｏｐを使用して測定した（Ａ２６０／Ａ２８０吸光度）。
［９．３ 酵母形質転換］
Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０：８７−９６）により記述されている通りに実施した。ＢＩＥ２０１を、１２の増幅され精製されたＰＣＲフラグメント各１μｇで形質転換した。形質転換混合物を、１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＹＰＤ−寒天（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ、１リットル当たり２０ｇのペプトン、１リットル当たり２０ｇのデキストロース、寒天２０ｇ）上にプレーティングした。２〜４日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験でＤＮＡ無添加）は空のＹＰＤ／Ｇ４１８−プレートに終わった。形質転換プレートから、単一コロニーを、１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８を含む新しいＹＰＤ−寒天プレートにトランスファーした。プレートを、３０℃で２日間インキュベートした。
［９．４ アラビノースでのアジピン酸生成］
４つの形質転換体（株１、株２、株３および株４）の単一コロニーおよび対照株としてのＢＩＥ２０１の単一コロニーを、１ウェル当たり、２％アラビノースおよび０．０５％グルコースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地２００μｌが入っているハーフディープウェルＭＴＰ（マイクロプレート）に、二重に接種した。このＭＴＰを、マイクロプレート用Ｉｎｆｏｒｓシェーカー内、３０℃、５５０ｒｐｍおよび湿度８０％で、４８時間インキュベートした。４８時間インキュベートした後、各培養４０μｌを、１ウェル当たり、２％アラビノースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地２．５ｍｌが入っている２つの２４ウェルプレートにトランスファーした。この２４ウェルプレートを標準ＭＴＰ蓋で覆い、３０℃、５５０ｒｐｍおよび湿度８０％で、２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、この２４ウェルプレートを、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離機内、２７５０ｇで１０分間遠心分離した。上澄を除去し、細胞ペレットが入っている各ウェルに、２％アラビノースを含む用時調製Ｖｅｒｄｕｙｎ培地４．５ｍｌを加えた。この細胞ペレットを、ピペットで再懸濁させた。１つのプレートでは、通気を改良するために、標準ＭＴＰ蓋をエアポアシート（ａｉｒｐｏｒｅ ｓｈｅｅｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）と取り換えた。第２の２４ウェルプレートでは、微好気的環境を作るＢｕｇＳｔｏｐｐｅｒＴＭ Ｃａｐｍａｔ（Ｗｈａｔｍａｎ）と取り換えた。この２４−ウェルプレートを、Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｉｃｒｏｔｒｏｎインキューベーター内、３０℃、３５０ｒｐｍおよび湿度８０％で、７２時間インキュベートした。インキュベーション後、このプレートを、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離機内、２７５０ｇで１０分間遠心分離した。上澄のアジピン酸濃度を、ＬＣ−ＭＳで測定した。結果を表１４に示す。
Figure 2013524797
株２、株３および株４は、アラビノースを唯一の炭素源として含むＶｅｒｄｕｙｎ培地でアジピン酸を生成する。エアポアシートを用いたプレートと比較するとき、酸素制限条件下で、すなわちバグストッパー蓋を用いて、より高いレベルが得られた。
参考株ＢＩＥ２０１はアラビノースで増殖するが、アジピン酸を生成しない。
［９．５ ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（ＥＳＩ陰性モード）］
以下の仕様を有するカラムを用いて、試料を分析した「Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３，１．８μｍ，１００ｍｍ＊２．１ｍｍＩ．Ｄ．」。フルループ（ｆｕｌｌ ｌｏｏｐ）を使用した注入量は５μｌであり、カラム流量は０．２５０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であった。表１５は、移動相Ａおよび移動相Ｂに使用された勾配を表す。移動相Ａは水中０．１％のギ酸を含み、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸を含む。
Figure 2013524797
図２３は、１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌアジピン酸を含むスタンダード、および３ｍｇ／ｌアジピン酸を含む、バグストッパーを用いたアラビノースでの株３生成で、株３により生成された試料の、ＭＲＭクロマトグラムを表す。
［実施例１０］
［コハク酸生成］
［１０．１発現構築物］
アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫａ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．４９）、およびトリマノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）由来のグリコソーム性フマル酸レダクターゼＦＲＤｇ（Ｅ．Ｃ．１．３．１．６）を含む発現構築物ｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−３、ならびにリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のフマラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２．）、およびペルオキシソーム性リンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨ３（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）を含む発現構築物ｐＧＢＳ４１５ＦＵＭ３は、国際公開第２００９／０６５７７８号パンフレットの１９〜２０ページ、および２２〜３０ページ（図および配列表を含む参照により本明細書に含める）に既述の通りに作成した。
ラクトバチルス・プランタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを含む発現構築物ｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤは、プラスミドｐＰＷＴ０１８由来のａｒａＡＢＤ発現カセットを含むＰＣＲ産物を、プラスミドｐＲＳ４１６にクローニングすることによって構築した。ＰＣＲフラグメントは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および本明細書で配列番号９６および配列番号９７と定義されたＰＣＲプライマーを使用して生じさせた。このＰＣＲ産物を、プラスミドｐＲＳ４１６と同様、制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の連結および形質転換の後、制限酵素分析に基づいて、正しい組み換えを選択した。プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤの物理地図を図２４に提示する。
［１０．２ Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株］
プラスミドｐＧＢＳ４１４ＰＰＫ−３、プラスミドｐＧＢＳ４１５−ＦＵＭ−３を、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−６Ｂ（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１１２ ｔｒｐ１−２８９）に形質転換した。加えて、プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤをこの酵母に形質転換して、原栄養性酵母株を作る。発現ベクターを、エレクトロポレーションにより酵母に形質転換した。形質転換混合物を酵母窒素原基礎培地（ＹＮＢ）ｗ／ｏ ＡＡ（Ｄｉｆｃｏ）＋２％グルコース上にプレーティングした。１つのこのような形質転換体はＳＵＣ５９５と呼ばれた。
対照として、株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−６Ｂは、プラスミドｐＧＢＳ４１６ＡＲＡＡＢＤのみで形質転換させた。１つのこのような形質転換体はＳＵＣ６００と呼ばれた。
株を、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖するための適応進化（実施例２、セクション２．１参照）にかけた。実施例２では、アラビノースを含むＹＮＢ−培地を使用したが、実施例では、２％アラビノースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地を使用した。
適応進化振盪フラスコから分離された単一コロニー分離株を、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖できる能力について特性化した。適応進化を介したＳＵＣ５９５の誘導体である、ＳＵＣ６８９は、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖速度０．１ｈ−１を有する。適応進化を介したＳＵＣ６００の誘導体である、ＳＵＣ６９４は、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖速度０．０９ｈ−１を有する。
［１０．３ 増殖実験およびコハク酸生成］
形質転換体ＳＵＣ６８９および形質転換体ＳＵＣ６９４の単一コロニー分離株を、ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ）、４％ガラクトースおよび２％寒天が入っている９６ウェルマイクロプレートに接種した。１株当たり４つの独立したコロニーを接種した。３０℃で２日間増殖させた後、ピンツールを用いて、コロニー物質を、４％ガラクトース（ｗ／ｖ）を含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ．Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）からなる前培養培地２００μｌが入っている９６ウェルマイクロプレートにトランスファーし、３０℃、５５０ｒｐｍおよび湿度８０％のＩｎｆｏｒｓ振盪インキュベーター内で、好気的条件下で増殖させた。約４８時間後、４％ガラクトースを加えた用時調製Ｖｅｒｄｕｙｎ培地２．５ｍｌが入っている２４ウェルマイクロプレートに細胞を二重にトランスファーした。３０℃で約７２時間インキュベートした後、細胞を培地から分離するために、このプレートをマイクロプレート遠心分離機内で遠心沈殿させた。上澄を傾瀉した。この細胞を、８％アラビノースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地４ｍｌ中に再懸濁させた。４８時間（マイクロプレート１）および７２時間（マイクロプレート２）という、二通りの時間間隔で、細胞を沈降させることによってインキュベーションを停止した。上澄を使用して、セクション１０．４に記述した通り、ＮＭＲでコハク酸レベルを測定した。
［１０．４ ＮＭＲ分析］
両試料中の有機酸および糖類を測定するために、ＮＭＲを実施した。
結果を表１６および表１７に示す。
Figure 2013524797
Figure 2013524797
株ＳＵＣ６８９の場合、株ＳＵＣ６９４と比べてコハク酸の量が多いことが、表１６および表１７から明らかである。後者はほぼ全てのアラビノースを転化し、そして産物として、主にバイオマスおよびエタノールが形成された。株ＳＵＣ６８９の場合、より少量のエタノールが形成されるが、ＳＵＣ６９４と比べて３〜４倍多い、有意に多量のコハク酸が形成される。コハク酸収率を算出し、下表に示した。
Figure 2013524797
要するに、株ＳＵＣ６８９ではアラビノースからコハク酸が生成されたが、コハク酸経路を発現しない株である、株ＳＵＣ６９４では、有意に少なかった。
［実施例１１］
［ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子の特別なコピーの導入］
［１１．１ ａｒａＡＢＤ−カセットの増幅］
ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子の特別なコピーをゲノムに導入するために、鋳型としてプラスミドｐＰＷＴ０１８を、またプライマーとして配列番号９８および配列番号９９を含むオリゴヌクレオチドを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用してＰＣＲ反応を実施した。これらのプライマーを用いると、ａｒａＡＢＤ−カセットが増幅される。プライマー設計は、ＰＣＲフラグメントの隣接領域が、酵母トランスポゾンＴｙ−１のδ配列のコンセンサス配列と相同であるというものであった。こうした配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得ることができ、またたとえばアラインメントを可能にする、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ ９ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＵＳＡ）のようなソフトウェアパッケージを使用して、アライニングできる。
ａｒａＡＢＤ−カセットは、ゲノムへの組み込みを選択できる、選択可能マーカーを含まない。形質転換頻度を推定するために、ｋａｎＭＸ−マーカーを用いて第２の対照形質転換を実施した。この目的を達成するために、プラスミドｐ４２７ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）由来のｋａｎＭＸ−カセットを、配列番号１００および配列番号１０１に対応するプライマーを使用したＰＣＲ反応で増幅した。
［１１．２ ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の形質転換］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１は、エレクトロポレーションプロトコール（上記の通り）に従い、ａｒａＡＢＤ−カセット（Ｔｙ１：：ａｒａＡＢＤと呼ばれる）３０μｇまたはｋａｎＭＸ−カセット１０μｇのいずれかを含むフラグメントを用いて、形質転換した。ｋａｎＭＸ−形質転換混合物を、１ｍｌ当たり１００μｇのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＹＰＤ−寒天（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ、１リットル当たり２０ｇのペプトン、１リットル当たり２０ｇのデキストロース、寒天２０ｇ）上にプレーティングする。２〜４日後、コロニーがプレート上に出現しているが、陰性対照（すなわち、形質転換実験でＤＮＡ無添加）は空のＹＰＤ／Ｇ４１８−プレートに終わる。形質転換頻度は、ｋａｎＭＸ−カセット１μｇ当たり６００コロニーより高い。
Ｔｙ１：：ａｒａＡＢＤ形質転換混合物を使用して、２％アラビノースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地１００ｍｌが入っている振盪フラスコに接種した。対照として、形質転換の陰性対照（すなわち、形質転換実験でＤＮＡ無添加）を使用する。振盪フラスコを、オービタルシェーカー内、３０℃および２８０ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、６００ｎｍの光学濃度を定期的に測定することによって追跡する。
約２５日後、Ｔｙ１：：ａｒａＡＢＤ振盪フラスコの光学濃度は上昇するが、陰性対照における増殖はまだない。２５日目に、２％アラビノースを加えた用時調製Ｖｅｒｄｕｙｎ培地が入っているフラスコに、Ｔｙ１：：ａｒａＡＢＤ培養から、６００ｎｍにおける開始光学濃度０．１５まで接種する。この培養は直ちにかつ急速にアラビノースで増殖し始める。たぶん、この培養は継代培養の混合物からなるため、したがって、Ｔｙ１：：ａｒａＡＢＤカセットのコピー数およびアラビノースでの増殖速度に差がある細胞からなるため、単一コロニー分離株を入手するために、細胞をｍｉｌｌｉＱ水で希釈し、ＹＰＤ−寒天プレート上にプレーティングする。単一コロニー分離株を、様々な炭素源を利用できる能力について試験する。
［１１．３ より優れたアラビノース転化株の選択］
他の重要な糖類（グルコース、およびガラクトース）を利用する能力を失わずに、唯一の炭素源としてのアラビノースでの改良された増殖を獲得した株を選択するために、適応進化培養の単一コロニー分離株１０株を、ＹＰＤ−寒天上に再画線する。その後、２％グルコースを加えたＹＰＤ−培地で前培養を行う。１０の培養は、３０℃および２８０℃で一晩インキュベートする。各培養のアリコートを使用して、２％グルコース、または２％アラビノースまたは２％ガラクトースのいずれかを加えた用時調製Ｖｅｒｄｕｙｎ培地に、初期光学濃度０．１５で、接種する。対照として、株ＢＩＥ２０１、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１および混合個体群（これから１０の単一コロニー分離株が回収される）を実験に含める。細胞を、オービタルシェーカー内、３０℃および２８０ｒｐｍで増殖させる。増殖は、６００ｎｍにおける光学濃度測定値に基づいて評価する。
結果は、混合培養も１０の単一コロニー分離株も、６００ｎｍでより高い最終光学濃度を示すことを表している。
コロニー（コロニーＴ）１つが、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖に基づいて選択される。このコロニーは、２％アラビノースを加えたＶｅｒｄｕｙｎ培地に接種されると、親株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１より高い増殖速度を表している。その増殖速度は、株ＢＩＥ２０１の増殖速度に匹敵する。
Ｑ−ＰＣＲは、株ＢＩＥ２０１、株ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１およびコロニーＴの染色体ＤＮＡを用いて行われる。ａｒａＡＢＤカセットのコピー数は、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の場合には１であると決定され、コロニーＴの場合にもＢＩＥ２０１の場合にも２より大きいと決定される。

Claims (14)

  1. アラビノースを転化できる細胞を製造する方法であって、以下の工程：
    ａ）アラビノースを転化できない宿主株に、遺伝子ａｒａＡ、遺伝子ａｒａＢおよび遺伝子ａｒａＤを導入する工程であって、この細胞は構築細胞と呼ばれる工程；
    ｂ）アラビノースを転化する細胞が得られるまで、前記構築細胞を適応進化にかける工程、
    ｃ）任意選択的に、前記第１アラビノース転化細胞を適応進化にかけて、前記アラビノース転化を改良する工程であって；工程ｂ）またはｃ）で製造される前記細胞は、第１アラビノース転化細胞と呼ばれる工程；
    ｄ）前記第１アラビノース転化細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部および前記構築細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部を分析する工程；
    ｅ）前記第１アラビノース転化細胞における一塩基変異多型（ＳＮＰ’ｓ）を同定する工程；および
    ｆ）前記ＳＮＰ’ｓの情報を、アラビノースを転化できる細胞の合理的設計で使用する工程；
    ｇ）工程ｆ）で設計される、アラビノースを転化できる細胞の構築の工程；
    を含む、方法。
  2. 工程ｅ）、ｆ）および／またはｇ）で、表現型検査の１つ以上の技術が、遺伝子型決定の１つ以上の技術と併用される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法で、アラビノースを転化できる前記酵母細胞は、前記宿主株と比較して増幅される染色体を有し、前記増幅される染色体は、前記ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子が前記宿主株に導入された前記染色体と同数を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記増幅される染色体が染色体ＶＩＩである、請求項３に記載の方法。
  5. 電気泳動法で測定するとき、酵母細胞ＢＩＥ２０１を除き、染色体ＶＩＩが１３００〜１６００Ｋｂのサイズを有する、ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子を有する酵母細胞。
  6. 前記ａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子およびａｒａＤ遺伝子のコピー数がそれぞれ３〜５である、請求項５に記載の酵母細胞。
  7. ＳＳＹ１遺伝子における突然変異Ｇ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子における突然変異Ａ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子における突然変異Ａ１１８６Ｇ、およびＧＡＬ８０遺伝子における突然変異Ａ４３６Ｃからなる群から選択される、前記一塩基多型の１つ以上を有する、請求項６に記載の酵母細胞。
  8. ＧＡＬ８０遺伝子に単一多型Ａ４３６Ｃを有する、請求項７に記載の酵母細胞。
  9. ＣＥＰ３遺伝子に一塩基多型Ａ１１８６Ｇをやはり有する、請求項８に記載の酵母細胞。
  10. ポリペプチド類：
    ａ．ＳＳＹ１に置換Ｅ４５５ｓｔｏｐを有するポリヌクレオチド配列番号１４によりコード化される配列を有するポリペプチド、およびその他の位置の１つ以上が、ＡＡトランススーパーファミリーにおける既存のアミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド類；
    ｂ．ＹＪＲ１５４ｗに置換Ｄ１７１Ｇを有するポリヌクレオチド配列番号１６によりコード化される配列を有するポリペプチド、およびその他の位置の１つ以上が、ＰｈｙＨスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド；
    ｃ．ＣＥＰ３に置換Ｓ３９６Ｇを有するポリヌクレオチド配列番号１８によりコード化される配列を有するポリペプチド；
    ｄ．ＧＡＬ８０に置換Ｔ１４６Ｐを有する配列番号２０によりコード化される配列を有するポリペプチド、
    および、その他の位置の１つ以上がＮＡＤＢ Ｒｏｓｓｍａｎｎスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸であるアミノ酸を含むアミノ酸の突然変異を有してもよい、その変異形ポリペプチド類；
    からなる群に属するポリペプチド。
  11. グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースを含む糖組成物から１つ以上の発酵産物を生成する方法であって、前記糖組成物が請求項５〜９のいずれか１項に記載の酵母細胞を用いて発酵される方法。
  12. ａ）前処理済のリグノセルロース物質を生成するための、１つ以上のリグノセルロース物質の前処理；
    ｂ）前記糖組成物を生成するための、前記前処理済リグノセルロース物質の酵素処理；
    によって、前記糖組成物がリグノセルロース物質から生成される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記発酵が嫌気的に実施される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記発酵産物が、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、たとえばリシン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸等、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン類、医薬品、動物飼料サプリメント、特殊化学品、化学的原料、プラスチック、溶剤、バイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーを含む燃料、および工業用酵素、たとえばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ類、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼ等からなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
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