ES2651076T3 - Célula adecuada para la fermentación de una composición de azúcares mixtos - Google Patents

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Abstract

Célula adecuada para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y manosa, en la que la célula comprende dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de cada uno de araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula.

Description

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DESCRIPCION
Célula adecuada para la fermentación de una composición de azúcares mixtos Campo de la invención
La invención se refiere a una célula (también designada en el presente documento una célula de azúcares mixtos), adecuada para la fermentación de una composición de azúcares que comprende múltiples azúcares C5 y/o C6 (tal composición también se designa en el presente documento composición de azúcares mixtos). La composición de azúcares mixtos puede originarse a partir de material lignocelulósico. La invención también se refiere a un proceso para la producción de producto de fermentación a partir de la composición de azúcares mixtos usando la célula de azúcares mixtos.
Antecedentes de la invención
La mayor parte del etanol producido como alternativa a los combustibles fósiles es actualmente a partir de la fermentación de sacarosa basada en almidón de maíz y caña de azúcar. Con el fin de alcanzar los ambiciosos objetivos de producir combustibles renovables, están siendo desarrolladas nuevas tecnologías para convertir biomasa no alimentaria en productos de fermentación tales como etanol. Saccharomyces cerevisiae es el organismo de elección en la industria del etanol, pero no puede utilizar azúcares de cinco carbonos contenidos en el componente de hemicelulosa de las materias primas de biomasa. La hemicelulosa puede constituir hasta el 20-30 % de la biomasa, siendo la xilosa y arabinosa los azúcares C5 más abundantes. La expresión heteróloga de una xilosa isomerasa (XI) es una opción para permitir que las células de levadura se metabolicen y fermenten xilosa. Asimismo, la expresión de los genes bacterianos araA, araB y araD en cepas de S. cerevisiae produce la utilización y eficiente fermentación alcohólica de arabinosa. La galactosa es un azúcar C6 que también es un azúcar que está frecuentemente presente en lignocelulosa, frecuentemente en cantidades (~4 % de azúcares totales) que no deben ser rechazados por motivos económicos.
J. van den Brink et al., Microbiology (2009)155, 1340-1350, desvelan que la glucosa es la fuente de carbono favorecida para Saccharomyces cerevisiae y que tras el cambio de las condiciones de fermentación de glucosa limitada a condición de exceso de galactosa en condición anaerobia, no se consumió galactosa.
Hasta la fecha no se ha desvelado proceso para convertir glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa en un producto de fermentación en el mismo proceso con glucosa.
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar una célula capaz de convertir glucosa, xilosa y galactosa y manosa, es decir, una mezcla de cuatro azúcares, en un producto de fermentación. Es otro objeto de la invención tal célula que es capaz de convertir glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y manosa, es decir, una mezcla de cinco azúcares, en un producto de fermentación. Es un objeto adicional de la invención proporcionar tal célula anteriormente definida que es estable. Es un objeto adicional de la invención proporcionar tal cepa anteriormente definida que está libre de marcador. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un proceso en el que la glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa se convierten simultáneamente en un producto de fermentación. Uno o más de estos objetos se obtienen según la invención.
La presente invención proporciona una célula adecuada para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y manosa, en la que la célula comprende dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de cada uno de araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula.
La invención proporciona además un proceso para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, arabinosa y xilosa y opcionalmente galactosa y/o manosa que comprende las siguientes etapas:
a) fermentación de la composición de azúcares en presencia de una célula adecuada para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y manosa, en la que la célula comprende dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de cada uno de araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula; y
b) recuperación del producto de fermentación.
En una realización, la célula de azúcares mixtos es del género Saccharomyces. En una realización, la célula de azúcares mixtos es de la especie Saccharomyces cerevisiae. En una realización, el producto de fermentación es etanol.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 expone un mapa físico del plásmido pPWT006.
La Figura 2 expone un mapa físico del plásmido pPWT018.
La Figura 3 expone una autorradiograma de transferencia Southern. Se digirió ADN cromosómico de la cepa no mutada CEN.PK113-7D (carril 1) y BIE104A2 (carril 2) con tanto EcoRI como HindIII. La transferencia se hibridó con una sonda SIT2 específica.
La Figura 4 expone un mapa físico del plásmido pPWT080, cuya secuencia de da en SEQ ID NO: 8
La Figura 5 expone una curva de crecimiento en condiciones aerobias de BIE104P1A2 sobre diferentes medios. Se precultivó la cepa BIE104A2P1 sobre YNB con 2 % de galactosa. La curva de crecimiento empezó con 2% de galactosa y 1 % de arabinosa, seguido del evento indicado en el gráfico por el número (1) transferencia a YNB con 2 % de arabinosa como única fuente de carbono. Después de alcanzar una DO 600 superior a 1, el cultivo se transfirió a medio fresco con una DO 600 inicial de 0,2. Tras tres transferencias sobre medio de arabinosa puro, la cepa resultante se designó BIE104P1A2c.
La Figura 6 expone una curva de crecimiento en condiciones anaerobias de BIE104P1A2c sobre YNB con 2 % de arabinosa como única fuente de carbono. Después de alcanzar una DO 600 superior a 1, el cultivo se transfirió a medio fresco con una DO 600 inicial de 0,2. Después de varias transferencias, la cepa resultante se llamó BIE104P1A2d (= BIE201).
La Figura 7 expone un mapa físico del plásmido pPWT042, cuya secuencia de da en SEQ ID NO: 14.
La Figura 8 expone una curva de crecimiento en condiciones aerobias de una mezcla de transformación. La cepa BIE201X9 se transformó con el fragmento X18-Ty1 y la mezcla de transformación se usó para inocular medio Verduyn complementado con 2 % de xilosa. Después de alcanzar una DO 600 de aproximadamente 35, se usó una alícuota del cultivo para inocular un segundo matraz con medio fresco. A partir del segundo matraz, se aislaron colonias para análisis adicional.
La Figura 9 expone el crecimiento de cepas aisladas individuales sobre medio Verduyn complementado con ya sea 2 % de glucosa, o 2 % de xilosa, o 2 % de arabinosa o 2 % de galactosa.
La Figura 10 expone el crecimiento de cepas aisladas individuales seleccionadas sobre medio Verduyn complementado con ya sea 2 % de xilosa o 2 % de arabinosa.
La Figura 11 expone la conversión de azúcar y formación de producto de un cultivo mixto de cepas BIE104P1Y9mc y BIE201 sobre medio sintético, en un experimento de lotes alimentados. Se midió la producción de CO2 constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se cultivó sobre 2 % de glucosa.
La Figura 12 expone la conversión de azúcar y formación de producto de la cepa BIE252 sobre medio sintético, en un experimento de lotes alimentados. Se midió la producción de CO2 constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se cultivó sobre 2 % de glucosa.
La Figura 13 expone el CO2 total que se produjo en los experimentos de lotes alimentados.
La Figura 14 expone la conversión de azúcar y formación de producto de un cultivo mixto de cepas BIE104P1Y9mc y BIE201 sobre medio sintético, en un experimento discontinuo. Se midió la producción de CO2 constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se cultivó sobre 2 % de glucosa.
La Figura 15 expone la conversión de azúcar y formación de producto de un cultivo mixto de la cepa BIE252 sobre medio sintético, en un experimento discontinuo. Se midió la producción de CO2 constantemente. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo. El precultivo se cultivó sobre 2 % de glucosa.
La Figura 16 expone el CO2 total que se produjo en los experimentos discontinuos.
La Figura 17 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en fibra de maíz hidrolizada al 13,8% de m.s. Se muestran la tasa de producción de CO2, producción de etanol y conversión de azúcar.
La Figura 18 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en hojas y tallos de maíz hidrolizados al 10 % de m.s. Se muestran la tasa de producción de CO2, producción de etanol y conversión de azúcar.
La Figura 19 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en paja de trigo hidrolizada al 10 % de m.s. Se muestran la tasa de producción de CO2, producción de etanol y conversión de azúcar.
La Figura 20a expone la conversión de azúcar (tasa) de la cepa BIE252.
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La Figura 20b expone la conversión de azúcar (tasa) de una cepa aislada de colonias individuales de la cepa BIE252 después de cultivo durante más de 100 generaciones en medio YEP con 2 % de glucosa.
La Figura 20c expone la conversión de azúcar (tasa) de una cepa aislada de colonias individuales de la cepa BIE252 después de cultivo durante más de 100 generaciones en medio YEP con 2 % de glucosa.
La Figura 21 expone el mapa físico del plásmido pPWT148.
La Figura 22 expone el mapa físico del plásmido pPWT152.
La Figura 23 expone un gel de CHEF, teñido con bromuro de etidio. Los cromosomas se separaron por su tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas analizadas son BIE104 (célula de levadura no transformada), BIE104A2P1a (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1), BIE104A2P1c, una cepa derivada de BIE104A2P1 por evolución adaptativa, que es capaz de crecer sobre arabinosa, cepa BIE201, derivada de BIE104A2P1c por evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa en condiciones anaerobias y cepa BIE252, que es una cepa de azúcares mixtos. Se observa desplazamiento en los cromosomas (véase el texto). La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad), usada como referencia para el tamaño de los cromosomas.
Breve descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 expone la secuencia del plásmido pPWT018
SEQ ID NO: 2 expone la secuencia del cebador para comprobar la integración de pPWT018
SEQ ID NO: 3 expone la secuencia del cebador para comprobar la integración de pPWT018 (con SEQ ID NO: 2) y para comprobar el número de copias de pPWT018 (con SEQ ID NO: 4)
SEQ ID NO: 4 expone la secuencia del cebador para comprobar el número de copias de pPWT018
SEQ ID NO: 5 expone la secuencia del cebador para comprobar la presencia de pPWT018 en el genoma en combinación con SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 6 expone la secuencia del cebador directo para generar la sonda SIT2 SEQ ID NO: 7 expone la secuencia del cebador inverso para generar la sonda SIT2 SEQ ID NO: 8 expone la secuencia del plásmido pPWT080
SEQ ID NO: 9 expone la secuencia del cebador directo para comprobar la correcta integración de pPWT080 en el extremo del locus GRE3 (con SEQ ID NO: 10) y para comprobar el número de copias del plásmido pPWT080 (con SEQ ID NO: 11)
SEQ ID NO: 10 expone la secuencia del cebador inverso para comprobar la correcta integración de pPWT080 en el extremo del locus GRE3
SEQ ID NO: 11 expone la secuencia del cebador inverso para comprobar el número de copias del plásmido pPWT080
SEQ ID NO: 12 expone la secuencia del cebador directo para generar una sonda RKI1 SEQ ID NO: 13 expone la secuencia del cebador inverso para generar una sonda RKI1 SEQ ID NO: 14 expone la secuencia del plásmido pPWT042
SEQ ID NO: 15 expone la secuencia del cebador para comprobar la integración de pPWT042
SEQ ID NO: 16 expone la secuencia del cebador para comprobar la integración de pPWT042
SEQ ID NO: 17 expone la secuencia del cebador para comprobar la integración de pPWT042
SEQ ID NO: 18 expone la secuencia del cebador para comprobar la pérdida de marcador de pPWT042
SEQ ID NO: 19 expone la secuencia del cebador para la amplificación del casete con xylA
SEQ ID NO: 20 expone la secuencia del cebador para la amplificación del casete con xylA
SEQ ID NO: 21 expone la secuencia del cebador para la amplificación del casete con kanMX
SEQ ID NO: 22 expone la secuencia del cebador para la amplificación del casete con kanMX
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SEQ ID NO: 23 expone la secuencia del cebador para PCR cuantitativa SEQ ID NO: 24 expone la secuencia del cebador para PCR cuantitativa.
SEQ ID NO: 25 expone la secuencia del cebador para PCR cuantitativa SEQ ID NO: 26 expone la secuencia del cebador para PCR cuantitativa.
Descripción detallada de la invención
En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir", y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye", deben interpretarse de forma incluyente. Es decir, estas palabras pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente citados, donde lo permita el contexto.
Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
Las diversas realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden ser combinadas de forma cruzada.
La composición de azúcares
La composición de azúcares según la invención comprende glucosa, arabinosa y xilosa. Puede usarse cualquier composición de azúcares en la invención que cumpla aquellos criterios. Azúcares opcionales en la composición de azúcares son galactosa y manosa. En una realización preferida, la composición de azúcares es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos. Lignocelulosa en el presente documento incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. Lignocelulosa también incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Materiales lignocelulósicos adecuados pueden encontrarse en la siguiente lista: iniciadores de huerta, chaparral, desechos de molino, desechos de madera urbanos, residuos municipales, residuos de podas, materiales de poda de bosques, cultivos de arbolados de rotación corta, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, pienso de gluten de trigo, cáscaras de avena, caña de azúcar, tallos y hojas de maíz, cañas de maíz, mazorcas de maíz, vainas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de colza, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorro; pulpa de remolacha dulce, pulpa de frutas cítricas, cáscaras de semillas, residuos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda en seco o húmedo de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, residuos de jardinería, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pulpa, residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, vainas de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una espina, un tronco, una raíz, un árbol joven, un matorral, pasto varilla, un árbol, una verdura, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, cascarillas de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de residuos orgánicos generado de un proceso agrícola, residuos de madera de silvicultura, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.
Una visión general de algunas composiciones de azúcares adecuadas derivadas de lignocelulosa y la composición de azúcares de sus hidrolizados se da en la Tabla 1. Las lignocelulosas enumeradas incluyen: mazorcas de maíz, fibra de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de melón, pulpa de remolacha azucarera, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, madera, pasto y prensados de aceituna.
Tabla 1: Visión general de las composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos. Gal=galactosa, Xil=xilosa, Ara=arabinosa, Man=manosa, Glu=glutamato, Ram=ramnosa. Se da el porcentaje de galactosa (% de Gal) y la fuente bibliográfica.
Material lignocelulósico
Gal Xil Ara Man Glu Ram Suma % de Gal. Bibl.
Mazorca de maíz a
10 286 36 227 11 570 1,7 (1)
Mazorca de maíz b
131 228 160 144 663 19,8 (1)
Cáscaras de arroz a
9 122 24 18 234 10 417 2,2 (1)
Cáscaras de arroz b
8 120 28 209 12 378 2,2 (1)
Cáscaras de melón
6 120 11 208 16 361 1,7 (1)
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Material lignocelulósico
Gal Xil Ara Man Glu Ram Suma % de Gal. Bibl.
Pulpa de remolacha azucarera
51 17 209 11 211 24 523 9,8 (2)
Paja de trigo Idaho
15 249 36 396 696 2,2 (3)
Fibra de maíz
36 176 113 372 697 5,2 (4)
Bagazo de caña de azúcar
14 180 24 5 391 614 2,3 (5)
Hojas y tallos de maíz
19 209 29 370 626 (6)
Athel (madera)
5 118 7 3 493 625 0,7 (7)
Eucalipto (madera)
22 105 8 3 445 583 3,8 (7)
CWR (pasto)
8 165 33 340 546 1,4 (7)
JTW (pasto)
7 169 28 311 515 1,3 (7)
MSW
4 24 5 20 440 493 0,9 (7)
Vegetación de pasto alpiste
16 117 30 6 209 1 379 4,2 (8)
Semilla de pasto alpiste
13 163 28 6 265 1 476 2,7 (9)
Residuos del prensado de aceitunas
15 111 24 8 329 487 3,1 (9)
Es evidente de la Tabla 1 que en estas lignocelulosas una alta cantidad de azúcar está presente en forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa en el producto de fermentación es así de gran importancia económica. También está presente manosa en algunos materiales de lignocelulosa, aunque normalmente en cantidades más bajas que los azúcares previamente mencionados. Ventajosamente, por tanto, también se convierte manosa por la célula de azúcares mixtos.
La célula de azúcares mixtos
La célula de azúcares mixtos comprende dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula.
En una realización, la célula de azúcares mixtos comprende aproximadamente ocho copias u ocho copias de xilosa isomerasa, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula de azúcares mixtos. En otra realización, la célula de azúcares mixtos comprende ocho copias de una xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula de azúcares mixtos.
El número de copias puede ser determinado por el experto por cualquier método conocido. En los ejemplos se describe un método adecuado.
La célula de azúcares mixtos comprende dos a diez copias de genes araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula. Es capaz de fermentar glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa.
En una realización, la célula de azúcares mixtos comprende dos copias, tres copias, cuatro copias cinco copias, seis copias, siete copias, ocho copias, nueve copias o diez copias, dos a diez, dos a nueve, dos a ocho, dos a siete, dos a seis, dos a cinco, dos a cuatro, tres a diez, tres a nueve, tres a ocho, tres a siete, tres a seis, tres a cinco, cuatro a diez, cuatro a nueve, cuatro a ocho, cuatro a siete o cuatro a seis copias de cada uno de los genes araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula. En una realización, la célula de azúcares mixtos comprende aproximadamente cuatro, o cuatro copias de cada uno de los genes araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula.
En una realización, el número de copias de gen de xilosa isomerasa o xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa en la célula de azúcares mixtos es ocho o nueve. En una realización, el número de copias de los genes araA, araB y araD en la célula de azúcares mixtos es 3 o 4.
En una realización, la célula es capaz de convertir el 90 % o más de glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible en un producto de fermentación. En una realización, la célula es capaz de convertir el 91 % o más, el 92 % o más, el 94 % o más, el 95 % o más, el 96 % o más, el 97 % o más, el 98 % o más o el 100 % de toda la glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible en un producto de fermentación.
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En una realización, la célula tiene una interrupción o deleción del gen GAL80.
En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos es capaz de fermentar uno o más azúcares adicionales, preferentemente azúcar C5 y/o C6, por ejemplo, manosa. En una realización de la invención, la célula de azúcares mixtos comprende uno o más de: un gen xylA, gen XYL1 y gen XYL2 y/o gen XKS1, para permitir que la célula de azúcares mixtos fermente xilosa; deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3); expresión en exceso de los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el aumento del flujo a través de la vía de la pentosa fosfato en la célula.
En una realización, la célula de azúcares mixtos es una célula industrial, más preferentemente una levadura industrial. Una célula industrial y célula de levadura industrial puede definirse del siguiente modo. Los entornos vivos de células (de levadura) en procesos industriales son significativamente diferentes de aquellos en el laboratorio. Células de levadura industriales deben ser capaces de rendir bien en múltiples condiciones medioambientales que pueden variar durante el proceso. Tales variaciones incluyen cambio en las fuentes de nutriente, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen el potencial de tener un impacto sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes medioambientales deben permitir el crecimiento y la producción robustos. Las cepas de levadura industriales son generalmente más robustas hacia estos cambios en condiciones medioambientales que pueden producirse en las aplicaciones en las que se usan, tales como en la industria de la panadería, industria cervecera, viticultura y la industria del etanol. En una realización, la célula de azúcares mixtos industrial se construye basándose en una célula hospedadora industrial, en la que la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Ejemplos de levadura industrial (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis), Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, la célula de azúcares mixtos es tolerante a inhibidor. La tolerancia a inhibidor es resistencia a inhibir compuestos. La presencia y nivel de compuestos inhibidores en lignocelulosa puede variar ampliamente con la variación de materia prima, proceso de hidrólisis del método de pretratamiento. Ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Ejemplos de ácidos carboxílicos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Ejemplos de furano son furfural e hidroximetilfurfural. Ejemplos de compuestos fenólicos son vainillina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son para ácidos carboxílicos: varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para furanos: varios cientos de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Las cepas de azúcares mixtos según la invención son tolerantes a inhibidor, es decir, pueden resistir a inhibidores comunes al nivel que normalmente tienen con condiciones de pretratamiento e hidrólisis comunes, de manera que las cepas de azúcares mixtos pueden encontrar una amplia aplicación, es decir, tiene alta aplicabilidad para diferente materia prima, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis.
En una realización, la célula de azúcares mixtos industrial se construye basándose en una célula hospedadora tolerante a inhibidor, en la que la construcción se realiza como se describe en lo sucesivo. Pueden seleccionarse células hospedadoras tolerantes a inhibidor seleccionando cepas para el crecimiento sobre inhibidores que contienen materiales, tal como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en el que se seleccionó una cepa de S. cerevisiae tolerante a inhibidor ATCC 26602.
En una realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcador. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de, una célula hospedadora que contiene el marcador. Libre de marcador significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula de azúcares mixtos. El estar libre de marcador es particularmente ventajoso cuando se han usado marcadores de antibiótico en la construcción de la célula de azúcares mixtos y se eliminan a partir de aquí. La eliminación de marcadores puede hacerse usando cualquier técnica del estado de la técnica adecuada, por ejemplo, recombinación intramolecular. Un método adecuado de la eliminación de marcadores se ilustra en los ejemplos.
Una célula de azúcares mixtos puede ser capaz de convertir biomasa de planta, celulosas, hemicelulosas, pectinas, ramnosa, galactosa, fructosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol, por ejemplo en azúcares fermentables. Por consiguiente, una célula de azúcares mixtos puede expresar una o más enzimas tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa), una hemicelulasa (una endo- o exo-xilanasa o arabinasa) necesaria para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en xilosa y monómeros de arabinosa, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.
La célula de azúcares mixtos puede comprender además aquellas actividades enzimáticas requeridas para la conversión de piruvato en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-
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hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico o una cefalosporina.
En una realización, la célula de azúcares mixtos es una célula que es naturalmente capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaerobia. Una célula de azúcares mixtos tiene preferentemente una alta tolerancia a etanol, una alta tolerancia a pH bajo (es decir, capaz de crecimiento a un pH inferior a aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2,5) y hacia productos orgánicos y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades anteriores de una célula de azúcares mixtos puede estar naturalmente presente en la célula o puede introducirse o modificarse por modificación genética.
Construcción de la cepa de azúcares mixtos
Según una realización, los genes pueden introducirse en la célula de azúcares mixtos introduciendo en una célula hospedadora:
a) una agrupación que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte
b) una agrupación que consiste en los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de promotor constitutivo fuerte; y deleción de un gen de aldosa reductasa;
c) una agrupación que consiste en un gen xylA y un gen XKS1 bajo el control de promotor constitutivo fuerte;
d) una construcción que comprende un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma en múltiples loci;
y evolución adaptativa para producir la célula de azúcares mixtos. La célula anterior puede construirse usando técnicas de expresión recombinante.
Expresión recombinante
La célula de azúcares mixtos es una célula recombinante. Es decir, una célula de azúcares mixtos comprende, o se transforma con o se modifica genéticamente con una secuencia de nucleótidos que no se produce en la célula en cuestión.
Técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, además de para las modificaciones genéticas adicionales de una célula de azúcares mixtos, son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Normalmente, tales técnicas implican la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Tales métodos se conocen, por ejemplo, de manuales estándar, tales como Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Métodos para la transformación y modificación genética de células hospedadoras fúngicas se conocen de, por ejemplo, los documentos EP-A-0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
Normalmente, la construcción de ácidos nucleicos puede ser un plásmido, por ejemplo, un plásmido de copia baja o un plásmido de copia alta. La célula según la presente invención puede comprender una única copia o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima, por ejemplo, por múltiples copias de una construcción de nucleótidos o por el uso de la construcción que tiene múltiples copias de la secuencia de enzima.
La construcción de ácidos nucleicos puede mantenerse episómicamente y así comprender una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia de secuencia de replicación autosómica. Una construcción episómica adecuada de ácidos nucleicos puede basarse, por ejemplo, en los plásmidos 2|j o pKD1 de levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9:968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula. La integración en el genoma de la célula puede producirse al azar por recombinación no homóloga, pero preferentemente, la construcción de ácidos nucleicos puede integrarse en el genoma de la célula por recombinación homóloga como es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186).
La mayoría de los plásmidos episómicos o 2j son relativamente inestables, perdiéndose en aproximadamente 10-2 o más células después de cada generación. Incluso en condiciones de crecimiento selectivo, solo del 60 % al 95 % de las células retienen el plásmido episómico. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episómicos oscila de 20-100 por célula de hospedadores cir+. Sin embargo, los plásmidos no están igualmente distribuidos entre las células, y hay una alta varianza en el número de copias por célula en las poblaciones. Cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva. Sin embargo, puede producirse pérdida de plásmidos en aproximadamente 10-3 a 10-4 frecuencias por recombinación homóloga entre
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ADN repetido en tándem, conduciendo a pérdida por formación de bucle de la secuencia del vector. Preferentemente, el diseño del vector en el caso de integración estable es tal que, ante la pérdida de los genes de marcadores de selección (que también ocurre mediante recombinación homologa intramolecular), esa pérdida por formación de bucle de la construcción integrada ya no es posible. Preferentemente, los genes están, por lo tanto, integrados de forma estable. La integración estable se define en el presente documento como la integración dentro del genoma, en el que ya no es posible la pérdida por formación de bucle de la construcción integrada. Preferentemente, los marcadores de selección están ausentes. Normalmente, la secuencia codificante de la enzima estará operativamente unid a una o más secuencias de ácidos nucleicos, capaces de proporcionar o ayudar en la transcripción y/o traducción de la secuencia de la enzima.
El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en la manera esperada. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante de modo que dicho promotor o potenciador afecte la transcripción de la secuencia codificante.
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizado en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN conocida por un experto en la materia. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayoría de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación medioambiental o del desarrollo.
El promotor que podría usarse para lograr la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima según la presente invención puede no ser nativo a la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que va a expresarse, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la que está operativamente unido. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, es decir, endógeno, a la célula hospedadora.
Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos para el experto. Ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, por ejemplo, promotores de genes glucolíticos, tales como los promotores de fosfofructocinasa (PFK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato cinasa (PYK), fosfoglicerato cinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; más detalles sobre tales promotores de levadura pueden encontrarse en (documento WO 93/03159). Otros promotores útiles son los promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas, el promotor del gen de lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y similares), y el promotor de enolasa (ENO). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación en la dirección 5' serán conocidos por aquellos expertos en la materia. Los promotores usados en las células hospedadoras de la invención pueden modificarse, si se desea, para afectar sus características de control. Promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, además de promotores modificados por ingeniería, que son muy conocidos por el experto en la materia. Promotores adecuados para células hospedadoras eucariotas pueden ser GAL7, GAL10, o GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 y TDH3.
En una célula de azúcares mixtos, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima está preferentemente unido operativamente a una secuencia terminadora de la transcripción. Preferentemente, la secuencia terminadora es operable en una célula hospedadora de elección, tal como, por ejemplo, las especies de levadura de elección. En cualquier caso, la elección del terminador no es crítica; puede ser, por ejemplo, de cualquier gen de levadura, aunque los terminadores pueden funcionar algunas veces si son de un gen eucariota distinto de levadura. Normalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima comprende un terminador. Preferentemente, tales terminadores se combinan con mutaciones que previenen el decaimiento del ARNm mediado por elementos sin sentido en la célula hospedadora de azúcares mixtos (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).
La secuencia de terminación de la transcripción comprende preferentemente además una señal de poliadenilación.
Opcionalmente, puede estar presente un marcador de selección en una construcción de ácido nucleico adecuada para su uso en la invención. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de, una célula hospedadora que contiene el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos por el cual puede usarse el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas de entre células que no están transformadas. Ejemplos de marcadores de resistencia a antibiótico adecuados incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa, higromicina-B- fosfotransferasa, 3'-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Los marcadores de resistencia a antibiótico pueden ser más convenientes para la transformación de células hospedadoras poliploides. También pueden usarse marcadores no de resistencia a antibiótico, tales como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130). En una realización preferida, las células hospedadoras transformadas con las construcciones de ácido nucleico están libres de genes
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marcadores. Métodos de construcción de células hospedadoras microbianas recombinantes libres de genes marcadores se desvelan en el documento EP-A-0 635 574 y se basan en el uso de marcadores bidireccionales tales como el gen de A. nidulans amdS (acetamidasa) o los genes de levadura URA3 y LYS2. Alternativamente, puede incorporarse un marcador de selección tal como proteína verde fluorescente, lacL, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, beta-glucuronidasa en las construcciones de ácido nucleico de la invención, que permite cribar las células transformadas.
Elementos adicionales opcionales que pueden estar presentes en las construcciones de ácido nucleico adecuadas para su uso en la invención incluyen una o más secuencias conductoras, potenciadores, factores de integración, y/o genes indicadores, secuencias intrónicas, centrómeros, telómeros y/o secuencias de unión a matriz (MAR). Las construcciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia ARS.
El proceso de combinación puede así ejecutarse con técnicas de recombinación conocidas. Diversos medios son conocidos por aquellos expertos en la materia para la expresión y expresión en exceso de enzimas en una célula de azúcares mixtos. En particular, una enzima puede expresarse en exceso aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula hospedadora, por ejemplo, mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula hospedadora, mediante la expresión del gen desde un vector de expresión multicopia episómico o mediante la introducción de un vector de expresión episómico que comprende múltiples copias del gen.
Alternativamente, la expresión en exceso de enzimas en las células hospedadoras de la invención puede lograrse usando un promotor que no es nativo a la secuencia que codifica la enzima que va a expresarse en exceso, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia codificante a la que está operativamente unido. Aunque el promotor es preferentemente heterólogo a la secuencia codificante a la que está operativamente unido, también se prefiere que el promotor sea homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedadora. Preferentemente, el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel de estado estacionario del transcrito que comprende la secuencia codificante (o es capaz de producir más moléculas de transcrito, es decir, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo a la secuencia codificante. Promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles, además de promotores modificados por ingeniería.
En una realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcadores, que significa que no están presentes marcadores auxotróficos o dominantes, en particular marcadores de resistencia a antibióticos, en el genoma o extracromosómicamente.
La secuencia codificante usada para la expresión en exceso de las enzimas mencionadas anteriormente puede preferentemente ser homologa a la célula hospedadora. Sin embargo, pueden usarse secuencias codificantes que son heterólogas al hospedador.
La expresión en exceso de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula genéticamente modificada, significa que la enzima se produce a un nivel mayor de actividad enzimática específica en comparación con la célula hospedadora sin modificar en condiciones idénticas. Normalmente, esto significa que la proteína enzimáticamente activa (o proteínas en el caso de enzimas con múltiples subunidades) se produce en cantidades mayores, o bien a un nivel de estado estacionario mayor en comparación con la célula hospedadora sin modificar, en condiciones idénticas. Similarmente, esto normalmente significa que el ARNm que codifica la proteína enzimáticamente activa se produce en cantidades mayores, o nuevamente a un nivel de estado estacionario mayor, en comparación con la célula hospedadora sin modificar en condiciones idénticas. Preferentemente, en un hospedador, una enzima que va a expresarse en exceso se expresa en exceso al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Adaptación
La adaptación es el proceso evolutivo por el cual una población se vuelve más adecuada (adaptada) para su hábitat o hábitats. Este proceso tiene lugar durante de varias a muchas generaciones, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.
El término adaptación también se puede referir a una característica que es especialmente importante para la supervivencia de un organismo. Tales adaptaciones se producen en una población variable por las formas mejor adecuadas que se reproducen más satisfactoriamente, mediante selección natural.
Los cambios en las condiciones medioambientales alteran el resultado de la selección natural, que afecta los beneficios selectivos de adaptaciones posteriores que mejoran la aptitud de un organismo bajo las nuevas condiciones. En el caso de un cambio medioambiental extremo, la aparición y fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser esencial para la supervivencia. Un gran número de factores diferentes, tales como, por ejemplo,
disponibilidad de nutrientes, temperatura, la disponibilidad de oxígeno, etcétera, pueden impulsar la evolución adaptativa.
Aptitud
Hay una clara relación entre la adaptabilidad (el grado al cual un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un 5 grupo dado de hábitats) y la aptitud. La aptitud es una estimación y un factor pronóstico de la tasa de selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el tiempo, si son heredables.
Cambios genéticos
Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, los cambios genéticos son el 10 mecanismo subyacente. Por este medio, la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden producir estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo en un modo que se adecue al hábitat cambiado.
Puede ocurrir que los hábitats cambien frecuentemente. Por tanto, de esto resulta que el proceso de adaptación nunca está finalmente completo. Con el tiempo, puede ocurrir que el entorno cambie gradualmente, y la especie 15 llegue a adaptarse a su entorno cada vez mejor. Por otra parte, puede ocurrir que los cambios en el entorno ocurran con relativa rapidez, y entonces la especie se vuelva cada menos bien adaptada. La adaptación es un proceso genético, que está ocurriendo todo el tiempo de algún modo, también cuando la población no cambia el hábitat o entorno.
La evolución adaptativa
20 Las células de azúcares mixtos pueden someterse en su preparación a evolución adaptativa. Una célula de azúcares mixtos puede adaptarse a la utilización de azúcares mediante selección de mutantes, ya sean espontáneos o inducidos (por ejemplo, mediante radiación o productos químicos), para crecer sobre el azúcar deseado, preferentemente como única fuente de carbono, y más preferentemente en condiciones anaerobias. Puede realizarse selección de mutantes por técnicas que incluyen transferencia en serie de cultivos como, por ejemplo, se 25 describe por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) o por cultivo bajo presión selectiva en un cultivo quimiostático. Por ejemplo, en una célula hospedadora preferida, al menos una de las modificaciones genéticas descritas previamente, que incluye las modificaciones obtenidas por selección de mutantes, confiere a la célula hospedadora la capacidad de crecer sobre xilosa como fuente de carbono, preferentemente como única fuente de carbono, y preferentemente en condiciones anaerobias. Cuando se usa XI como gen para convertir xilosa, 30 preferentemente la célula esencialmente no produce xilitol, por ejemplo, el xilitol producido está por debajo del límite de detección o, por ejemplo, es inferior a aproximadamente el 5, aproximadamente el 2, aproximadamente el 1, aproximadamente el 0,5, o aproximadamente el 0,3 % del carbono consumido en base molar.
La evolución adaptativa también se describe, por ejemplo, en Wisselink H.W. et al., Applied and Environmental Microbiology Aug. 2007, p. 4881-4891
35 En una realización de la evolución adaptativa se aplica un régimen que consiste en cultivo discontinuo repetido con ciclos repetidos de crecimiento consecutivo en diferentes medios, por ejemplo, tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914.
Transformación de levaduras y estabilidad genética
40 La ingeniería genética, es decir, la transformación de células de levadura con ADN recombinante, fue posible por primera vez en 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978]. La tecnología de ADN recombinante en levadura se ha establecido desde entonces. Están disponibles una multitud de diferentes construcciones de vector. Generalmente, estos vectores plasmídicos, denominados vectores lanzadera, contienen material genético derivado de vectores de E. coli que consiste en un origen de replicación y un marcador de selección (frecuentemente el gen de 13-lactamasa, 45 ampR), que les permite propagarse en E. coli antes de la transformación en células de levadura. Además, los vectores lanzadera contienen un marcador de selección para selección en levadura. Los marcadores pueden ser genes que codifican enzimas para la síntesis de un aminoácido o nucleótido particular, de manera que las células que llevan la deleción genómica correspondiente (o mutación) se complementan para auxotrofía o autotrofía. Alternativamente, estos vectores contienen marcadores de resistencia dominantes heterólogos, que proveen a las 50 células de levadura recombinantes (es decir, las células que han incorporado el ADN y expresan el gen marcador) resistencia hacia ciertos antibióticos, como g418 (Geneticin), higromicina B o fleomicina. Además, estos vectores pueden contener una secuencia de sitios de restricción (combinados) (sitio de clonación múltiple o MCS) que permitirá clonar ADN foráneo en estos sitios, aunque también existen métodos alternativos.
Tradicionalmente, pueden distinguirse cuatro tipos de vectores lanzadera por la ausencia o presencia de elementos 55 genéticos adicionales:
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• Plásmidos integrativos (YIp) que se integran por recombinación homologa dentro del genoma del hospedador en el locus del gen marcador u otro gen, cuando éste se abre por restricción y se usa el ADN linealizado para la transformación de las células de levadura. Esto generalmente resulta en presencia de una copia del ADN foráneo insertado en este sitio particular en el genoma.
• Plásmidos episómicos (YEp) que llevan parte de la secuencia de ADN del plásmido 2 p necesaria para la replicación autónoma en células de levadura. Se propagan múltiples copias del plásmido transformado en la célula de levadura y se mantienen como episomas.
• Plásmidos de replicación autónoma (YRp) que llevan un origen de replicación para levaduras (ARS, secuencia replicada autónomamente) que permite que los plásmidos transformados se propaguen varios cientos de veces.
• Plásmidos CEN (YCp) que llevan, además de una secuencia ARS, una secuencia centromérica (derivada de uno de los cromosomas nucleares) que normalmente garantiza la segregación mitótica estable y normalmente reduce el número de copias de plásmido autoreplicado a solo una.
Estos plásmidos se introducen en las células de levadura por transformación. La transformación de células de levadura puede lograrse por varias técnicas diferentes, tales como permeabilización de las células con acetato de litio (Ito et al., 1983) y métodos de electroporación.
En la aplicación comercial de microorganismos recombinantes, la inestabilidad del plásmido es el problema más importante. La inestabilidad es la tendencia de las células transformadas a perder sus propiedades modificadas por ingeniería debido a cambios o a perdida de plásmidos. Este problema se trata en detalle por Zhang et al (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, N.° 4, pp. 401-435, 1996). Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva (Sherman, F.
http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html y referencias en la misma).
El ADN heterólogo normalmente se introduce en el organismo en forma de plásmidos extracromosómicos (YEp, YCp y YRp). Desafortunadamente, se ha encontrado, tanto con bacterias como con levaduras, que no pueden ser retenidas las nuevas características, especialmente si la presión de selección no se aplica continuamente. Esto es debido a la inestabilidad segregacional del plásmido híbrido cuando las células recombinantes crecen durante un largo periodo de tiempo. Esto conduce a heterogeneidad de la población y variabilidad clonal, y eventualmente a una población celular en la que la mayoría de las células han perdido las propiedades que se introdujeron por la transformación. Si se usan vectores con marcadores auxotróficos, el cultivo en medios ricos frecuentemente conduce a una perdida rápida del vector, debido a que el vector solo se retiene en medio mínimo. La alternativa, el uso de marcadores de resistencia a antibióticos dominantes, frecuentemente no es compatible con los procesos de producción. El uso de antibióticos puede ser no deseable desde el punto de vista del registro (la posibilidad de que cantidades traza del antibiótico terminen en el producto final) o por motivos económicos (costes del uso de antibióticos a escala industrial).
La pérdida de vectores conduce a problemas en situaciones de producción a gran escala. Existen métodos alternativos para la introducción de aDn para levaduras, tales como el uso de plásmidos integrativos (YIp). El ADN se integra en el genoma hospedador mediante recombinación, produciendo alta estabilidad (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9(1988) 173 -192). Los presentes inventores han encontrado que es una buena alternativa un método de integración que usa los transposones del hospedador.
Transposones
Según la invención, se integran dos a quince genes de xilosa isomerasa o genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa en el genoma de la célula de azúcares mixtos. En una realización, la introducción inicial (es decir, antes de la evolución adaptativa) de múltiples copias, puede ejecutarse de cualquier modo conocido en la técnica que conduzca a la introducción de los genes. En una realización, esto puede llevarse a cabo usando un vector con partes homólogas a secuencias repetitivas (transposones), de la célula hospedadora. Cuando la célula hospedadora es una célula de levadura, secuencias repetidas adecuadas son las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencia delta.
Los elementos Ty se clasifican en dos subfamilias bastante similares denominadas Ty1 y Ty2. Estos elementos son de aproximadamente 6 kilobases (kb) de longitud y están unidos mediante repeticiones terminales largas (LTR), secuencias de aproximadamente 335 pares de bases (Boeke JD et al., The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, Apr. 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, N.° 4). En la cepa totalmente secuenciada de S. cerevisiae, S288c, los transposones más abundantes son Ty1 (31 copias) y Ty2 (13 copias) (Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12): e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Estos transposones consisten en dos marcos de lectura abiertos solapados (ORF), cada uno de los cuales codifica varias proteínas. Las regiones codificantes están flanqueadas por las LTR casi idénticas anteriormente mencionadas. Otros elementos Ty, pero menos abundantes y más distintos, en S. cerevisiae comprenden Ty3, Ty4 y Ty5. Para cada
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familia de elementos Ty de longitud completa hay un orden de magnitud más de elementos LTR solos dispersos a lo largo del genoma. Se cree que éstos surgen de la recombinación LTR-LTR de elementos de longitud completa, con una escisión por formación de bucle de las regiones internas que codifican proteínas.
Se ha usado el mecanismo de retrotransposición del retrotransposón Ty para integrar múltiples copias a lo largo del genoma (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). Las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencias delta, también son buenas dianas para la integración por recombinación homologa ya que existen en aproximadamente 150-200 copias que están o bien asociadas a Ty o a sitios solos (Boeke, 1989; Kingsman and Kingsman, 1988). (Parekh R.N. (1996). An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 16-21). Por adaptación evolutiva, puede cambiar el número de copias.
La célula hospedadora
La célula hospedadora puede ser cualquier célula hospedadora adecuada para la producción de un producto útil. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula adecuada, tal como una célula procariota, tal como una bacteria, o una célula eucariota. Normalmente, la célula será una célula eucariota, por ejemplo, una levadura o un hongo filamentoso.
Las levaduras se definen en la presente como microorganismos eucariotas e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, en: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.
Las levaduras pueden crecer ya sea por gemación de un tallo unicelular o pueden crecer por fisión del organismo. Una levadura preferida como célula de azúcares mixtos puede pertenecer a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces o Yarrowia. Preferentemente, la levadura es una capaz de fermentación anaerobia, más preferentemente una capaz de fermentación alcohólica anaerobia.
Los hongos filamentosos se definen en el presente documento como microorganismos eucariotas que incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos que son adecuados para su uso como una célula de la presente invención son morfológicamente, fisiológicamente y genéticamente distintos de las levaduras. Pueden usarse ventajosamente células de hongos filamentosos debido a que la mayoría de los hongos no requieren condiciones estériles para la propagación y son insensibles a las infecciones por bacteriófagos. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos es por elongación de hifas y el metabolismo del carbono de la mayoría de los hongos filamentosos es aerobio estricto. Hongos filamentosos preferidos como célula hospedadora pueden pertenecer al género Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium o Penicillium. Más preferentemente, la célula de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, un Penicillium chrysogenum, o Rhizopus oryzae.
En una realización, la célula hospedadora puede ser levadura.
Preferentemente, el hospedadora es un hospedador industrial, más preferentemente una levadura industrial. Un hospedador industrial y una célula de levadura industrial pueden definirse como sigue. Los entornos vivos de las células de levadura en procesos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de rendir bien bajo múltiples condiciones medioambientales que pueden variar durante el proceso. Tales variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen un posible impacto sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno deben permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levaduras industriales son generalmente más robustas a estos cambios en las condiciones medioambientales que pueden producirse en las aplicaciones en las que se usan, tales como en la industria de la panadería, industria cervecera, viticultura y la industria del etanol. Ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).
En una realización, el hospedador es tolerante a inhibidor. Pueden seleccionarse células hospedadoras tolerantes a inhibidor mediante el cribado de cepas para crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en el que se seleccionó una cepa tolerante a inhibidor de S. cerevisiae ATCC 26602.
Genes araA, araB y araD
Una célula de azúcares mixtos es capaz de usar arabinosa. Una célula de azúcares mixtos es, por tanto, capaz de convertir L-arabinosa y L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación deseado, por ejemplo, uno de aquellos mencionados en el presente documento.
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Pueden producirse organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L- arabinosa modificando una célula por introducción de los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribulocinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) a partir de una fuente adecuada. Tales genes pueden introducirse en una célula de azúcares mixtos con el objetivo de que sea capaz de usar arabinosa. Un enfoque tal se da se describe en el documento WO2003/095627. Pueden usarse genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantanum y se desvelan en el documento WO2008/041840. Pueden usarse el gen araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escherichia coli y se desvelan en el documento EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de al menos uno del género Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y/o Gramella forsetii, como se desvela en el documento WO 2009011591.
Genes de PPP
Una célula de azúcares mixtos puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato. En particular, la(s) modificación (modificaciones) genética(s) puede(n) conducir a un aumento del flujo a través de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato. Una modificación genética que produce un aumento del flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato se entiende en el presente documento que significa una modificación que aumenta el flujo al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la modificación genética que causa el aumento de flujo. El flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato puede medirse cultivando el hospedador modificado sobre xilosa como única fuente de carbono, determinando la tasa de consumo específico de xilosa y restando la tasa específica de producción de xilitol de la tasa específica de consumo de xilosa, si es que se produce xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato es proporcional a la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono, preferentemente con la tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como única fuente de carbono. Hay una relación lineal entre la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono (|Jmáx) y el flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato. La tasa específica de consumo de xilosa (Qs) es igual a la tasa de crecimiento (j) dividida entre el rendimiento de biomasa en azúcar (Yxs) debido a que el rendimiento de biomasa en azúcar es constante (en un grupo de condiciones dadas: anaerobias, medio de crecimiento, pH, antecedentes genéticos de la cepa, etc.; es decir, Qs = j/ Yxs). Por lo tanto, el aumento de flujo de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato puede deducirse a partir del aumento de la tasa de crecimiento máxima en estas condiciones a pesar del transporte (la captación es limitante).
Pueden introducirse una o más modificaciones genéticas que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato en la célula hospedadora de diversas formas. Éstas incluyen, por ejemplo, conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa cinasa y/o una o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato y/o un nivel en estado estacionario reducido de la actividad inespecífica de aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario pueden estar afectados por la selección de mutantes (espontáneos o inducidos por productos químicos o radiación) y/o por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, por expresión en exceso o inactivación, respectivamente, de genes que codifican para las enzimas o factores que regulan estos genes.
En una célula hospedadora preferida, la modificación genética comprende la expresión en exceso de al menos una enzima de la (parte no oxidativa) de la vía de la pentosa fosfato. Preferentemente, la enzima se selecciona del grupo que consiste en las enzimas que codifican ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Pueden expresarse en exceso diversas combinaciones de las enzimas de la (parte no oxidativa) vía de la pentosa fosfato. Por ejemplo, las enzimas que se expresan en exceso pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa- 5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa. En una realización de la invención, cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa se expresan en exceso en la célula hospedadora. Se prefiere más una célula hospedadora en la que la modificación genética comprenda al menos la expresión en exceso de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa de modo que una célula hospedadora ya sea capaz de crecimiento anaerobio sobre xilosa. En realidad, en algunas condiciones, las células hospedadoras que expresan en exceso solo la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaerobio sobre xilosa que las células hospedadoras que expresan en exceso las cuatro enzimas, es decir, la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Además, se prefieren las células hospedadoras que expresan en exceso ambas enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa con respecto a las células hospedadoras que expresan en exceso solo la isomerasa o solo la epimerasa ya que la expresión en exceso de solo una de estas enzimas puede producir desequilibrios metabólicos.
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La enzima "ribulosa 5-fosfato epimerasa" (EC 5.1.3.1) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la epimerización de D-xilulosa 5-fosfato a D-ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como fosforribulosa epimerasa; eritrosa-4-fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3-epimerasa; xilulosa fosfato 3- epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-P 3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; pentosa-5-fosfato 3-epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa también puede definirse además por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5-fosfato epimerasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica ribulosa 5-fosfato epimerasa se designa en el presente documento RPE1.
La enzima "ribulosa 5-fosfato isomerasa" (EC 5.3.1.6) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-ribosa 5-fosfato en D-ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como fosfopentosisomerasa; fosforriboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5-fosforribosa isomerasa; D- ribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa; o D-ribosa-5-fosfato aldosa-cetosa-isomerasa. Una ribulosa 5-fosfato isomerasa también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una ribulosa 5- fosfato isomerasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5- fosfato isomerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica ribulosa 5-fosfato isomerasa se designa en el presente documento RKI1.
La enzima "transcetolasa" (EC 2.2.1.1) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la
reacción: D-ribosa 5-fosfato + D-xilulosa 5-fosfato <-> sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato y
viceversa. La enzima también se conoce como glicolaldehídotransferasa o sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído- 3-fosfato glicolaldehídotransferasa. Una transcetolasa también puede definirse por su aminoácido. Asimismo, una transcetolasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una transcetolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica transcetolasa se designa en el presente documento TKL1.
La enzima "transaldolasa" (EC 2.2.1.2) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato <-> D-eritrosa 4-fosfato + D-fructosa 6-fosfato y viceversa. La enzima también se conoce como dihidroxiacetonatransferasa; dihidroxiacetona sintasa; formaldehído transcetolasa; o sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3-fosfato glicerina transferasa. Una transaldolasa también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una transaldolasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una
secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una transaldolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica
transcetolasa se designa en el presente documento TAL1.
Genes de xilosa isomerasa o xilosa reductasa
Según la invención, se introducen dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa y/o uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa en el genoma de la célula hospedadora. La presencia de estos dos a quince elementos genéticos confiere a la célula la capacidad de convertir xilosa por isomerización o reducción.
En una realización, las dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa se introducen en el genoma de la célula hospedadora.
Una "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa y/o viceversa. La enzima también se conoce como una D-xilosa cetoisomerasa. Una xilosa isomerasa en el presente documento también puede ser capaz de catalizar la conversión de D-glucosa y D-fructosa (y, por consiguiente, puede, por tanto, denominarse una glucosa isomerasa). Una xilosa isomerasa en el presente documento puede requerir un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso o cobalto como cofactor.
Por consiguiente, una célula de azúcares mixtos tal es capaz de isomerizar xilosa en xilulosa. La capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa se confiere a la célula hospedadora por la transformación de la célula hospedadora con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa definida. Una célula de azúcares mixtos isomeriza xilosa en xilulosa por la isomerización directa de xilosa en xilulosa.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa puede definirse en el presente documento como la cantidad de enzima que produce 1 nmol de xilulosa por minuto, en condiciones como se describieron en Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78).
El gen de xilosa isomerasa puede tener diversos orígenes, tales como, por ejemplo, de Pyromyces sp. como se desvela en el documento WO2006/009434. Otros orígenes adecuados son Bacteroides, en particular Bacteroides uniformis como se describe en el documento PCT/EP2009/52623, Bacillus, en particular Bacillus stearothermophilus como se describe en el documento PCT/EP2009/052625.
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En otra realización, las dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se introducen en el genoma de la célula hospedadora. En esta realización, la conversión de xilosa se realiza en una conversión de dos etapas de xilosa en xilulosa a través de un producto intermedio de xilitol como se cataliza por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente. En una realización de la misma, pueden expresarse en exceso xilosa reductasa (XR), xilitol deshidrogenasa (XDH) y xilocinasa (XK), y opcionalmente se regulan por incremento uno o más de genes que codifican enzimas productoras de NADPH y se regulan por incremento uno o más de los genes que codifican enzimas consumidoras de NADH, como se desvela en el documento WO 2004085627.
Gen XKS1
Una célula de azúcares mixtos puede comprender una o más modificaciones genéticas que aumentan la actividad específica de xilulosa cinasa. Preferentemente, la modificación o modificaciones genéticas producen la expresión en exceso de una xilulosa cinasa, por ejemplo mediante expresión en exceso de una secuencia de nucleótidos que codifica una xilulosa cinasa. El gen que codifica la xilulosa cinasa puede ser endógeno a la célula hospedadora o puede ser una xilulosa cinasa que es heteróloga a la célula hospedadora. Una secuencia de nucleótidos usada para la expresión en exceso de xilulosa cinasa en la célula hospedadora es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de xilulosa cinasa.
La enzima "xilulosa cinasa" (EC 2.7.1.17) se define en el presente documento como una enzima que cataliza la reacción ATP + D-xilulosa = ADP + D-xilulosa 5-fosfato. La enzima también se conoce como una xilulocinasa fosforilante, D-xilulocinasa o ATP :D-xilulosa 5-fosfotransferasa. Una xilulosa cinasa de la invención también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una xilulosa cinasa puede definirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una xilulosa cinasa.
En una célula de azúcares mixtos, puede combinarse una modificación o modificaciones genéticas que aumenta(n) la actividad específica de xilulosa cinasa con cualquiera de las modificaciones que aumentan el flujo de la vía de la pentosa fosfato como se describió anteriormente. Esto no es, sin embargo, esencial.
Así, una célula hospedadora puede comprender solo una modificación o modificaciones genéticas que aumentan la actividad específica de xilulosa cinasa. Los diversos medios disponibles en la materia para conseguir y analizar la expresión en exceso de una xilulosa cinasa en las células hospedadoras de la invención son los mismos que se describieron anteriormente para enzimas de la vía de la pentosa fosfato. Preferentemente, en las células hospedadoras de la invención, una xilulosa cinasa que va a expresarse en exceso se expresa en exceso al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica, excepto por la(s) modificación (modificaciones) genética(s) que causan la expresión en exceso. Debe entenderse que estos niveles de expresión en exceso pueden aplicarse al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima, además de al nivel de estado estacionario del transcrito que codifica la enzima.
Deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3)
En una realización, donde XI se usa como gen para convertir xilosa, puede ser ventajoso reducir la actividad de aldosa reductasa. Una célula de azúcares mixtos puede, por tanto, comprender una o más modificaciones genéticas que reduzcan la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora. Preferentemente, la actividad inespecífica de aldosa reductasa se reduce en la célula hospedadora mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o inactivan un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, la(s) modificación (modificaciones) genética(s) reducen o inactiva la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica en la célula hospedadora (denominada en el presente documento deleción de GRE3). Las células de azúcares mixtos pueden comprender múltiples copias de genes que codifican aldosas reductasas inespecíficas como resultado de di-, poli-o aneuploidía, y/o la célula hospedadora puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividad de aldosa reductasa que se diferencian en la secuencia de aminoácidos y que son cada una codificadas por un gen diferente. También en dichas casos se reduce o inactiva preferentemente la expresión de cada gen que codifica una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, el gen se inactiva mediante deleción de al menos parte del gen o mediante interrupción del gen, por lo que en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificante en la dirección 5' o 3' de la secuencia codificante, cuya deleción (parcial) o inactivación produce una reducción de la expresión de la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora.
Una secuencia de nucleótidos que codifica una aldosa reductasa cuya actividad va a reducirse en la célula hospedadora es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de aldosa reductasa.
Así, una célula hospedadora que comprende solo una modificación o modificaciones genéticas que reduzca(n) la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula hospedadora está especialmente incluida en la invención.
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La enzima "aldosa reductasa" (EC 1.1.1.21) se define en el presente documento como una enzima que es capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención, una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa inespecífica que sea nativa (endógena) a una célula hospedadora de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. Las aldosa reductasas inespecíficas catalizan la reacción:
aldosa + NAD(P)H + H+ ^ alditol + NAD(P)+
La enzima tiene una amplia especificidad y también se conoce como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+); alditol:NADP oxidorreductasa; alditol:NADP+ 1-oxidorreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.
Un ejemplo particular de una aldosa reductasa inespecífica tal que es endógena a S. cerevisiae y que está codificada por el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Así, una aldosa reductasa de la invención también puede definirse por su secuencia de aminoácidos. Asimismo, una aldosa reductasa puede definirse por la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, además de por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una aldosa reductasa.
Identidad de secuencia
Se dice que secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homólogas cuando presentan un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homologas están estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas, se indica por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque se cuestiona, la indicación de "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología" se usan frecuentemente indistintamente.
Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan indistintamente en el presente documento. Con el fin de la presente invención, se define aquí que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias completas para fines de comparación óptima. Con el fin de optimizar el alineamiento entre las dos secuencia, pueden introducirse huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Tal alineamiento se lleva a cabo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Alternativamente, el alineamiento puede llevarse a cabo a lo largo de una longitud más corta, por ejemplo a lo largo de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias a lo largo de la región alineada informada.
Puede llevarse a cabo una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. El experto conocerá el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos, además de secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Con el fin de la presente invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276-277,
http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos, se usó EDNAFULL. Pueden especificarse otras matrices. Los parámetros óptimos usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalidad por abertura de hueco de 10 y una penalidad por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente si se usan diferentes algoritmos.
Definición de homología global
La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total que incluye cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento incluyendo los huecos. La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE y se etiqueta en la salida del programa como "IDENTITY".
Definición de identidad más larga
La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la
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longitud total del alineamiento después de la resta del número total de huecos en el alineamiento. La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se etiqueta en la salida del programa como "identidad más larga". Para los fines de la invención, el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácidos o nucleótidos) se calcula según la definición de "identidad más larga" como puede llevarse a cabo usando el programa NEEDLE.
Las secuencias de proteínas usadas en la presente invención pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda por comparación con bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas BLAST. El software para realizar análisis por BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov). BLASTP se usa para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST usa como parámetros por defecto:
- Coste por hueco abierto: por defecto = 5 para nucleótidos/ 11 para proteínas
- Coste por extensión de hueco: por defecto = 2 para nucleótidos/ 1 para proteínas
- Penalización por no coincidencia de nucleótido: por defecto = -3
- Recompensa por coincidencia de nucleótido: por defecto = 1
- Valor esperado: por defecto = 10
- Tamaño de palabra: por defecto = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para proteínas
Además, el grado de identidad local (homología) entre la consulta de secuencia de aminoácidos o la consulta de secuencia de nucleótidos y las secuencias homologas recuperadas se determina mediante el programa BLAST. Sin embargo, solo se comparan aquellos segmentos de secuencia que dan una coincidencia por encima de un cierto umbral. Por consiguiente, el programa calcula la identidad solo para estos segmentos coincidentes. Por tanto, la identidad calculada de esta forma se denomina identidad local.
Producción de bioproductos
A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diversos organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de bioproducción de etanol han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productor de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, es decir, una alta capacidad de crecimiento anaerobio con tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y, por supuesto, su alta capacidad fermentativa alcohólica. Las especies de levadura preferidas como células hospedadoras incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K. fragilis.
Una célula de azúcares mixtos puede ser una célula adecuada para la producción de etanol. Una célula de azúcares mixtos puede, sin embargo, ser adecuada para la producción de productos de fermentación distintos de etanol
Tales productos de fermentación no etanólicos incluyen en principio cualquier producto químico a granel o refinado que pueda ser producido mediante un microorganismo eucariota tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Una célula de azúcares mixtos que puede usarse para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedadora que contiene una modificación genética que produjo una actividad de alcohol deshidrogenasa reducida.
En una realización, la célula de azúcares mixtos puede usarse en un proceso en el que los azúcares que se originan a partir de lignocelulosa se convierten en etanol.
Lignocelulosa
La lignocelulosa, que puede considerarse como una materia prima potencialmente renovable, generalmente comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algo de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, que incluyen tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas, se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.
Además, pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicas de tejidos vegetales distintos de madera (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede ser pectinas).
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Pretratamiento
Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico puede ser pretratado. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, ruptura mecánica, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos o más cualquiera de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con calor, por ejemplo entre 150-220 °C durante 1 a 30 minutos.
Hidrólisis enzimática
El material pretratado comúnmente se somete a hidrólisis enzimática para liberar los azúcares que pueden ser fermentados según la invención. Esto se puede llevar a cabo con métodos convencionales, por ejemplo poniendo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa(s), endoglucanasa(s), beta-glucosidasa(s) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o a temperaturas más altas, a un tiempo de reacción para liberar cantidades suficientes de azúcar(es). El resultado de la hidrólisis enzimática es un producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, designados en el presente documento como la composición de azúcares.
Fermentación
El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio. Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto de donante de electrones como de aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH producido en la glicolisis y formación de biomasa no puede ser oxidado mediante la fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno, regenerando así NAD+.
Así, en un proceso de fermentación anaerobio preferido se usa piruvato como aceptor de electrones (y de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina.
El proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Así, para la mayoría de las células hospedadoras de levadura o fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es inferior a aproximadamente 42 °C, preferentemente inferior a aproximadamente 38 °C. Para células hospedadoras de levadura o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es inferior a aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28 °C y a una temperatura que es superior a aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 25 °C.
El rendimiento de etanol sobre xilosa y/o glucosa en el proceso es preferentemente de al menos aproximadamente el 50, aproximadamente el 60, aproximadamente el 70, aproximadamente el 80, aproximadamente el 90, aproximadamente el 95 o aproximadamente el 98 %. El rendimiento de etanol se define en el presente documento como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.
La invención también se refiere a un proceso de producción de un producto de fermentación.
El proceso de fermentación según la presente invención puede realizarse en condiciones aerobias y anaerobias. En una realización, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o de oxígeno limitado.
Un proceso de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, y en el que las moléculas orgánicas sirven de donante de electrones como de aceptores de electrones.
Un proceso de fermentación de oxígeno limitado es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, además de las propiedades de mezcla/transferencia de masa reales del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso en condiciones de oxígeno limitado, la tasa de consumo de oxígeno es de al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/l/h. Un proceso de la invención puede comprender la recuperación del producto de fermentación.
En un proceso preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferentemente simultáneamente, en cuyo caso preferentemente se usa una célula que no es sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diaúxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación
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comprenderá además el componente apropiado requerido para el crecimiento de la célula. Composiciones de medio de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras son muy conocidas en la técnica.
Los procesos de fermentación pueden llevarse a cabo en modo discontinuo, de lotes alimentados o continuo. También puede aplicarse un proceso de hidrólisis y fermentación (SHF) separado o un proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneo. También es posible una combinación de estos modos de procesos de fermentación para una productividad óptima. Estos procesos se describen más adelante en más detalle.
Modo SSF
Para el modo de sacarificación y fermentación simultánea (SSF), el tiempo de reacción para la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo para lograr un rendimiento deseado, es decir, el rendimiento de conversión de celulosa a glucosa. Tal rendimiento es preferentemente tan alto como sea posible, preferentemente 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, incluso 99,5 % o más o 99,9 % o más.
Según la invención, se logran concentraciones de azúcar muy altas en el modo SHF y concentraciones de producto muy altas (por ejemplo, etanol) en el modo SSF. En la operación de SHF, la concentración de glucosa es 25 g/l o más, 30 g/l o más, 35 g/l o más, 40 g/l o más, 45 g/l o más, 50 g/l o más, 55 g/l o más, 60 g/l o más, 65 g/l o más, 70 g/l o más, 75 g/l o más, 80 g/l o más, 85 g/l o más, 90 g/l o más, 95 g/l o más, 100 g/l o más, 110 g/l o más, 120 g/l o más o puede ser, por ejemplo, 25 g/l-250 g/l, 30 g/l-200 g/l, 40 g/l-200 g/l, 50 g/l-200 g/l, 60 g/l-200 g/l, 70 g/l-200 g/l, 80 g/l-200 g/l, 90 g/l, 80 g/l-200 g/l.
Concentración de producto en modo SSF
En la operación de SSF, la concentración de producto (g/l) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible debido a que los azúcares se convierten en producto en SSF, y las concentraciones de productos pueden relacionarse con la concentración de glucosa subyacente por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máximo en g de producto por gramo de glucosa)
El rendimiento máximo teórico (Yps máximo en g de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación puede derivar de textos de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glucosa (180 gramos) da según la vía normal de fermentación por glicolisis en levadura 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 g de etanol. El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es, por tanto, 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.
Para butanol (MW 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento teórico máximo es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así, el Yps máximo para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glucosa.
Para el ácido láctico, el rendimiento de fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glucosa. Según esta estequiometria, el Yps máximo = 1 g de ácido láctico/g de glucosa.
Para otros productos de fermentación puede hacerse un cálculo similar.
Modo SSF

En la operación SSF, la concentración de producto es 25 g * Yps g/l/l o más, 30 * Yps g/l o más, 35 g * Yps g/l o

más, 40 * Yps g/l o más, 45 * Yps g/l o más, 50 * Yps g/l o más, 55 * Yps g/l o más, 60 * Yps g/l o más, 65 * Yps g/l o

más, 70 * Yps g/l o más, 75 * Yps g/l o más, 80 * Yps g/l o más, 85 * Yps g/l o más, 90 * Yps g/l o más, 95 * Yps g/l o

más, 100 * Yps g/l o más, 110 * Yps g/l o más, 120 g/l * Yps o más o pude ser, por ejemplo, 25 * Yps g/l-250 *
Yps g/l, 30 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 40 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 50 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 60 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 70 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l, 90 * Yps g/l, 80 * Yps g/l-200 * Yps g/l
Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, método que comprende:
a. degradar lignocelulosa usando un método como se describe en el presente documento; y
b. fermentar el material resultante, preparando así un producto de fermentación.
Producto de fermentación
El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una realización, es un producto seleccionado del grupo que consiste en etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos para animales, especialidades químicas, materias primas químicas, plásticos, disolventes,
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combustibles, que incluyen biocombustibles y biogás o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa. Por ejemplo, los productos de fermentación pueden ser producidos por células según la invención, siguiendo métodos de preparación de células del estado de la técnica y procesos de fermentación, cuyos ejemplos, sin embargo, no deben interpretarse como limitantes en el presente documento. Puede producirse n- butanol mediante células como se describe en los documentos WO2008121701 o WO2008086124; ácido láctico como se describe en los documentos US2011053231 o US2010137551; ácido 3-hidroxipropiónico como se describe en el documento WO2010010291; ácido acrílico como se describe en el documento WO2009153047; ácido acético como se describe en..., ácido succínico como se describe en..., las células del mutante deficiente en fumarasa que fermentan glucosa acumularon ácido fumárico extracelular (***Nota todavía por añadir.._
Recuperación del producto de fermentación
Para la recuperación del producto de fermentación se usan tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes de recuperación de etanol de mezclas acuosas comúnmente usan técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, todavía puede usarse una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas similares). A continuación, las fracciones que contienen las concentraciones de etanol más altas pueden pasarse a través de un adsorbente para eliminar la mayoría, sino toda el agua remanente del etanol.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención:
EJEMPLOS
A menos que se indique lo contrario, los métodos descritos aquí son técnicas bioquímicas convencionales. Ejemplos de textos adecuados de metodología general incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Composición del medio
Experimentos de crecimiento: Se cultivan cepas de Saccharomyces cerevisiae en un medio que tiene la siguiente composición: 0,67 % (p/v) de base nitrogenada o medio sintético para levaduras (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) y glucosa, arabinosa, galactosa o xilosa, o una combinación de estos sustratos, en concentraciones variables (véanse los ejemplos para detalles específicos; concentraciones en % en peso con respecto al volumen (p/v)). Para las placas con agar, el medio se complementa con 2 % (p/v) de agar bacteriológico.
Producción de etanol
Se prepararon precultivos inoculando 25 ml de medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) complementado con 2 % de glucosa en un matraz oscilante 100 ml, con un cultivo madre congelado o una colonia individual de una placa con agar. Después de la incubación a 30 °C en un agitador orbital (280 rpm) durante aproximadamente 24 horas, se recogió este cultivo y se usó para la determinación de experimentos de desprendimiento de CO2 y de producción de etanol.
Se realizaron cultivos para la producción de etanol a 30 °C en 100 ml de medio modelo sintético (medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992), con 5 % de glucosa, 5 % de xilosa, 3,5 % de arabinosa y 1 % de galactosa), en BAM (monitor de la actividad biológica, Los Países Bajos). El pH del medio se ajustó a 4,2 con NaOH/H2SO4 2 M antes de la esterilización. Se complementó el medio sintético para el cultivo anaerobio con 0,01 g l-1 de ergosterol y 0,42 g l-1 de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 41:23-36, 1953; y Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 43:271-281, 1954). El medio se inoculó a una DO6OO inicial de aproximadamente 2. Los cultivos se agitaron con un agitador magnético. Las condiciones anaerobias se desarrollaron rápidamente durante la fermentación, ya que los cultivos no fueron aireados. Se monitorizó constantemente la producción de CO2. La conversión de azúcar y la formación de productos (etanol, glicerol) por RMN. El crecimiento se monitorizó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm en un espectrofotómetro LKB Ultrospec K.
Transformación de S. cerevisiae
La transformación de S. cerevisiae se hizo como se describe por Gietz y Woods (2002; Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96).
PCR de colonias
Se recogió una cepa aislada de colonias individuales con un palillo de plástico y se resuspendió en 50 pl de agua MilliQ. La muestra se incubó durante 10 minutos a 99 °C. Se usaron 5 pl de la muestra incubada como molde para la reacción de PCR, usando ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) según las instrucciones proporcionadas por el proveedor.
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Condiciones de la reacción de PCR:
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3' 98 °C
etapa 2
10" 98 °C
etapa 3
15" 58 °C Repetir la etapa 2 a 4 durante 30 ciclos
etapa 4
30" 72 °C
etapa 5
4' 72 °C
etapa 6
30" 20 °C
Aislamiento de ADN cromosómico
Se cultivaron células de levadura en medio YEP que contenía 2 % de glucosa en un agitador rotatorio (durante la noche, a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital). Se transfirieron 1,5 ml de estos cultivos a un tubo Eppendorf y se centrifugaron durante 1 minuto a velocidad máxima. El sobrenadante se decantó y el sedimento se resuspendió en 200 |jl de YCPS (0,1 % de SB3-14 (Sigma Aldrich, Los Países Bajos) en Tris.HCl 10 mM a pH 7,5; EDtA 1 mM) y
1 jl de RNasa (20 mg/ml de RNasa A de páncreas bovino, Sigma, Los Países Bajos). La suspensión de células se incubó durante 10 minutos a 65 °C. La suspensión se centrifugó en una centrífuga Eppendorf durante 1 minuto a 7000 rpm. El sobrenadante se desechó. El sedimento se disolvió cuidadosamente en 200 jl de CLS (EDTA 25 mM,
2 % de SDS) y 1 jl de RNasa A. Después de la incubación a 65 °C durante 10 minutos, la suspensión se enfrió sobre hielo. Después de la adición de 70 jl de PPS (acetato de amonio 10 M), las disoluciones se mezclaron minuciosamente en una mezcladora con vórtex. Después de la centrifugación (5 minutos en centrífuga Eppendorf a velocidad máxima), el sobrenadante se mezcló con 200 jl de isopropanol helado. El ADN precipitó fácilmente y se sedimentó por centrifugación (5 minutos, velocidad máxima). El sedimento se lavó con 400 jl de 70 % de etanol helado. El sedimento se secó a temperatura ambiente y se disolvió en 50 jl de TE (Tris.HCl 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM).
Transformación de células de levadura por electroporación
Se cultivaron células de levadura inoculando 25 ml de medio YEP que contenía 2 % de glucosa con una colonia de levadura individual. El matraz se incubó durante la noche a 30 °C.
Se determinó la densidad óptica a 600 nm y se transfirió la cantidad necesaria para obtener una densidad óptica de 0,2 a 100 ml de medio YEP con 2 % de glucosa. Las células se cultivaron durante 4 a 5 horas, con el fin de alcanzar una densidad óptica de aproximadamente 1,2 a 1,3, que se corresponde con 2 a 3 generaciones. Se recogieron las células por centrifugación y se suspendieron en 28 ml de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). Se añadieron
3 ml de una disolución 1 M de LiAC (establecida a pH 7,5 con HAc concentrado). Las células se agitaron suavemente en una estufa de incubación rotatoria (150 rpm, 30 °C) durante 45 minutos. Después de la adición de 500 jl de una disolución 1 M de DTT (ditiotreitol), las células se incubaron una vez más bajo estas condiciones, durante 15 minutos. El volumen se enrasó a 100 ml con agua MilliQ helada estéril. Las células se recogieron por centrifugación.
Se desechó el sobrenadante y las células sedimentadas se lavaron con 50 ml de agua MilliQ helada estéril, y se recogieron por centrifugación. Se hizo un tratamiento de lavado posterior con 30 ml de una disolución 1 M helada de sorbitol. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el sedimento de células se resuspendió en 4 ml de una disolución 1 M helada de sorbitol. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el sedimento de células se resuspendió en 300 jl de una disolución 1 M helada de sorbitol.
Para cada transformación, se transfieren 40 jl de la suspensión de células a tubos Eppendorf helados. Se añaden el ADN transformante y 5 jg de ADN de esperma de salmón (como ADN vehículo), juntos en un volumen máximo de 20 jl. El ADN debe disolverse en TE. Se golpea cuidadosamente el tubo Eppendorf con el fin de mezclar el contenido suavemente. Transferir el contenido a una cubeta de electroporación previamente enfriada (sobre hielo) con un hueco de 0,2 cm. Aplicar un pulso (usando, por ejemplo, un dispositivo de electroporación BioRad) a 1,5 kV, 200 Ohm y 25 jF. La duración del pulso debería ser de aproximadamente 5 ms.
Transferir las células inmediatamente a 200 jl de sorbitol 1 M. Añadir 4 ml de YEP con 2 % de glucosa e incubar a 30 °C durante 1 hora. Recoger las células por centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 4 ml de sorbitol 1 M. Recoger las células por centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 300 jl de sorbitol 1 M. Diluir las células según convenga y extenderlas sobre placas selectivas o usarlas en medios selectivos.
Prueba de aplicación de la levadura sobre hidrolizados reales
Se hidrolizaron enzimáticamente muestras pretratadas con ácido diluido de hojas y tallos de maíz y paja de trigo usando una preparación de celulasa de amplio espectro experimental a 60 °C durante 3 días (72 horas). El pH al comienzo de la hidrólisis fue 5,0. El contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue 10 % p/p.
5 Las condiciones para la hidrólisis de las muestras de fibra de maíz pretratadas fueron esencialmente las mismas, excepto que la temperatura de hidrólisis fue 50 °C y el contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue del 13,8 %.
Después de la hidrólisis (72 h), se dejó que las muestras se enfriaran a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 5,5 usando 10 % de NaOH. Posteriormente, se añadió 1 mililitro de 200 gramos por litro de (NH^SO4 y 1 mililitro de 100 10 gramos por litro de KH2PO4. Finalmente, se añadieron muestras de levadura correspondientes a un contenido de materia seca de levadura de 1 gramo de levadura por kilogramo de hidrolizado. Se siguió el desprendimiento de CO2 con el tiempo usando el AFM (monitor de fermentación de alcohol; HaloteC Instruments BV, Veenendaal, Los Países Bajos). Los experimentos se realizaron al menos por triplicado, durante 72 horas a 33 °C. Uno de estos se muestrea a intervalos regulares con el fin de ser capaz de analizar la formación de etanol y concentraciones de azúcar 15 residual. Estos datos pueden usarse para calcular los rendimientos de fermentación. No se muestrea el caldo de los otros dos experimentos. En su lugar, al final de la fermentación, el caldo se destila usando una unidad de destilación Buchi K-355 al 45% de vapor durante 15 minutos. El alcohol producido se determina usando un medidor de densidad Anton Paar DMA 5000 (Anton Paar Benelux BVBA, Dongen, Los Países Bajos).
PCR cuantitativa
20 Se realizaron reacciones de PCR cuantitativa para determinar el número de copias de los genes que estaban presentes en el genoma, especialmente en el caso de los genes de xilosa isomerasa. Para este fin, se usó el sistema Bio-Rad iCycler iQ de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se usó iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los experimentos se configuraron como se sugería en el manual del proveedor. Como cebadores para la detección del gen de xilosa isomerasa se usaron los cebadores de SEQ ID NO: 23 y 25 SEQ ID NO: 24.
Las condiciones de PCR fueron del siguiente modo: incubación de 3 minutos a 95 °C 40 ciclos: 10 segundos a 95 °C 45 segundos a 58 °C 30 45 segundos a 72 °C
incubación de 1 minuto a 95 °C incubación de 1 minuto a 65 °C
La curva de fusión se determina empezando a medir la fluorescencia a 65 °C durante 10 segundos. La temperatura se aumenta cada 10 segundos con 0,5 °C, hasta que se alcanza una temperatura de 95 °C. A partir de las lecturas, 35 puede calcularse y/o estimarse el número de copias del gen de interés. El método tiene sus limitaciones con respecto a una determinación precisa del número de copias por encima de un cierto umbral, como será apreciado por aquellos expertos en la materia.
Ejemplo 1
Construcción de la cepa BIE104A2P1
40 1. 1 Construcción de un vector de expresión que contiene los genes para la vía de arabinosa
Se construyó el plásmido pPWT018, como se expone en la Figura 2, del siguiente modo: Se digirió el vector pPWT006 (Figura 1, que consiste en un locus SIT2 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cell Biology, vol. 6, N.° 6, 2185-2197) y los marcadores que permiten la selección de transformantes en el antibiótico G418 y la capacidad para cultivar en acetamida con las enzimas de restricción BsiWI y MluI. El marcador kanMX, que confiere 45 resistencia a G418, se aisló de p427TEF (Dualsystems Biotech) y un fragmento que contiene el marcador amdS se ha descrito en la bibliografía (Swinkels, B.W., Noordermeer, A.C.M. y Renniers, A.C.H.M (1995) The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant, bidirectional selection marker for yeast transformation. Yeast, volumen 11, número 1995A, página S579; y documento US 6051431). Se sintetizaron los genes que codifican arabinosa isomerasa (araA), L-ribulocinasa (araB) y L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) de Lactobacillus plantarum, como 50 se desvela en la solicitud de patente WO2008/041840, por BaseClear (Leiden, Los Países Bajos). Se sintetizó un fragmento grande que alojaba los tres genes de arabinosa mencionados anteriormente, bajo el control de (o unidos operativamente a) promotores fuertes de S. cerevisiae, es decir, el promotor TDH3 que controla la expresión del gen
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araA, el promotor ENO1 que controla el gen araB y el promotor PGI1 que controla el gen araD. Éste estaba rodeado por las enzimas de restricción únicas Acc65I y MluI. La clonación de este fragmento en pPWT006 digerido con MluI y BsiWI produjo el plásmido pPWT018 (Figura 2). La secuencia del plásmido pPWT018 expone en SEQ ID NO: 1.
1.2 Transformación de levadura
Se transformó CEN.PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) con el plásmido pPWT018, que había sido previamente linealizado con SfiI (New England Biolabs), según las instrucciones del proveedor. Se diseñó un sitio SfiI sintético en el flanco 5' del sitio SIT2 (véase la Figura 2). Se sembraron mezclas de transformación en YPD- agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 |jg de G418 (Sigma Aldrich) porml. Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias sobre las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) produjo placas YPD/G418 vacías. La integración del plásmido pPWT018 se dirige al locus SIT2. Se caracterizaron los transformantes usando PCR y técnicas de transferencia Southern.
Se realizaron reacciones de PCR, que son indicativas de la correcta integración de una copia de plásmido pPWT018, con los cebadores indicados por SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID nO: 4. Con los pares de cebadores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, se comprobó la correcta integración en el locus SIT2. Si el plásmido pPWT018 se integró en múltiples copias (integración de cabeza a cola), el par de cebadores de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 dará un producto de pCr. Si el último producto de PCR está ausente, esto es indicativo de una integración de una copia de pPWT018. Una cepa en la que se integró una copia del plásmido pPWT018 en el locus SIT2 se designó BIE104R2.
1.3 Rescate de los marcadores
Con el fin de ser capaces de transformar la cepa de levadura con otras construcciones usando los mismos marcadores de selección, es necesario eliminar los marcadores de selección. El diseño del plásmido pPWT018 fue tal que tras la integración de pPWT018 en el cromosoma, las secuencias homólogas están en estrecha proximidad entre sí. Este diseño permite que los marcadores de selección sean perdidos por recombinación intramolecular espontánea de estas regiones homólogas.
Tras el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, aunque a baja frecuencia. La frecuencia de esta recombinación depende de la extensión de la homología y el locus en el genoma (resultados no publicados). Tras la transferencia secuencial de una subfracción del cultivo a medio fresco, se acumularán recombinantes intramoleculares con el tiempo.
Para este fin, se cultivó la cepa BIE104R2 en medio YPD (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa), a partir de una cepa aislada de colonias individuales. Se usaron 25 jl de un cultivo durante la noche para inocular medio YPD fresco. Después de al menos cinco de tales transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y las células se diluyeron a una concentración de aproximadamente 5000 porml. Se sembraron 100 jl de la suspensión de células sobre medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), 0,1 % de (NH^SO4, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y 1,8 % de agar (Difco). Células idénticas a las células de la cepa BIE104R2, es decir, sin recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS. Para aquellas células, la fluoroacetamida es tóxica. Estas células no serán capaces de crecer y no formarán colonias sobre un medio que contiene fluoroacetamida. Sin embargo, si ha ocurrido recombinación intramolecular, variantes de BIE104R2 que han perdido los marcadores de selección serán capaces de crecer en el medio de fluoroacetamida, ya que son incapaces de convertir fluoroacetamida en compuestos inhibidores del crecimiento. Aquellas células formarán colonias sobre este medio de agar.
Las colonias resistentes a fluoroacetamida obtenidas se sometieron a un análisis de PCR usando cebadores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Los cebadores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 darán una banda si la recombinación de los marcadores de selección ha tenido lugar como era previsto. Como resultado, el casete con los genes araA, araB y araD bajo el control de los promotores fuertes de levadura ha sido integrado en el locus SIT2 del genoma de la cepa hospedadora. En ese caso, una reacción de PCR usando cebadores de SEQ ID NO: 4 y SEQI ID NO: 5 no debe producir un producto de PCR, ya que el cebador 4 sensibiliza en una región que debe ser perdida debido a la recombinación. Si se obtiene una banda con los últimos cebadores, esto es indicativo de la presencia del plásmido pPWT018 completo en el genoma, por lo que no ha tenido lugar recombinación.
Si los cebadores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 no producen un producto de PCR, la recombinación ha tenido lugar, pero de tal forma que el plásmido pPWT018 completo se ha eliminado del genoma por recombinación. No solo se han perdido los marcadores de selección, sino también los genes de arabinosa. En realidad, se ha recuperado levadura no mutada.
Las cepas aisladas que mostraron resultados de PCR según la integración de una copia de pPWT018 se sometieron a análisis de transferencia Southern. El ADN cromosómico de las cepas CEN.PK113-7D y los recombinantes correctos se digirieron con EcoRI y HindIII (digestión doble). Se preparó una sonda de SIT2 con cebadores de
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SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 usando ADN cromosómico de la cepa CEN.PK113-7D como molde. El resultado del experimento de hibridación se muestra en la Figura 3.
En la cepa no mutada, se observa una banda de 2,35 kb, que es según el tamaño esperado del gen no mutado. Tras la integración y pérdida parcial por recombinación del plásmido pPWT018, era de esperar una banda de 1,06 kb. De hecho, esta banda se observa, como se muestra en la Figura 3 (carril 2).
Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern (como puede deducirse de la Figura 3) es la cepa designada BIE104A2.
1.4 Introducción de cuatro genes expresados constitutivamente de la vía de la pentosa fosfato no oxidativa
Se transformó Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, que expresa los genes araA, araB y araD constitutivamente, con el plásmido pPWT080 (Figura 4). La secuencia del plásmido pPWT080 se expone en SEQ ID NO: 8. El procedimiento para la transformación y selección, después de seleccionar un transformante de integración de una copia, es el mismo que se ha descrito anteriormente en las Secciones 1.1, 1.2 y 1.3. En resumen, se transformó BIE104A2 con pPWT080 digerido con SfiI. Se sembraron mezclas de transformación en YPD-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 |jg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) produjo placas YPD/G418 vacías.
La integración del plásmido pPWT080 se dirige al locus GRE3. Se caracterizaron transformantes usando PCR y técnicas de transferencia Southern. Se comprobó la correcta integración del plásmido pPWT080 en el locus GRE3 por PCR usando los pares de cebadores de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y el par de cebadores de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 se usó para detectar integración de una copia o múltiples copias del plásmido pPWT080. Para el análisis de Southern, se preparó una sonda por PCR usando SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, amplificando una parte del gen RKI1 de S. cerevisiae. A continuación del gen RKI1 nativo, se obtuvo una señal adicional resultante de la integración del plásmido pPWT080 (datos no mostrados)
Un transformante que mostro la correcta integración de una copia del plásmido pPWT080, según el patrón de hibridación esperado, se designó BIE104A2F1. Con el fin de eliminar los marcadores de selección introducidos por la integración del plásmido pPWT080, se cultivó la cepa BIE104A2F1 en medio YPD, a partir de una cepa aislada de colonia. Se usaron 25 jl de un cultivo durante la noche para inocular medio YPD nuevo. Después de cinco transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y las células se diluyeron a una concentración de aproximadamente 5000 por ml. Se sembraron 100 jl de la suspensión de células en medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), 0,1 % de (NH4)2SO4, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y 1,8% de agar (Difco). Colonias resistentes a fluoroacetamida se sometieron a un análisis de PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En caso de perfiles de PCR correctos, se realizó análisis de transferencia Southern con el fin de verificar la correcta integración, otra vez usando la sonda del gen RKI1. Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern es la cepa designada BIE104A2P1.
Ejemplo 2
Evolución adaptativa en matraz oscilante que conduce a BIE104A2P1c y BIE201.
2.1 Evolución adaptativa (aerobia)
Se usó una cepa aislada de colonias individuales de la cepa BIE104A2P1 para inocular medio YNB (Difco) complementado con 2 % de galactosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. Se recogieron las células y se inocularon en medio YNB que contenía 1 % de galactosa y 1 % de arabinosa a una DO600 inicial de 0,2 (Figura 5). Las células se cultivaron a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó regularmente la densidad óptica a 600 nm.
Cuando la densidad óptica alcanzó un valor de 5, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB fresco que contenía el mismo medio. La cantidad de células añadidas fue tal que la DO600 inicial del cultivo fue 0,2. Después de alcanzar una DO600 de 5 otra vez, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB que contenía 2 % de arabinosa como única fuente de carbono (evento indicado por (1) en la Figura 5).
Tras la transferencia a YNB con 2 % de arabinosa como única fuente de carbono, pudo observarse el crecimiento después de aproximadamente dos semanas. Cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó un valor al menos de 1, se transfirieron células a un matraz oscilante con medio YNB fresco complementado con 2 % de arabinosa a una DO600 inicial de 0,2 (Figura 5, día 28).
Se repitió tres veces la transferencia secuencial, como se expone en la Figura 5. La cepa resultante que fue capaz de crecer rápido en arabinosa se designó BIE104A2P1c.
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2.2 Evolución adaptativa (anaerobia)
Después de la adaptación al crecimiento en arabinosa en condiciones aerobias, se inoculó una colonia individual de la cepa BIE104A2P1c en medio YNB complementado con 2% de glucosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. Se recogieron las células y se inocularon en medio YNB que contenía 2 % de arabinosa, con una densidad óptica inicial DO600 de 0,2. Los matraces se cerraron con tapones impermeables, asegurando condiciones de crecimiento anaerobias después de que el oxigeno se agotara del medio y el espacio de cabeza. Después de alcanzar una DO600 mínima de 3, se transfirió una alícuota del cultivo a medio YNB nuevo que contenía 2 % de arabinosa (Figura 6), cada vez a un valor de DO600 inicial de 0,2. Después de varias transferencias la cepa resultante se designó BIE104A2P1d (=BIE201).
Ejemplo 3
Construcción de la cepa BIE201X9
3.1 Transformación de la cepa BIE201
Se transformó la cepa BIE201 con el plásmido pPWT042. El mapa físico del plásmido pPWT042 se expone en la Figura 7. El plásmido pPWT042 (SEQ ID NO: 14) contenía una inserción de 4630 pb que contenía un gen xylA optimizado en el par de codones de Bacteroides uniformis bajo el control del promotor TPI1 y el gen XKS1 de S. cerevisiae bajo el control del promotor TDH1. Antes de la transformación de BIE201, se linealizó pPWT042 usando la enzima de restricción Sfil, según las instrucciones proporcionadas por el proveedor. Se sembraron las mezclas de transformación en YPD-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenían 100 |jg de G418 (Sigma Aldrich) por ml.
Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias sobre las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) produjo placas YPD/G418 vacías.
Tras la digestión del plásmido pPWT042 con Sfil, su integración se dirige al locus SIT4 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cellular Biology Vol. 6, N.° 6, 2185-2197) en el genoma. Se caracterizaron transformantes usando PCR y técnicas de transferencia Southern. Se realizaron reacciones de PCR, usando ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes), que son indicativas de la correcta integración de una copia de plásmido pPWT042, con los cebadores indicados por SEQ ID NO: 15 y 16 (integración correcta de pPWT042 en el locus SIT4) y SEQ ID NO: 16 y 17 (la banda solo aparece en caso de integración de múltiples copias). Una cepa con una copia de plásmido pPWT042 integrado en el genoma se designó BIE201Y9.
3.2 Rescate de marcadores
Con el fin de eliminar los marcadores de selección introducidos por la integración del plásmido pPWT042, se realizó el siguiente procedimiento. El diseño del plásmido pPWT042 es tal que, tras la integración de pPWT042 en el cromosoma, secuencias homólogas están en estrecha proximidad entre sí. Este diseño permite que los marcadores de selección sean perdidos por recombinación intramolecular espontánea de estas regiones homólogas. Tras el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, aunque a baja frecuencia. La frecuencia de esta recombinación depende de la extensión de la homología y el locus en el genoma (resultados no publicados). Tras la transferencia secuencial de una subfracción del cultivo a medio fresco, se acumularán recombinantes intramoleculares con el tiempo.
Para este fin, se cultivó la cepa BIE201Y9 en YPD-2 % de glucosa, a partir de una cepa aislada de colonias individuales. Se usaron 25 jl de un cultivo durante la noche para inocular medio YPD-2 % de glucosa fresco. Después de cinco transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y las células se diluyeron a una concentración de aproximadamente 5000 porml. Se sembraron 100 jl de la suspensión de células sobre medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6,8), 0,1 % de (NH4)2SO4, fluoroacetamida 40 mM (Amersham) y 1,8% de agar (Difco). Células idénticas a las células de la cepa BIE201Y9, es decir, sin recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS. Para aquellas células, la fluoroacetamida es tóxica. Estas células no serán capaces de crecer y no formarán colonias sobre un medio que contiene fluoroacetamida. Sin embargo, si ha ocurrido recombinación intramolecular, variantes de BIE201Y9 que han perdido los marcadores de selección serán capaces de crecer en el medio de fluoroacetamida, ya que son incapaces de convertir fluoroacetamida en compuestos inhibidores del crecimiento. Aquellas células formarán colonias sobre este medio de agar.
Las colonias resistentes a fluoroacetamida así obtenidas se sometieron a análisis de PCR usando cebadores de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, y SE ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. Los cebadores de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 darán una banda si la recombinación de los marcadores de selección ha tenido lugar como era previsto. Como resultado, los genes xylA y XKS1 han sido integrados en el locus SIT4. En ese caso, una reacción de PCR usando cebadores de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 no debe producir un producto de PCR, ya que el cebador 17 sensibiliza en una región que debe ser perdida debido a la recombinación. Si se obtiene una banda con estos cebadores, esto es indicativo de la presencia del plásmido pPWT042 completo en el genoma, por lo que no ha tenido lugar recombinación.
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Si los cebadores de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 no producen un producto de PCR, la recombinación ha tenido lugar, pero de tal forma que el plásmido pPWT042 completo se ha eliminado del genoma por recombinación. No solo se han perdido los marcadores de selección, sino también el gen xylA y XKS1. En realidad, se ha recuperado levadura no mutada.
Las cepas aisladas que presentaron los resultados de PCR esperados se sometieron a análisis de transferencia Southern (véase arriba). Una de las cepas que mostró el patrón correcto de bandas en la transferencia Southern es la cepa designada BIE201X9.
Ejemplo 4
Construcción y selección de la cepa BIE252
4.1 Amplificación del casete con xylA
Con el fin de introducir copias adicionales del gen xylA en el genoma, se realizó una reacción de PCR usando ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) con el plásmido pPWT042 como molde y los oligonucleótidos con SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 como cebadores. Con estos cebadores, se amplifica el casete con xylA, que comprende el promotor TPI1, el gen xylA optimizado en el par de codones y el terminador PMA1. El primer diseño es tal que los flancos del fragmento de PCR son homólogos a la secuencia consenso de las delta-secuencias del transposón de levadura Ty-1. Estas secuencias pueden obtenerse de NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y alinearse usando un paquete de software que permite hace esto como, por ejemplo, Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software, Cary, EE.UU.).
El casete con xylA no contiene un marcador de selección con el que pueda seleccionarse la integración en el genoma. Con el fin de estimar la frecuencia de transformación, se hizo una segunda transformación de control con el marcador kanMX. Para este fin, se amplificó el casete con kanMX del plásmido p427TEF (Dualsystems Biotech) en una reacción de PCR usando los cebadores correspondientes a SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22.
4.2 Transformación de BIE201X9
Se transformó BIE201X9 según el protocolo de electroporación (como se ha descrito anteriormente) con los fragmentos que comprenden ya sea 30 |jg del casete con xylA (designado X18-Ty1) o 10 |jg del casete con kanMX. La mezcla de transformación con kanMX se sembró en YPD-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 jg de G418 (Sigma Aldrich) por ml. Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias sobre las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) produjo placas YPD/G418 vacías. La frecuencia de transformación pareció ser superior a 600 colonias por jg de casete con kanMX.
Se usó la mezcla de transformación de X18-Ty1 para inocular un matraz oscilante que contenía 100 ml de medio de Verduyn, complementado con 2 % de xilosa. Como control, se usó el control negativo de la transformación (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación). Los matraces oscilantes se incubaron a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento fue seguido de medición de la densidad óptica a 600 nm regularmente.
El resultado de la curva de crecimiento se representa en la Figura 8. Como puede apreciarse, entre los días 20 y 25, la densidad óptica del matraz oscilante con X18-Ty1 aumentó espectacularmente, mientras que el crecimiento en el control negativo estuvo todavía ausente. En el día 25, se inoculó un matraz que contenía medio de Verduyn fresco complementado con 2 % de xilosa del cultivo X18-Ty1 a una densidad óptica inicial a 600 nm de 0,15. A partir de la Figura 8 es evidente que tras la re-inoculación el cultivo empezó a crecer sobre xilosa inmediatamente y rápidamente. Como es probable que el cultivo consista en una mezcla de subcultivos, consistiendo así en células con diferencias en el número de copias del casete X18-Ty1 y en la tasa de crecimiento sobre xilosa, se diluyeron células en agua MilliQ y se sembraron en placas de YPD-agar con el fin de conseguir cepas aisladas de colonias individuales. Las cepas aisladas de colonias individuales se probaron para su capacidad para utilizar diferentes fuentes de carbono.
4.3 Selección de la cepa BIE252
Con el fin de seleccionar una cepa que hubiera adquirido crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono sin perder su capacidad para utilizar los otros azúcares importantes (glucosa, arabinosa y galactosa), se volvieron a cultivar en línea diez cepas aisladas de colonias individuales del cultivo de evolución adaptativa sobre YPD-agar. Posteriormente, se hizo un precultivo en medio YPD complementado con 2 % de glucosa. Los diez cultivos se incubaron durante la noche a 30 °C y 280 °C. Se usaron alícuotas de cada cultivo para inocular medio de Verduyn fresco complementado con ya sea 2 % de glucosa, o 2 % de xilosa, o 2 % de arabinosa o 2 % de galactosa, a una densidad óptica inicial de 0,15. Como controles, se incluyeron cepas BIE201, BIE201X9 y la población mixta (de la que se recuperaron las diez cepas aisladas de colonias individuales) en el experimento. Se cultivaron células a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se evaluó basándose en las medidas de densidad óptica a 600 nm. Los resultados de la densidad óptica a 600 nm después de 19 horas de incubación se presentan en la Figura 9.
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Los resultados de la Figura 9 muestran que tanto el cultivo mixto como las diez cepas aisladas de colonias individuales presentan una densidad óptica final más alta a 600 nm en xilosa. Aunque estas cepas crecieron sobre arabinosa como única fuente de carbono, la densidad óptica final a 600 nm fue menor en comparación con las cepas parentales, BIE201 y BIE201X9, 19 horas después de la inoculación. Después del crecimiento prolongado, durante varios días, se seleccionó la colonia 3 debido a que había alcanzado la densidad óptica más alta en comparación con las otras cepas aisladas de colonias individuales (datos no mostrados). El crecimiento en xilosa no fue diferente en todas las colonias probadas.
El cultivo de la colonia 3 se diluyó y se sembró en YPD-agar. Se probaron once cepas aisladas de colonias individuales para su capacidad para crecer en medio de Verduyn, complementado con ya sea 2 % de arabinosa o 2 % de xilosa. Para este fin, se hizo un precultivo en Verduyn con 2 % de glucosa. Las células se cultivaron durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. Se transfirió una alícuota a medio de Verduyn, complementado con ya sea 2 % de arabinosa o 2 % de xilosa, a una densidad óptica inicial de 0,15. El cultivo de colonia 3 se incluyó como control en esta prueba. Las células se cultivaron durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se evaluó basándose en las mediciones de densidad óptica a 600 nm. Los resultados de la densidad óptica a 600 nm después de 4 días de incubación se presentan en la Figura 10.
Los resultados muestran que la colonia 3,7 ha alcanzado una densidad óptica similar al cultivo del control, la colonia 3, en xilosa. Además, su capacidad para crecer en arabinosa como única fuente de carbono ha mejorado ampliamente en comparación con el cultivo de la colonia 3. Las otras cepas aisladas de colonias individuales también muestran un crecimiento mejorado en arabinosa, aparentemente a costa de la capacidad para crecer en xilosa. El cultivo de la cepa aislada de colonias individuales 3,7 se designó la cepa BIE252. Se determinaron SNP y la amplificación en BIE252 siguiendo los mismos procedimientos que se describen en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente PCT, presentada el 19 de abril de 2011, que reivindica prioridad del documento EP10160647.3. Esta prueba mostró que BIE252 tiene los SNP: G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154w, A1186G en el gen CEP3 y A436C en el gen GAL80. Éstos son los mismos que en BIE201. También la amplificación en el cromosoma VII que existe en BIE201 está presente en BIE252. Esto se muestra en la Figura 23.
Ejemplo 5
Prueba de rendimiento en BAM
Con el fin de probar el rendimiento de la cepa BIE252 seleccionada, la cepa se inoculó en medio de Verduyn, complementado con 2 % de glucosa. Como controles, se incluyeron las cepas BIE201 y BIE104P1Y9mc. La primera es una cepa capaz de fermentar glucosa, galactosa y arabinosa (véase arriba), y la última es una cepa capaz de fermentar glucosa, galactosa y xilosa.
Después de la incubación durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio, se recogieron las células por centrifugación y se realizaron cultivos para la producción de CO2 a 33 °C en 100 ml de medio de Verduyn complementado con 5 % de glucosa, 5 % de xilosa, 3,5 % de arabinosa y 1 % de galactosa en BAM (monitor de la actividad biológica). En un experimento, el experimento discontinuo, las células se añadieron a 100 ml de medio de Verduyn complementado con los azúcares. En un segundo experimento, el experimento de lotes alimentados, los 100 ml de medio de Verduyn complementado con los azúcares se añadieron a las células a una tasa de 3 ml por minuto. La producción de CO2 se monitorizó constantemente a intervalos, y se tomaron muestras para el análisis (densidad óptica a 600 nm, etanol, azúcares residuales). Las cepas BIE201 y BIE104P1Y9mc se mezclaron en una relación 1:1, basada en la densidad óptica, justo antes del experimento de BAM.
Los resultados del experimento de BAM se muestran en las Figuras 11, 12, 13, 14, 15 y 16.
El rendimiento de las cepas mixtas (BIE201 y BIE104P1Y9mc) en el modo de lotes alimentados (Figura 11) muestra que a pesar de que la xilosa y arabinosa se acumulan a un cierto grado con el tiempo, ya antes del final de la alimentación (a aproximadamente 33 h) la tasa de consumo es más rápida que la tasa de alimentación. Después de 72 h, toda la arabinosa se ha convertido, mientras que la xilosa no se ha consumido completamente. La glucosa y galactosa están siempre en o cerca del nivel de detección, que indica que estos azúcares son preferidos con respecto a las pentosas arabinosa y xilosa.
El rendimiento de la cepa BIE252, como se prueba en el modo de lotes alimentados en el BAM (véase Figura 12), muestra esencialmente las mismas características que el cultivo de cepas mixtas. Sin embargo, se acumulan xilosa y arabinosa a concentraciones más altas, pero la posterior conversión en etanol tiene lugar a una tasa más alta, que produce el mismo título de etanol y producción de CO2 acumulada idéntica después de 120 h (Figura 13).
En el modo discontinuo, el rendimiento de las cepas mixtas (BIE201 y BIE104P1Y9mc) en el modo discontinuo muestra que la glucosa es fácilmente consumida después del comienzo del experimento de fermentación (Figura 14). Posteriormente, se cofermentan la galactosa, arabinosa y xilosa. Después de aproximadamente 30 h, se consumió la galactosa. Después de aproximadamente 72 horas, también se consumió completamente la arabinosa. Ambas contribuyeron significativamente a la formación de CO2 y etanol. El consumo de xilosa, y así de etanol y la producción de CO2, se ralentizaron significativamente después del agotamiento de la arabinosa. La cepa BIE252 rindió mejor en ese respecto (Figura 15). Inmediatamente después del agotamiento de glucosa en el plazo de 10
horas, la galactosa, arabinosa y xilosa se cofermentaron rápidamente y eficientemente. Incluso después del agotamiento de galactosa, ambas pentosas arabinosa y xilosa se co-fermentaron completamente, contribuyendo ambas a la producción de CO2 y formación de etanol. La fermentación de todos los azúcares estuvo completa después de aproximadamente 72 horas, en caso de la cepa BIE252. Esto produjo una producción de CO2 5 acumulada más alta de la cepa BIE252 en comparación con el cultivo de cepas mixtas (BIE201 y BIE104P1Y9mc) como se expone en la Figura 16.
Ejemplo 6
Prueba de rendimiento en hidrolizados reales
Se realizó la prueba de rendimiento en hidrolizados reales usando la cepa BIE252 que se cultivó durante la noche en 10 matraces oscilantes que contenían medio YEP complementado con 2% de glucosa. Se recogieron las células por centrifugación y se resuspendieron a una concentración de 50 gramos de materia seca por litro.
Las materias primas que se probaron consistieron en lotes de fibra de maíz, tallos y hojas de maíz y paja de trigo. Se realizaron la hidrólisis y fermentación como se describe en la sección de materiales y métodos.
Los resultados se presentan en las Figuras 17 (fibra de maíz), 18 (tallos y hojas de maíz) y 19 (paja de trigo). En 15 caso de tallos y hojas de maíz y paja de trigo, materias primas con una cantidad relativamente baja de galactosa y arabinosa, pero que principalmente consisten en glucosa y xilosa, todos los azúcares se convirtieron en 72 horas en CO2 y etanol. En caso de fibra de maíz (Figura 17), queda una baja cantidad residual de arabinosa, galactosa y xilosa.
En las tablas a continuación se calculó el rendimiento de la fermentación, basándose en los azúcares liberados al 20 final de la hidrólisis y la cantidad de etanol que se produjo al final de la fermentación.
Tabla 2: Azúcar total liberado (g/l), etanol producido (g/l) y rendimiento de etanol (getanol/gazúcar) de fermentación en BAM de BIE252, para diferente materia prima lignocelulósica
Materia prima lignocelulósica
Azúcar total* (g/l) EtOH producido (g/l) Rendimiento de EtOH (getanol/gazúcar)
Tallos y hojas de maíz
45,4 22,7 0,50
Paja de trigo
42,7 20,7 0,48
Fibra de maíz
58,1 27,4 0,47
*(azúcar monomérica liberada al comienzo de la fermentación)
Basándose en la cantidad de etanol producida al final de la fermentación, como se ha determinado por la medición 25 del medidor de densidad Anton Paar DMA 5000, y la cantidad de materia prima pretratada que se estaba usando, se calcularon los rendimientos de la hidrólisis global y fermentación, por duplicado. Estas cifras se explican en la Tabla 3.
Tabla 3: Rendimiento global de la hidrólisis y fermentación (galones de etanol por tonelada de materia seca) de fermentación en BAM de BIE252, para diferente materia prima lignocelulósica
Materia prima lignocelulósica
Rendimiento global de la hidrólisis y fermentación (galones de etanol por tonelada de materia seca) 1a fermentación Rendimiento global de la hidrólisis y fermentación (galones de etanol por tonelada de materia seca) 2a fermentación
Tallos y hojas de maíz
81 81
Paja de trigo
72 73
Fibra de maíz
67 69
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 7
Prueba de estabilidad de la cepa BIE252
7.1 Estabilidad de la cepa BIE252
Con el fin de probar la estabilidad de la cepa BIE252, se usó una cepa aislada de colonias individuales para inocular 25 ml de YEP con 2 % de glucosa. La densidad óptica del cultivo se midió a 600 nm. El cultivo se incubó durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio.
Después de la incubación durante la noche, se determinó la densidad óptica. Basándose en los valores de DO600 antes y después de la incubación, se calculó el número de generaciones hechas durante las incubaciones. Se usaron 25 pl del cultivo durante la noche para inocular un matraz que contenía 25 ml de medio fresco. El cultivo se incubó otra vez bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que se obtuvo un cultivo en el que las células estuvieron al menos cien generaciones separadas de la cepa aislada de colonias individuales inicial. Se eligió medio YEP complementado con 2 % de glucosa, debido a que bajo estas condiciones no se aplica presión de selección para mantener los genes introducidos en la cepa BIE252, necesaria para la conversión de arabinosa y xilosa.
Se diluyó el cultivo celular obtenido después de al menos 100 generaciones y se sembró en YPD-agar. Se inocularon dos cepas aisladas de colonias individuales en medio Verduyn con 2 % de glucosa. Como control, se incluyó la cepa parental BIE252. Los cultivos se incubaron durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio. Se usó una alícuota del cultivo durante la noche para inocular un matraz que contenía 25 ml de medio de Verduyn complementado con 1 % de glucosa, 1 % de xilosa, 0,7 % de arabinosa, 0,3 % de galactosa y 0,1 % de manosa a una densidad óptica inicial de 0,15. A intervalos regulares, se tomaron muestras para el análisis: mediciones de densidad óptica a 600 nm, y para la determinación de azúcares residuales por RMN. Los resultados, como se representa en las Figuras 20a (cultivo de BIE252 antes de la prueba de estabilidad), 20b (cultivo de la colonia de BIE252 después de más de 100 generaciones) y 20c (cultivo de la segunda colonia de BIE252 después de más de 100 generaciones), muestran que el comportamiento de los tres cultivos de cepas es prácticamente idéntico en las condiciones probadas. En otras palabras, el rendimiento en este medio de crecimiento no ha cambiado; la cepa es todavía capaz de utilizar cinco azúcares diferentes con las mismas tasas después de cultivar durante más de 100 generaciones, que indica que la cepa es genéticamente estable.
Además, se hizo un experimento de PCR cuantitativa (Q-PCR) para evaluar el número de copias de BIE252 antes y después del cultivo de 100 generaciones en medio YEP complementado con 2 % de glucosa. El análisis de Q-PCR se realizó usando el sistema Bio-Rad iCycler iQ de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se usó iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los experimentos se configuraron como se sugirió en el manual del proveedor.
Se evaluó la estabilidad de la cepa BIE252 determinando el número de copias del gen xylA que codifica xilosa isomerasa. Como gen de una sola copia de referencia, se eligió el gen ACT1.

Los cebadores para la detección de los genes xylA y ACT1 son: cebador directo para xylA SEQ ID NO 23

cebador inverso para xylA SEQ ID NO 24

cebador directo para ACT1 SEQ ID NO 25

cebador inverso para ACT1 SEQ ID NO 26
Los resultados indicaron que el número de copias de BIE252 es aproximadamente 8 copias del gen xylA, con respecto al gen ACT1. El número de copias se determinó antes y después del cultivo de 100 generaciones en medio YEP complementado con 2 % de glucosa, y pareció que era esencialmente el mismo, teniendo en cuenta las limitaciones del análisis de PCR cuantitativa.
Se aisló el ADN cromosómico de varias colonias, antes y después del cultivo de 100 generaciones en medio YEP complementado con 2 % de glucosa. Se corta el ADN cromosómico por Xbal. Se realiza un análisis de transferencia Southern usando el producto de PCR del par de cebadores SeQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 como sonda. El autorradiograma resultante está mostrando que el patrón de bandas no ha cambiado, que indica que la cepa es genéticamente estable después de 100 generaciones de crecimiento bajo condiciones no selectivas.
Experimento comparativo A
7.2 Estabilidad de BIE201X9 transformada con vectores YEp y YCp
Se transformó la cepa BIE201X9 con los vectores pPWT148 (un plásmido YCp) y pPWT152 (un plásmido YEp). El mapa físico del plásmido pPWT148 se expone en la Figura 21. El mapa físico del plásmido pPWT152 se expone en la Figura 22. Se sembraron mezclas de transformación en YPD-agar (por litro: 10 gramos de extracto de levadura,
5
10
15
20
25
30
35
40
20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos de agar) que contenía 100 |jg de G418 (Sigma Aldrich) por ml. Después de dos a cuatro días, aparecieron colonias sobre las placas, mientras que el control negativo (es decir, sin adición de ADN en el experimento de transformación) produjo placas YPD/G418 vacías.
Se usaron tres colonias de cada transformación como una mezcla para probar la estabilidad. Para este fin, se usaron las colonias mixtas para inocular medio YEP, complementado con 2 % de glucosa y 100 jg de G418/ml. Las células se incubaron durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio. La densidad óptica se midió a 600 nm. El cultivo durante la noche se usó para inocular medio YEP nuevo, complementado con 2 % de glucosa, y el mismo medio complementado con 100 jg de G418/ml, a una densidad óptica inicial a 600 nm de 0,02. Basándose en lo que se informa en la bibliografía (véase arriba), la esperanza es que las células que se cultivaron en presencia de G418 (es decir, se aplica presión selectiva), la mayoría de las células retendrá el plásmido dentro de la célula. Sin embargo, en ausencia de G418, se espera que las células pierdan su plásmido rápidamente.
Se incubaron los cultivos durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio. La densidad óptica se midió a 600 nm. Basándose en las mediciones de densidad óptica, se calculó que el cultivo había hecho 8 generaciones en ambos medios (es decir, con y sin G418). Se hicieron diluciones y se sembraron en placas de YPD con y sin 100 jg de G418/ml. Las placas se incubaron a 30 °C durante aproximadamente dos días, o más, según se necesite para producir colonias visibles y contables.
Además, se usaron 25 jl del cultivo durante la noche para inocular 25 ml de medio YEP fresco, complementado con 2 % de glucosa, y el mismo medio complementado con 100 jg de G418/ml. Los cultivos se incubaron durante la noche a 30 °C y 280 rpm en un agitador rotatorio. La densidad óptica se midió a 600 nm. Basándose en las mediciones de densidad óptica, se calculó que el cultivo había hecho 8 generaciones adicionales en ambos medios (es decir, con y sin G418). Se hicieron diluciones y se sembraron en placas de YPD con y sin 100 jg de G418/ml. Las placas se incubaron a 30 °C durante aproximadamente dos días, o más, según se necesite para producir colonias visibles y contables.
Basándose en las colonias que se contaron en YDP-agar con y sin G418, la estabilidad podría calcularse después de 8 y 16 generaciones en presencia o ausencia de G418. Los resultados se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4: Estabilidad de las cepas del experimento comparativo A (% de clones resistentes a G418)
BIE201X9-pPWT148 BIE201X9-pPWT152
% de clones resistentes a G418 después de 8 generaciones de crecimiento en YEP con 2 % de glucosa
4 12
% de clones resistentes a G418 después de 16 generaciones de crecimiento en YEP con 2 % de glucosa
1 5
% de clones resistentes a G418 después de 8 generaciones de crecimiento en YEP con 2 % de glucosa y 100 jg de G418/ml
9 33
% de clones resistentes a G418 después de 16 generaciones de crecimiento en YEP con 2 % de glucosa y 100 jg de G418/ml
28 40
A partir de la tabla, puede observarse que tanto los plásmidos YCp como YEp (es decir, pPWT148 y pPWT152, respectivamente) no son establemente mantenidos en las células de levadura transformadas, aunque la presión de selección está siendo aplicada durante el cultivo, en este caso mediante la adición de G418 al medio de cultivo. Debe observarse, sin embargo, que la pérdida de plásmido es mucho más severa en ausencia de presión de selección.
Este experimento en combinación con el Ejemplo 7 proporciona el conocimiento de que la integración cromosómica de los genes de xilosa isomerasa en el genoma es necesaria para obtener transformantes de levadura estables.
Ejemplo 8
La deleción de GAL80 conduce a una mejor conversión de arabinosa
En el Ejemplo 4 se mostró que el SNP identificado en el gen GAL80 tiene un efecto aditivo positivo sobre el crecimiento en arabinosa, si también está presente la amplificación de una parte del cromosoma VII.
GAL80 codifica un represor transcripcional implicado en la regulación transcripcional en respuesta a galactosa (Timson DJ, et al. (2002) Biochem J 363(Pt 3):515-20). Conjuntamente con Gal4p y Gal3p, Gal80p regula coordinadamente la expresión de genes que contienen un sitio de activación GAL en la dirección 5' en su promotor (UAS-GAL), que incluye los genes metabólicos de GAL GAL1, GAL10, GAL2 y GAL7 (revisado en Lohr D, et al.
5
10
15
20
25
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45
50
55
(1995) FASEB J 9(9):777-87). Células nulas para gal80 expresan constitutivamente genes GAL, incluso en medios no inductores (Torchia TE, et al. (1984) Mol Cell Biol 4(8):1521-7).
La hipótesis es que el SNP que se identificó en el gen GAL80 influye en la interacción entre Gal80p, Gal3p y Gal4p. De ahí que la expresión de los genes metabólicos de galactosa, que incluyen galactosa permeasa que codifica GAL2, se cambie también en comparación con una célula de levadura con un alelo GAL80 no mutado. Gal2p (galactosa permeasa) es el principal transportador de azúcar para arabinosa (Kou et al (1970) J Bacteriol. 103(3):671-678; Becker y Boles (2003) Appl Environ Microbiol. 69(7): 4144-4150).
Aparentemente, el SNP en el gen GAL80 tiene un efecto positivo sobre la capacidad de convertir L-arabinosa. Con el fin de investigar si el fenotipo de crecimiento de arabinosa podría mejorarse adicionalmente, se delecionó la secuencia codificante del gen GAL80 en su totalidad, usando una estrategia de sustitución génica mediada por PCR.
8.1 Alteración del gen GAL80
Se usaron cebadores de SEQ ID NO 58 y 59 (los cebadores directos e inversos, respectivamente) para la amplificación del marcador kanMX del plásmido p427-TEF (Dualsystems Biotech, Schlieren, Suiza). Los flancos de los cebadores son homólogos a la región 5' y la región 3 del gen GAL80. Tras la recombinación homóloga, el ORF del gen GAL80 se sustituirá por el marcador kanMX, similar a como se describe por Wach (Wach et al (1994) Yeast 10, 1793-1808). El fragmento obtenido se designa el fragmento GAL80::kanMX.
Se hizo una transformación de levadura de la cepa BIE252 con el fragmento GAL80::kanMX purificado según el protocolo descrito por Gietz y Woods (2002), Methods in Enzymology 350: 87-96). La construcción de la cepa BIE252 se ha descrito en el documento EP10160622.6. La cepa BIE252 es una cepa fermentadora de xilosa y arabinosa de S. cerevisiae, que es un derivado de BIE201. La cepa BIE252 también contenía el SNP de GAL80.
Se sembraron las células transformadas en YEPD-agar que contenía 100 pg/ml de G418 para la selección. Las placas se incubaron a 30 °C hasta que las colonias fueron visibles. Se incluyó el plásmido p427-TEF como control positivo y dio muchas colonias. Se incluyó MilliQ (es decir, sin ADN) como control negativo y no dio colonias. El fragmento GAL80::kanMX dio muchas colonias. Se probaron dos colonias independientes por transferencia Southern con el fin de verificar la correcta integración (datos no mostrados). Una colonia con la deleción correcta del gen GAL80 se designó BIE252AGAL80.
8.2 Efecto de la sustitución del gen GAL80 sobre el rendimiento en BAM
Se realizó un experimento de BAM (monitor de la actividad biológica; Halotec BV, Veenendaal, Los Países Bajos). Se usaron cepas aisladas de colonias individuales de la cepa BIE252 y cepa BIE252AGAL80 (un transformante en el que el ORF del gen GAL80 se sustituyó correctamente por el marcador kanMX) para inocular medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) complementado con 2 % de glucosa. Los precultivos se incubaron durante aproximadamente 24 horas a 30 °C y 280 rpm. Se recogieron las células y se inocularon en un medio modelo sintético (medio de Verduyn complementado con 5 % de glucosa, 5 % de xilosa, 3,5 % de arabinosa, 1 % de galactosa y 0,5 % manosa, pH 4,2) a una densidad celular de aproximadamente 1 gramo de peso seco por kg de medio. Se monitorizó constantemente la producción de CO2. Se analizó la conversión de azúcar y la formación de producto por RMN. Los datos representan la cantidad residual de azúcares en los momentos de tiempo indicados (glucosa, arabinosa, galactosa, manosa y xilosa en gramos por litro) y la formación de (sub)productos (etanol, glicerol). Se monitorizó el crecimiento siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600nm. El experimento se realizó durante aproximadamente 72 horas.
Los gráficos se presentan en la Figura 23 (BIE252) y 24 (BIE252AGAL80).
Los experimentos muestran claramente que la cepa BIE252 de referencia convirtió glucosa y manosa rápidamente. Después del agotamiento de glucosa (aproximadamente 10 horas), comenzó la conversión de xilosa y arabinosa. Algo de galactosa ya estaba siendo fermentado aproximadamente en el momento de tiempo de 10 horas, que podría ser debido al SNP de GAL80 en esta cepa, que permitiría la utilización simultánea (parcial) de glucosa y galactosa. Al final del experimento, aproximadamente 72 horas, se habían convertido casi todos los azúcares (aproximadamente el 99 %). Se obtuvo un rendimiento de etanol de 0,37 gramos de etanol por gramo de azúcar.
La cepa BIE252AGAL80 presenta capacidad de conversión de azúcar más rápida que la cepa BIE252. También en el caso de esta cepa, se convierten manosa y glucosa en las primeras horas de la fermentación. Sin embargo, a diferencia de la cepa BIE252, en este transformante hay algo de co-consumo de glucosa, galactosa y manosa con arabinosa y especialmente xilosa. En general, el consumo de azúcar es más rápido, conduciendo a un uso más completo de todos los azúcares disponibles. Esto también es evidente del desprendimiento de CO2 con el tiempo. En el caso de BIE252, se observa un primer pico, que es básicamente el CO2 formado a partir de glucosa y manosa. Después de alcanzar un mínimo de justo por encima de 10 ml/h (Figura 20), se observa un segundo pico más plano. En caso de BIE252AGAL80, sin embargo (Figura 21), el segundo pico aparece como una cola del primer pico, debido a un co-uso intensificado de glucosa, xilosa, arabinosa, manosa y galactosa, como es evidente del análisis de azúcares por RMN. En la cepa parental BIE252, el uso de los diferentes azúcares es más secuencial. De ahí que el

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Célula adecuada para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y manosa, en la que la célula comprende dos a quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o dos a quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y dos a diez copias de cada uno de araA, araB y araD, en la que estos genes están integrados en el genoma de la célula.
  2. 2. Célula según la reivindicación 1, en la que la célula es capaz de convertir el 90% o más de glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible, en un producto de fermentación.
  3. 3. Célula según la reivindicación 1, en la que la célula tiene una interrupción o deleción del gen GAL80.
  4. 4. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la célula es del género Saccharomyces, opcionalmente de la especie Saccharomyces cerevisiae.
  5. 5. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula comprende expresados en exceso los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1.
  6. 6. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la célula comprende un gen XKS1.
  7. 7. Célula según cualquiera de la reivindicación 1-6, en la que un gen de aldosa reductasa está delecionado.
  8. 8. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que todos los genes exógenos a la célula se integran en el genoma de la célula.
  9. 9. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que los genes han sido introducidos en la célula por introducción en una célula hospedadora de:
    a) una agrupación que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte
    b) una agrupación que consiste en los genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RK11, opcionalmente bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; y deleción de un gen de aldosa reductasa;
    c) una agrupación que consiste en un gen xylA y un gen XKS1 bajo el control de promotor constitutivo fuerte;
    d) una construcción que comprende un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma en múltiples loci;
    y evolución adaptativa de la construcción de azúcares mixtos para producir la célula de azúcares mixtos.
  10. 10. Célula según la reivindicación 9, en la que la célula es una célula resistente a inhibidor.
  11. 11. Célula según la reivindicación 9 o 10, en la que la célula es una célula industrial.
  12. 12. Proceso para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa, en el que la composición de azúcares se fermenta con una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
  13. 13. Proceso según la reivindicación 12, en el que la composición de azúcares se produce a partir de material lignocelulósico por:
    a) pretratamiento de uno o más materiales lignocelulósicos para producir material lignocelulósico pretratado;
    b) tratamiento enzimático del material lignocelulósico pretratado para producir la composición de azúcares.
  14. 14. Proceso según las reivindicaciones 12 o 13, en el que la fermentación se realiza anaeróbicamente.
  15. 15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el producto de fermentación es etanol.
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