CN102869766A - 适于发酵混合的糖组合物的细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适于从包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖组合物中生产一种或多种发酵产物的细胞，其中所述细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，以及2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中，这些基因被整合进细胞基因组中。

Description

适于发酵混合的糖组合物的细胞

发明领域

本发明涉及适于发酵包含多种C5和/或C6糖的糖组合物(此类组合物在本文中被命名为混合的糖组合物)的细胞。混合的糖组合物可源自木质纤维素材料。本发明还涉及使用混合糖细胞由混合的糖组合物生产发酵产物的方法。

发明背景

作为化石燃料的替代品生产的大部分乙醇目前来自于对玉米淀粉和基于甘蔗的蔗糖的发酵。为了达成生产可更新燃料的宏伟目标，已开发了新的技术，用于将非食物生物质转化成发酵产物，例如乙醇。Saccharomycescerevisiae是乙醇工业中所选择的生物，但是其不能利用生物质原料的半纤维素组分中含有的五碳糖。半纤维素可占生物质的20-30％，其中木糖和阿拉伯糖是最丰富的C5糖。木糖异构酶(XI)的异源表达是使得酵母细胞能够代谢和发酵木糖的一种选择。类似地，细菌基因araA、araB和araD在S.cerevisiae菌株中的表达导致阿拉伯糖的利用和高效的醇发酵。半乳糖是C6糖，其也是通常存在于木质纤维素中的糖，就经济上的原因而言通常其含量(总糖的～4％)不应被忽略。

J.van den Brink et al，Microbiology(2009)155，1340-1350公开了葡萄糖是Saccharomyces cerevisiae偏好的碳源，并且从葡萄糖受限的发酵条件转换为厌氧条件下半乳糖过量的条件后，半乳糖不被消耗。

迄今为止尚无公开在与葡萄糖相同的方法中将葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖转化成发酵产物的方法。

发明内容

本发明的目标是提供能将葡萄糖、木糖和半乳糖和甘露糖(即，四种糖的混合物)转化为发酵产物的细胞。本发明的另一目标是提供能将葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖(即，五种糖的混合物)转化为发酵产物的此类细胞。本发明的进一步的目标是提供稳定的此类上文定义的细胞。本发明的进一步的目标是提供无标记物的此类上文定义的菌株。本发明的进一步的目标是提供这样的方法，其中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖被同时转化为发酵产物。根据本发明实现这些目标的一个或多个。

本发明提供了适于由包含葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的细胞，其中所述细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶和2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中这些基因被整合进细胞基因组中。

本发明进一步提供了用于由包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖和任选地半乳糖和/或甘露糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，所述方法包括下述步骤：

a)在下述混合糖细胞的存在下发酵糖组合物，所述混合糖细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因和/或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其中这些基因被整合进细胞基因组中；和

b)回收发酵产物。

在一种实施方式中，混合物的糖细胞是Saccharomyces属的细胞。在一种实施方式中，混合物的糖细胞是Saccharomyces cerevisiae种。在一种实施方式中，发酵产物是乙醇。

附图说明

图1展示了质粒pPWT006的物理图谱。

图2展示了质粒pPWT018的物理图谱。

图3展示了Southern印迹放射自显影图。用EcoRI和HindIII二者消化野生型菌株CEN.PK113-7D(泳道1)和BIE104A2(泳道2)的染色体DNA。将印迹与特异性的SIT2-探针杂交。

图4展示了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID NO：8中给出。

图5展示了在不同培养基上BIE104P1A2在需氧条件下的生长曲线。在YNB 2％半乳糖上预培养菌株BIE104A2P1。生长曲线在2％半乳糖和1％阿拉伯糖上开始，之后是在图中由数字(1)标注的事件：转移至含2％阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0.2的起始OD 600的新鲜培养基上。在纯阿拉伯糖培养基上转移三次后，将得到的菌株命名为BIE104P1A2c。

图6展示了在2％阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上，BIE104P1A2c在厌氧条件下的生长曲线。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0.2的起始OD 600的新鲜培养基上。若干次转移后，将得到的菌株命名为BIE104P1A2d(＝BIE201)。

图7展示了质粒pPWT042的物理图谱，其序列在SEQ ID NO：14中给出。

图8展示了转化混合物在需氧条件下的生长曲线。用片段X18-Ty1转化菌株BIE201X9并且转化混合物用来接种补充有2％木糖的Verduyn-培养基。在OD 600达到约35后，一小份的培养物用来接种具有新鲜培养基的第二摇瓶。从第二摇瓶中分离用于进一步分析的菌落。

图9展示了在补充有2％葡萄糖或2％木糖或2％阿拉伯糖或2％半乳糖的Verduyn-培养基上单个菌落隔离群的生长。

图10展示了在补充有2％木糖或2％阿拉伯糖的Verduyn-培养基上经选择的单个菌落隔离群的生长。

图11展示了在补料分批实验中，在合成培养基上菌株BIE104P1Y9mc和BIE201的混合培养物的糖转化和产物形成。持续测量CO₂产生。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2％葡萄糖上生长。

图12展示了在补料分批实验中，在合成培养基上菌株BIE252的糖转化和产物形成。持续测量CO₂产生。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2％葡萄糖上生长。

图13展示了在补料分批实验中产生的总CO₂。

图14展示了在分批实验中，在合成培养基上菌株BIE104P1Y9mc和BIE201的混合培养物的糖转化和产物形成。持续测量CO₂产生。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2％葡萄糖上生长。

图15展示了在分批实验中，在合成培养基上菌株BIE252的混合培养物的糖转化和产物形成。持续测量CO₂产生。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2％葡萄糖上生长。

图16展示了在分批实验中产生的总CO₂。

图17展示了在13.8％d.m下的水解的玉米纤维中菌株BIE252的性能。示出了CO2产生率、乙醇生产和糖转化。

图18展示了在10％d.m下的水解的玉米秸秆中菌株BIE252的性能。示出了CO2产生率、乙醇生产和糖转化。

图19展示了在10％d.m下的水解的小麦秸中菌株BIE252的性能。示出了CO2产生率、乙醇生产和糖转化。

图20a展示了菌株BIE252的糖转化(率)。

图20b展示了在具有2％葡萄糖的YEP-培养基中培养超过100代后，菌株BIE252的单个菌落隔离群的糖转化(率)。

图20c展示了在具有2％葡萄糖的YEP-培养基中培养超过100代后，菌株BIE252的单个菌落隔离群的糖转化(率)。

图21展示了质粒pPWT148的物理图谱。

图22展示了质粒pPWT152的物理图谱。

图23展示了用溴化乙锭染色的CHEF凝胶。使用CHEF技术根据它们的尺寸分离染色体。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a (不能消耗阿拉伯糖的第一转化体，BIE104A2P1的同物异名)、通过适应性进化得自BIE104A2P1的菌株BIE104A2P1c(其能在阿拉伯糖上生长)、通过适应性进化得自BIE104A2P1c的菌株BIE201(其能在厌氧条件下在阿拉伯糖上生长)和作为混合糖菌株的菌株BIE252。观察到染色体变化(见正文)。菌株YNN295是标记菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。

序列表简述

SEQ ID NO：1展示了质粒pPWT018的序列。

SEQ ID NO：2展示了用于检查pPWT018整合的引物序列。

SEQ ID NO：3展示了用于检查pPWT018整合(用SEQ ID NO：2)和用于检查pPWT018的拷贝数目(用SEQ ID NO：4)的引物序列。

SEQ ID NO：4展示了用于检查pPWT018的拷贝数目的引物序列。

SEQ ID NO：5展示了结合SEQ ID NO：4用于检查pPWT018在基因组中存在的引物序列。

SEQ ID NO：6展示了用于产生SIT2探针的正向引物序列。

SEQ ID NO：7展示了用于产生SIT2探针的反向引物序列。

SEQ ID NO：8展示了质粒pPWT080的序列。

SEQ ID NO：9展示了用于检查pPWT080在GRE3-基因座的末端上正确整合(用SEQ ID NO：10)和用于检查质粒pPWT080的拷贝数目(用SEQID NO：11)的正向引物序列。

SEQ ID NO：10展示了用于检查pPWT080在GRE3-基因座的末端上正确整合的反向引物序列。

SEQ ID NO：11展示了用于检查质粒pPWT080的拷贝数目的反向引物序列。

SEQ ID NO：12展示了用于产生RKI1-探针的正向引物序列。

SEQ ID NO：13展示了用于产生RKI1-探针的反向引物序列。

SEQ ID NO：14展示了质粒pPWT042的序列。

SEQ ID NO：15展示了用于检查pPWT042整合的引物序列。

SEQ ID NO：16展示了用于检查pPWT042整合的引物序列。

SEQ ID NO：17展示了用于检查pPWT042整合的引物序列。

SEQ ID NO：18展示了用于检查pPWT042的标记物丢失的引物序列。

SEQ ID NO：19展示了用于扩增xylA-表达盒的引物序列。

SEQ ID NO：20展示了用于扩增xylA-表达盒的引物序列。

SEQ ID NO：21展示了用于扩增kanMX-表达盒的引物序列。

SEQ ID NO：22展示了用于扩增kanMX-表达盒的引物序列。

SEQ ID NO：23展示了用于定量PCR的引物序列。

SEQ ID NO：24展示了用于定量PCR的引物序列。

SEQ ID NO：25展示了用于定量PCR的引物序列。

SEQ ID NO：26展示了用于定量PCR的引物序列。

发明详述

在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(″comprises″，″comprising″)、“包括”(″includes″and″including″)应被解释为开放方式。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。

冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。

本文所述的本发明的多个实施方式可以交叉组合。

糖组合物

根据本发明的糖组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。在糖组合物中任选的糖是半乳糖和甘露糖。在一种优选的实施方式中，糖组合物是一种或多种木质纤维素材料的水解产物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中：果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，林木，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。

表1中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物及其水解产物的糖组合物的概况。所列出的木质纤维素包括：玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮(melon shells)、甜菜浆、小麦秸、甘蔗渣、木材、草和橄榄压制物(olive pressings)。

表1：来自木质纤维素材料的糖组合物的概况。Gal＝半乳糖，Xyl＝木糖，Ara＝阿拉伯糖，Man＝甘露糖，Glu＝谷氨酸盐/酯，Rham＝鼠李糖。给出了半乳糖百分比(％Gal)和文献来源。

表1表明在这些木质纤维素中，高量的糖以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的衍生物形式存在。因此葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖到发酵产物的转化具有巨大的经济重要性。在一些木质纤维素材料中还存在甘露糖，其通常以低于前面提到的糖的量存在。有利地，甘露糖还因此被混合糖细胞转化。

混合糖细胞

混合糖细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，和2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中这些基因被整合进细胞基因组中。

在一种实施方式中，混合糖细胞包含约8个拷贝或8个拷贝的木糖异构酶，其中这些基因被整合进混合糖细胞基因组中。在另一实施方式中，混合糖细胞包含8个拷贝的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，其中这些基因被整合进混合糖细胞基因组中。

拷贝数目可由技术人员通过任何已知的方法测定。在这些例子中，描述了合适的方法。

混合糖细胞包含2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中这些基因被整合进细胞基因组中。所述细胞能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖。

在一种实施方式中，混合糖细胞包含2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝、5个拷贝、6个拷贝、7个拷贝、8个拷贝、9个拷贝或10个拷贝、2至10个、2至9个、2至8个、2至7个、2至6个、2至5个、2至4个、3至10个、3至9个、3至8个、3至7个、3至6个、3至5个、4至10个、4至9个、4至8个、4至7个或4至6个拷贝的araA、araB和araD基因的每一种，其中这些基因被整合进细胞基因组中。在一种实施方式中，混合糖细胞包含约4个拷贝的araA、araB和araD基因的每一种或4个拷贝的araA、araB和araD基因的每一种，其中这些基因被整合进细胞基因组中。

在一种实施方式中，混合糖细胞中的木糖异构酶基因或木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的拷贝数目是8个或9个。在一种实施方式中，混合糖细胞中的araA、araB和araD基因的拷贝数目是3个或4个。

在一种实施方式中，细胞能将可得到的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的90％或更多转化为发酵产物。在一种实施方式中，细胞能将可得到的所有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的91％或更多、92％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或100％转化为发酵产物。

在一种实施方式中，细胞具有GAL80基因的打断或缺失。

在本发明的一种实施方式中，混合糖细胞能够发酵一种或多种其他糖，优选地C5和/或C6糖，例如甘露糖。在本发明的一种实施方式中，混合糖细胞包含以下之一种或多种：xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，以允许混合糖细胞发酵木糖；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达，以允许提高细胞中通过戊糖磷酸途径的通量。

在一种实施方式中，混合糖细胞是工业细胞，更优选地是工业酵母。工业细胞和工业酵母细胞可如下定义。工业方法中(酵母)细胞的生存环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变，它伯一起对Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言，工业酵母菌株通常更加强健。在一种实施方式中，以工业宿主细胞为基础构建工业混合糖细胞，其中所述构建如下文所述进行。工业酵母(S.cerevisiae)的例子是Ethanol(Fermentis)、

(DSM)和

(Lallemand)。

在一种实施方式中，混合糖细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可随着原料、预处理方法、水解过程的变化而广泛变化。抑制剂范畴的例子是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的例子是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的例子是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的例子是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。抑制剂的典型用量对于羧酸而言是每升若干克到每升20克或更多，这取决于原料、预处理和水解条件。对呋喃而言是每升数百毫克到每升数克，这取决于原料、预处理和水解条件。对酚类而言是每升数十毫克到每升一克，这取决于原料、预处理和水解条件。

根据本发明的混合糖菌株是抑制剂耐受的，即它们能经得起在使用常见预处理和水解条件时典型水平的常见抑制剂，使得混合糖菌株能够具有广泛的应用，即其具有针对不同原料、不同预处理方法和不同水解条件的高度可应用性。

在一种实施方式中，以抑制剂耐性宿主细胞为基础构建工业混合糖细胞，其中如下文所述进行所述构建。可以针对在含有抑制剂的材料上的生长，通过筛选菌株来选择抑制剂耐性的宿主细胞，如Kadar et al，Appl.Biochem.Biotechnol.(2007)，Vol.136-140，847-858中所述，其中选择了抑制剂耐受性S.cerevisiae菌株ATCC 26602。

在一种实施方式中，混合糖细胞是无标记物的。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。无标记物表示混合糖细胞中基本不存在标记物。在混合糖细胞的构建中使用、并在之后去除抗生素标记物时，无标记物是尤其有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如分子内重组)进行标记物的去除。标记物去除的合适方法在实施例中阐述。

混合糖细胞可以能够将植物生物质、纤维素、半纤维素酶、果胶、鼠李糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油转化成例如可发酵的糖。因此，混合糖细胞可表达一种或多种酶，例如将纤维素转化成葡萄糖单体或将半纤维素转化成木糖和阿拉伯糖单体的纤维素酶(内切纤维素酶或外切纤维素酶)、半纤维素酶(内切木聚糖酶或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。

混合糖细胞还可包含将丙酮酸转化成想要的发酵产物例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。

在一种实施方式中，混合糖细胞是天然能够进行醇发酵、优选地能够进行厌氧醇发酵的细胞。混合糖细胞优选地具有对乙醇的高度耐受，对低pH(即能够在低于约5、约4、约3、或约2.5的pH下生长)和对有机酸的高度耐受，和/或对提高的温度的高度耐受。

混合糖细胞的任何上述特征或活性可天然存在于细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修饰。

混合糖菌株的构建

根据一种实施方式，可以通过向宿主细胞中引入：

a)处于强组成型启动子控制下的由基因araA、araB和araD构成的簇，

b)任选地处于强组成型启动子控制下的由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1构成的簇，并缺失醛糖还原酶基因；

c)处于强组成型启动子控制下的由xylA-基因和XKS1-基因构成的簇；

d)处于强组成型启动子控制下的包含xylA基因的构建体，其能在多个基因座上整合进基因组中。

并进行适应性进化，将基因引入混合糖细胞中，以产生混合糖细胞。可使用重组表达技术构建上述细胞。重组表达

混合糖细胞是重组细胞。也就是说，混合糖细胞包含下述核苷酸序列，或用下述核苷酸序列转化，或用下述核苷酸序列遗传修饰，所述核苷酸序列并不天然地存在于所考虑的细胞中。

用于在细胞中重组表达酶以及用于对混合的细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。典型地，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法可例如从标准手册中获知，例如Sambrookand Russel(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press或F.Ausubel et al.，eds.，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishingand Wiley Interscience，New York(1987)。用于对真菌宿主细胞进行转化和遗传修饰的方法可从例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102、WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265，186中获知。

典型地，核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细胞可例如通过多个拷贝的核苷酸构建体，或通过使用具有多个拷贝酶序列的构建体，而包含单个或多个拷贝的编码酶的核苷酸序列。

核酸构建体可保持为游离并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体复制序列。合适的游离核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer et al.，1991，Biotechnology 9：968-975)或AMA质粒(Fierro et al.，1995，Curr Genet.29：482-489)。或者，每种核酸构建体可作为单个拷贝或多个拷贝被整合进细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机地发生，但是优选地，核酸构建体可如本领域所公知的通过同源重组被整合进细胞的基因组中(见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186)。

大部分游离或2μ质粒是相对不稳定的，在每一代后在约10^-2或更多细胞中丢失。即使在选择性生长的条件下，只有60％到95％的细胞保留游离质粒。对cir⁺宿主而言，大部分游离质粒的拷贝数范围在每个细胞20-100个之间。然而，质粒在细胞之间并非均等分布的，种群中每个细胞中的拷贝数存在高度方差。用整合型质粒转化的菌株是极度稳定的，即使不存在选择性压力时也是如此。然而，质粒丢失可通过串联重复DNA之间的同源重组而以约10^-3到10^-4的频率发生，导致载体序列的成环丢失(looping out)。因此，优选地，在稳定整合情况下的载体设计是，通过选择标记物基因的丢失(也通过分子内、同源重组发生)，被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地，基因以这种方式被稳定整合。稳定整合在本文中被定义为整合进基因组中，其中被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地不存在选择标记物。典型地，酶编码序列应与一个或多个能够提供或帮助酶序列的转录和/或翻译的核酸序列可操作地连接。

术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，所述启动子或增强子影响所述编码序列的转录。

在本文中使用时，“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，相对于基因转录起点的转录方可而言位于上游，并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。

能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。然而，启动子对宿主细胞而言可以是同源的，即内源的。

启动子是可广泛获得的，并是技术人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子，如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PFK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于这类启动子的更多细节可在(WO 93/03159)中找到。其它有用的启动子是编码核糖体蛋白的基因启动子，乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰，来影响它们的控制特征。本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子以及经改造的启动子，这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1 TPI1和AOX1。其它合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEF1和TDH3。

在混合糖细胞中，编码酶的核苷酸序列的3’-端优选地与转录终止子序列可操作地连接。优选地，终止子序列在选择的宿主细胞、如例如选择的酵母物种中是可操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的；其可以例如来自于任何酵母基因，尽管如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。优选地，这类终止子与预防宿主混合糖细胞中无义介导的mRNA衰变的突变组合(参阅例如：Shirley et al.，2002，Genetics 161：1465-1482)。

转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。

任选地，适用于本发明的核酸构建体中可存在选择性标记物。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗生素从未经转化的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3′-O-磷酸转移酶II(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。对于多倍体宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的。也可以使用非抗生素抗性标记物，如营养缺陷型标记物(URA3、TRP1、LEU2)或S.pombe TPI基因(由Russell P R，1985，Gene 40：125-130描述)。在一种优选的实施方式中，用核酸构建体转化的宿主细胞是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-O 635574中，并且基于双向标记物如A.nidulans amdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者，可以将可筛选的标记物如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中，允许筛选经转化的细胞。

可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于，一条或多条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点抗体(centromer)、调聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列，如ARS序列。

因此，重组方法可使用已知的重组技术进行。本领域技术人员已知用于在混合糖细胞中酶的表达和过表达的多种手段。具体地，可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自游离多拷贝表达载体的基因，或通过引入包含多拷贝基因的游离表达载体)来过表达酶。

或者，可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现本发明宿主细胞中酶的过表达。尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的，但是还优选启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源的。优选地，与对编码序列而言天然的启动子相比，异源启动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。在本文上下文中，合适的启动子包括组成型和诱导型启动子二者，以及经改造的启动子。

在一种实施方式中，混合糖细胞是无标记物的，这表示基因组或染色体外不存在营养缺陷或显性标记物，尤其是抗生素抗性标记物。

用于上述酶的过表达的编码序列可优选地对宿主细胞而言是同源的。然而，可以使用对宿主细胞而言异源的编码序列。

涉及经遗传修饰的细胞中酶的生产时，酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常，这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产，确切地说以更高的稳态水平被生产。类似地，这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产，或者也以更高的稳态水平被生产。优选地，在宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时，要过表达的酶被过表达至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。

适应(adaption)

适应是一种进化过程，藉此种群变得更加适合(适应)其一种或多种栖息地(habitat)。该过程在若干到许多代中发生，并且是生物学的基本现象之一。

术语适应也可以表示对生物存活而言特别重要的特征。此类适应在可变种群中通过天然选择由更成功地进行繁殖的、更好地适应的形式生产。

环境条件的改变改变了天然选择的结果，影响所造成的适应的选择性益处(selective benefits)，改善生物在新条件下的适合度(fitness)。在极端环境改变的情况下，有益适应的出现和固定对存活而言可以是至关重要的。大量不同的因素(例如养分可用度、温度、氧可用度等等)能够驱动适应性进化。

适合度(Fitness)

适应性(在给定栖息地集合中生物能够生活和繁殖的程度)和适合度之间存在清楚的联系。适合度是天然选择率的一种估计量和预测器。通过应用天然选择，替代性表型的相对频率可随着时间而变化，如果它们可以遗传的话。

遗传改变

当天然选择作用于种群的遗传变异性时，遗传改变是潜在的机制。通过这种方式，种群遗传适应于其环境。遗传改变可导致可见的结构，或者以适应改变的栖息地的方式调节生物的生理活性。

若栖息地频繁改变，可发生遗传改变。因此，其遵从适应方法绝不最终结束。其可随时间在环境逐渐改变时发生，并且物种变得越来越好地适合其环境。另一方面，其可在环境相对快速地发生改变时出现，并接着物种变得越来越不能良好地适应。适应是遗传方法，其一定程度上一直发生，也在种群不改变栖息地或环境时发生。

适应性进化

混合糖细胞可在其制备中被施加适应性进化。可以针对在想要的糖上、优选地作为唯一碳源的想要的糖上，更优选地在厌氧条件下的生长来选择自发或(例如通过辐射或化学品)诱导的突变体，使混合糖细胞适应糖利用。突变体的选择可以通过包括例如Kuyper et al.(2004，FEMS YeastRes.4：655-664)所述的培养物连续转移在内的技术来进行，或者通过在恒化器培养中、在选择压力下培养来进行。例如，在一种优选的宿主细胞中，至少一种上述遗传修饰(包括通过突变体选择获得的修饰)赋予宿主细胞在木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时、并且优选地在厌氧条件下生长的能力。当XI用作基因来转化木糖时，优选地，细胞基本上不生产木糖醇，例如生产的木糖醇低于检出界限，或者例如以摩尔为基础少于消耗的碳的约5％、约2％、约1％、约0.5％或约0.3％。

适应性进化还描述于例如Wisselink H.W.et al，Applied andEnvironmental Microbiology Aug.2007，p.4881-4891中。

在适应性进化的一种实施方式中，使用由不同培养基(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖；木糖和阿拉伯糖)中重复的连续生长循环与重复的分批培养所构成的方案。见Wisselink et al.(2009)Applied and EnvironmentalMicrobiology，Feb.2009，p.907-914。

酵母转化和遗传稳定性

遗传工程(即用重组DNA转化酵母细胞)在1978年首次可行[Beggs，1978；Hinnen et al.，1978]。从那时起，建立了酵母中的重组DNA技术。可以获得多种不同的载体构建体。通常，这些被称作穿梭载体的质粒载体含有由复制起点和选择性标记物(通常是β-内酰胺酶基因，ampR)构成的、源自E.coli载体的遗传材料，这使得它们在被转化进酵母细胞中之前能够在E.coli中繁殖。另外，穿梭载体含有用于在酵母中选择的选择性标记物。标记物可以是下述基因，所述基因编码用于合成具体氨基酸或核苷酸的酶，使得带有相应基因组缺失(或突变)的细胞针对营养缺陷或自养而被回补(complemented)。或者，这些载体含有异源显性抗性标记物，它们对重组的酵母细胞(即吸收了DNA并且表达标记物基因的细胞)赋予针对某些抗生素如g418(遗传霉素)、潮霉素B或腐草霉素的抗性。另外，这些载体可含有(组合的)限制性位点序列(多克隆位点或MCS)，这些序列会允许将外源DNA克隆进这些位点内，尽管同时存在替代性的方法。

传统上，可以通过额外的遗传元件的不存在或存在区别四种类型的穿梭载体：

·整合性质粒(YIp)，当宿主基因组中标记物或另一基因的基因座通过限制性消化被打开并使用经线性化的DNA转化酵母细胞时，所述整合性质粒通过同源重组被整合进宿主基因组中标记物或另一基因的基因座处。

·游离质粒(Yep)，其带有在酵母细胞中自主复制所需的2μ质粒DNA序列部分。多拷贝的被转化的质粒在酵母细胞中繁殖，并作为游离保持。

·自主复制质粒(YRp)，其带有允许被转化的质粒被繁殖数百倍的酵母复制起点(ARS，自主复制序列)。

·CEN质粒(YCp)，其除了ARS序列外还带有中心粒序列(源自核染色体之一)，所述中心粒序列通常保证稳定的有丝分裂分离，并且通常将自我复制的质粒的拷贝数减少至仅有一个。

这些质粒通过转化被引入酵母细胞中。酵母细胞的转化可以通过若干不同的技术实现，例如用醋酸锂(Ito et al，1983)和电穿孔方法使细胞通透化。

在重组微生物的商业应用中，质粒不稳定性是最重要的问题。不稳定性是经转化的细胞由于质粒的改变或丢失而失去它们被改造的特性的趋势。这一问题由Zhang et al(质粒stability in recombinant Saccharomycescerevisiae.Biotechnology Advances，Vol.14，No.4，pp.401-435，1996)详细讨论。用整合型质粒转化的菌株是极度稳定的，即使在缺失选择性压力时也是如此(Sherman，F.http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html及其中的参考文献)。

异源DNA通常以染色体外质粒(Yep、YCp和YRp)的形式被引入生物中。不幸的是，已经发现用细菌和酵母新的特征可能不被保持，特别是不持续应用选择压力时。这归因于重组细胞长时间生长时杂种质粒的分离不稳定性(segregational instability)。这导致种群异质性和克隆变异性，并最终得到下述细胞种群，其中大部分细胞丢失了通过转化被引入的特性。如果使用具有营养缺陷型标记物的载体，则在丰富培养基中的培养通常导致载体的迅速丢失，因为载体仅在最小培养基中被保持。或者，显性抗生素抗性标记物的使用通常不与生产方法相容。从注册的观点来看(痕量抗生素存在于终产物中的可能性)或处于经济原因(以工业规模使用抗生素的成本)，抗生素的使用可能不是期望的。

载体的丢失在大规模生产的情况下导致多种问题。对酵母而言，存在用于引入DNA的替代性方法，例如使用整合性质粒(YIp)。DNA通过重组被整合进宿主基因组中，导致高稳定性。(Caunt，P.Stability ofrecombinant质粒s in yeast.Journal of Biotechnology 9(1988)173-192)。我们发现，使用宿主转座子的整合方法是一种好的选择。

转座子

根据本发明，两种至十五种的木糖异构酶基因或木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶被整合进混合糖细胞基因组中。在一种实施方式中，这可以通过本领域已知的导致基因引入的任何方式进行多个拷贝的最初引入(即在适应性进化前)。在一种实施方式中，这可以通过使用下述载体来进行，所述载体具有与宿主细胞的重复序列同源的部分(转座子)。当宿主细胞是酵母细胞时，合适的重复序列是Ty元件的长末端重复(LTR)，已知为δ序列。

Ty元件落入称作Ty1和Ty2的两个相当相似的亚家族中。这些元件长度约为6000个碱基(kb)，并且与约335个碱基对的序列——长末端重复(LTR)结合(Boeke JD et al，The Saccharomyces cerevisiae GenomeContains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1.Molecularand Cellular Biology，Apr.1988，p.1432-1442 Vol.8，No.4)。在经完全测序的S.cerevisiae菌株S288c中，最丰富的转座子是Ty1(31个拷贝)和Ty2(13个拷贝)(Gabriel A，Dapprich J，Kunkel M，Gresham D，Pratt SC，et al.(2006)Global mapping of transposon location.PLoS Genet 2(12)：e212.doi：10.1371/journal.pgen.0020212)。这些转座子由两个重叠的开放读码框(ORF)构成，每个开放读码框编码若干种蛋白质。编码区侧翼是前述接近相同的LTR。S.cereviaise中的其他(但是更丰富并且更不同的)Ty元件包括Ty3、Ty4和Ty5。对全长Ty元件的每个家族而言，存在一个数量级的更加单独的LTR元件分散于基因组中。它们被认为通过全长元件的LTR-LTR重组产生，内部蛋白质编码区成环丢失。

Ty反转录转座子的反转录机制已被用于在基因组中整合多个拷贝(Boeke et al.，1988；Jacobs et al.，1988)。已知为δ序列的Ty元件的长末端重复(LTR)也是通过同源重组整合的良好靶标，因为它们存在于约150-200个拷贝的与Ty结合的或单独的位点中(Boeke，1989；Kingsmanand Kingsman，1988)。(Parekh R.N.(1996).An Integrating Vector forTunable，High Copy，Stable整合into the Dispersed Ty DELTA Sites ofSaccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Prog.1996，12，16-21)。通过适应性进化，可改变拷贝数目。

宿主细胞

宿主细胞可以是适合生产有用产物的任何宿主细胞。宿主细胞可以是任何合适的细胞，如原核细胞如细菌，或真核细胞。典型地，细胞会是真核细胞，例如酵母或丝状真菌。

酵母在本文中被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos，C.J.，1962，In：IntroductoryMycology，John Wiley & Sons，Inc.，New York)。

酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长，或可通过生物的裂变生长。作为混合糖细胞的一种优选的酵母可属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属。优选地，酵母是能够厌氧发酵的酵母，更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。

丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖构成的植物菌丝体。

适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞，因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖，并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、A cremoniurra、Fusarium或Penicillium属。更优选地，丝状真菌细胞可以是Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum或Rhizopus oryzae细胞。

在一种实施方式中，宿主细胞可以是酵母。

优选地，宿主是工业宿主，更优选地是工业酵母。工业宿主和工业酵母细胞可以如下定义。工业方法中酵母细胞的生活环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变，它们一起对Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言，工业酵母菌株通常更加强健。工业酵母(S.cerevisiae)的例子是Ethanol

(Fermentis)、

(DSM)和

(Lallemand)。

在一种实施方式中，宿主是抑制剂耐受的。可以通过针对在含抑制剂的材料上的生长筛选菌株，来选择抑制剂耐受的宿主细胞，如Kadar et al，Appl.Biochem.Biotechnol.(2007)，Vol.136-140，847-858中所述，其中选择了抑制剂耐受的S.cerevisiae菌株ATCC 26602。araA、araB和araD基因

混合糖细胞能够使用阿拉伯糖。因此，混合糖细胞能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的发酵产物，例如本文提到的发酵产物之一。

能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物例如S.cerevisiae菌株可以通过修饰细胞，引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。这类基因可被引入混合糖细胞中，使其能够使用阿拉伯糖。这样的通路描述于WO2003/095627中。来自Lactobacillus plantanum的araA、araB和araD基因可以使用，并公开于WO2008/041840中。来自Bacillus subtilis的araA基因和来自Escherichia coli的araB和araD基因可以使用，并公开于EP1499708中。在另一实施方式中，araA、araB和araD基因可源自Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella中至少一种属，特别是Clavibactermichiganensis、Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii之一，如WO2009011591中所公开的。

PPP-基因

混合糖细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地，遗传修饰可导致通过戊糖磷酸通路的非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰，与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相比，所述修饰将所述通量提高至约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量：在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主，测定木糖消耗的比速率，并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例，优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μ _max)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Q_S)等于生长速率(μ)除以在糖上的生物量产率(Y_XS)，因为在糖上的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下：厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等；即Q_S＝μ/Y_XS)。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高，除非转运(摄取受到限制)。

可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传修饰。这些方式包括例如，实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶更高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或编码酶的基因或调节这些基因的因子的重组DNA技术(例如过表达或失活)来实现。

在一种优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地，所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶构成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如可以被过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛酶；或至少是酶转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一种实施方式中，酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞，其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达，因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上，在一些条件下，仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率，所述宿主细胞过表达所有四种酶，即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外，过表达酶5-磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的，所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶，因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。

酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC 5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸核酮糖(phosphoribulose)异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；磷酸酮戊糖3-差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列或者通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPE1。

酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5-磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸戊糖异构酶；磷酸核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5-磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RKI1。

酶“转酮酶”(EC 2.2.1.1)在本文中被定义为催化下述反应的酶：D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸<->景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸且反之亦然。所述酶也已知为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸：D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通过其氨基酸定义。类似地，转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKL1。

酶“转醛酶”(EC 2.2.1.2)在本文中被定义为催化下述反应的酶：景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸且反之亦然。所述酶还已知为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸：D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，转醛酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转醛酶的核苷酸序列在本文中称作TAL1。

木糖异构酶或木糖还原酶基因

根据本发明，2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因和/或一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶被引入宿主细胞的基因组中。这2种至15种遗传元件的存在赋予细胞通过异构化或还原来转化木糖的能力。

在一种实施方式中，2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因被引入宿主细胞的基因组中。

“木糖异构酶”(EC 5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反过来的酶。所述酶还已知为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可需要二价阳离子如镁、锰或钴作为辅因子。

因此，这样的混合糖细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力，所述核酸构建体包含编码确定的木糖异构酶的核苷酸序列。混合糖细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化为木酮糖。

木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为：在Kuyper et al.(2003，FEMS Yeast Res.4：69-78)所述条件下，每分钟生产1nmol木酮糖的酶的量。木糖异构酶基因可具有多种来源，例如如WO2006/009434中公开的Pyromyces sp.。其他合适的来源是如PCT/EP2009/52623中所述的Bacteroides，特别是Bacteroides uniformis，如PCT/EP2009/052625中所述的Bacillus，特别是Bacillus stearothermophilus。

在另一实施方式中，2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因被引入宿主细胞的基因组中。在所述实施方式中，木糖的转化在两个步骤中进行：分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的，木糖通过木糖醇中间产物转化成木酮糖。在一种实施方式中，木糖还原酶(XR)，木糖醇脱氢酶(XDR)和木酮糖激酶(xylokinase，XK)可以被过表达，任选地一个或多个编码NADPH生产酶的基因被上调，并且一个或多个编码NADH消耗酶的基因被上调，如WO 2004085627中所述。

XKS1基因

混合糖细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的，或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于宿主细胞中木酮糖激酶过表达的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。

酶“木酮糖激酶”(EC 2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖＝ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还被称为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP：D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似地，木酮糖激酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。

在混合糖细胞中，提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合。然而，这不是必需的。

因此，宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。

醛糖还原酶(GRE3)基因缺失

在使用XI作为转化木糖的基因的实施方式中，其可有利地降低醛糖还原酶活性。因此，混合糖细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性，所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地，所述遗传修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝或使其表达失活(本文中称作GRE3缺失)。混合糖细胞可包含由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序列不同并且各自由不同基因编码。还在这类情况下，优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地，通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活，其中在该语境中，术语基因还包括编码序列的上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。

编码要在宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。

因此，仅包含下述一种或多种遗传修饰的宿主细胞明确地包括在本发明中，所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。

酶“醛糖还原酶”(EC 1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何酶。在本发明的语境中，醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源)的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化反应：

所述酶具有广泛特异性并且也已知为醛糖还原酶；多元醇脱氢酶(NADP⁺)；糖醇：NADP氧化还原酶；糖醇：NADP⁺1-氧化还原酶；NADPH-戊醛糖还原酶；或NADPH-醛糖还原酶。

这类非特异性醛糖还原酶的一个具体的例子是对S.cerevisiae内源并且由GRE3基因编码的醛糖还原酶(Traff et al.，2001，Appl.Environ.Microbiol.67：5668-74)。因此，本发明的醛糖还原酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，醛糖还原酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。

序列同一性

当氨基酸序列或核苷酸序列展示某些相似性水平时，其被称为是同源的。同源的两个序列表示共同的进化来源。不论两个同源序列是密切相关的还是更远相关的，其分别由或高或低的“百分比同一性”或“百分比相似性”表示。虽然是有争论的，但为了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”通常互换使用。

术语“同源性”、“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，在本文中定义为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，就最佳比较目的而言比对全序列。为了优化两个序列之间的比对，可在被比较的两条序列的任一条中引入缺口。这类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可在更短的比较长度上进行，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。同一性是在报告的比对区域上两条序列之间的同一性匹配的百分比。

可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和百分比同一性测定。技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序，以比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal，J.B.(1983)An overviewof sequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal，(ed.)，Time warps，string edits and macromolecules：the theory and practice of sequencecomparison，pp.1-44Addison Wesley)。可使用Needleman和Wunsch算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性，用于比对两条序列(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实施。就本发明目的而言，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277，http://emboss.bioinformatics.nl/)。就蛋白序列而言，EBLOSUM62用于替换矩阵，就核苷酸序列而言，使用了EDNAFULL。可指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是缺口开放惩罚为10和缺口延伸惩罚为0.5。技术人员会意识到所有这些不同的参数会产生些微不同的结果，伯是当使用不同的算法时两条序列的总百分比同一性不显著改变。

总体同源性定义

同源性或同一性是在包括任何缺口或延伸的总比对区域上两条全序列之间的同一性匹配的百分比。两条比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两个序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以包括缺口的比对的全长。本文中定义的同一性可从NEEDLE中获得并在程序输出中被标记为“同一性”。

最长的同一性定义

在两个比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两个序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以减去比对中的总缺口数目后的比对的全长。可通过使用NOBRIEF选择从NEEDLE中获得本文中定义的同一性并且所述同一性在程序输出中被标记为“最长同一性”。就本发明目的而言，根据“最长同一性”的定义计算两条序列(氨基酸或核苷酸)之间的同一性(同源性)水平，如可通过使用程序NEEDLE进行计算。

用在本发明中的多肽序列还可用作“查询序列”以针对序列数据库进行搜索，例如来鉴定其他家族成员或相关序列。可使用BLAST程序进行此类搜索。进行BLAST分析的软件通过National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)是公众可得到的。BLASTP用于氨基酸序列，BLASTN用于核苷酸序列。BLAST程序使用下述缺省：

-开放缺口的开销：缺省＝5用于核苷酸/11用于蛋白

-延伸缺口的开销：缺省＝2用于核苷酸/1用于蛋白

-核甘酸错配惩罚：缺省＝-3

-核苷酸匹配奖励：缺省＝1

-期望值：缺省＝10

-字长：缺省＝11用于核苷酸/28用于megablast/3用于蛋白

此外，通过BLAST程序，测定查询氨基酸序列或查询核酸序列与检索的同源序列之间的局部同一性(同源性)程度。但是，仅仅比较在某一阈值上给出匹配的那些序列段。从而，程序仅针对这些匹配段计算同一性。因此，以这种方式计算的同一性被称为局部同一性。

生物制品生产

许多年来，建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度酸-、乙醇-和渗透-耐性，厌氧生长的能力，当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K fragilis。

混合糖细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，混合糖细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。

这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。

用于生产非乙醇发酵产物的混合糖细胞是下述宿主细胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。

在一种实施方式中，混合糖细胞可用在其中源自木质纤维素的糖被转化为乙醇的方法中。

木质纤维素

可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁于物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

预处理

在酶处理之前，可对木质纤维素材料预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多种的组合。所述化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。

酶促水解

通常使预处理的材料经受酶促水解以释放根据本发明可被发酵的糖。这可用常规方法进行，所述常规方法例如与纤维素酶，例如(一种或多种)纤维二糖水解酶、(一种或多种)内切葡聚糖酶、(一种或多种)β-葡糖苷酶和任选地基他酶接触。可在环境温度或更高温度下，在释放足够量的(一种或多种)糖的反应时间下，进行利用纤维素酶的转化。酶促水解的结果是在本文中被命名为糖组合物的包含C5/C6糖的水解产物。

发酵

发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的发酵方法，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能够被氧化磷酸化氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。

因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。

发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分酵母或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42℃、优选地低于约38℃的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。

在所述方法中，在木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率优选地为至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或约98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。

本发明还涉及用于生产发酵产物的方法。

根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。在一种实施方式中，所述方法在微需气(aerophilic)或氧受限的条件下进行。

厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。

氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少7mmol/L/h。本发明的方法可包括发酵产物的回收。

在一种优选的方法中，细胞发酵木糖以及葡萄糖二者，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述细胞，所述细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而防止两阶段生长。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。

发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以针对最适生产力使用这些方法模式的组合。这些方法在下文更详细地描述。

SSF模式

对同时糖化和发酵(SSF)的模式而言，液化/水解或预糖化步骤的反应时间取决于实现期望产率(即纤维素成为葡萄糖的转化产率)的时间。这类产率优选地尽可能高，优选地为60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，甚至99.5％或更多或99.9％或更多。

根据本发明，在SHF模式下实现了非常高的糖浓度，在SSF模式下实现了非常高的产物浓度(例如乙醇)。在SHF操作中，葡萄糖浓度是25g/L或更高，30g/L或更高，35g/L或更高，40g/L或更高，45g/L或更高，50g/L或更高，55g/L或更高，60g/L或更高，65g/L或更高，70g/L或更高，75g/L或更高，80g/L或更高，85g/L或更高，90g/L或更高，95g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，或者可以例如是25g/L-250g/L，30gl/L-200g/L，40g/L-200g/L，50g/L-200g/L，60g/L-200g/L，70g/L-200g/L，80g/L-200g/L，90g/L，80g/L-200g/L。

SSF模式中的产物浓度

在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且糖浓度可以通过与理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps max)相乘而与潜在的葡萄糖浓度相关。

发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps max)可源自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据酵母中正常的糖酵解发酵通路产生2摩尔乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。

对丁醇(MW 74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps max＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。

对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolactic fermentatio)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Ypsmax＝1gr乳酸/gr葡萄糖。

对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。

SSF模式

在SSF操作中，产物浓度为25g*Yps g/L/L或更高，30*Yps g/L或更高，35g*Yps/L或更高，40*Yps g/L或更高，45*Yps g/L或更高，50*Yps g/L或更高，55*Yps g/L或更高，60*Yps g/L或更高，65*Yps g/L或更高，70*Yps g/L或更高，75*Yps g/L或更高，80*Yps g/L或更高，85*Yps g/L或更高，90*Yps g/L或更高，95*Yps g/L或更高，100*Yps g/L或更高，110*Yps g/L或更高，120g/L*Yps或更高，或者可以例如是25*Yps g/L-250*Yps g/L，30*Yps gl/L-200*Yps g/L，40*Ypsg/L-200*Yps g/L，50*Yps g/L-200*Yps g/L，60*Yps g/L-200*Ypsg/L，70*Yps g/L-200*Yps g/L，80*Yps g/L-200*Yps g/L，90*Ypsg/L，80*Yps g/L-200*Yps g/L。

因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：

a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和

b.发酵得到的材料，

从而制备发酵产物。

发酵产物

本发明的发酵产物可以是任何有用的产物。在一种实施方式中，其为选自下组的产物，所述组由以下构成：乙醇，正丁醇，异丁醇，乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，1，3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。例如，遵从现有技术的细胞制备方法和发酵方法，发酵产物可通过根据本发明的细胞生产，但所述制备方法和发酵方法的例子在本文中不应构成限制。例如，正丁醇可由WO2008121701或WO2008086124中描述的细胞生产；如US2011053231或US2010137551中描述的乳酸；如WO2010010291中描述的3-羟基-丙酸；如WO2009153047中描述的丙烯酸；如…中描述的乙酸；如…中描述的琥珀酸；发酵葡萄糖累积胞外延胡酸的延胡索酸酶缺陷型突变体细胞(***注意仍可增加)。

发酵产物的回收

对发酵产物的回收而言，使用现有的技术。对不同的发酵产物而言，适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级(ffactionation)和吸附技术。例如，可以使用发酵醪蒸馏器(beerstill)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以生产富集的含有乙醇的混合物，所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分馏蒸馏(fractional distillation)或其他类似的技术)。接着，含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂，从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。

以下的实施例阐述本发明：

实施例

除非另有说明，此处描述的方法是标准生物化学方法。合适的一般方法教科书的例子包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，a LaboratoryManual(1989)和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。

培养基组成

生长实验：在具有以下组成的培养基上培养Saccharomyces cerevisiae菌株：0.67％(w/v)酵母氮基或合成培养基(Verduyn et al.，Yeast 8：501-517，1992)，和改变的浓度下的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖或木糖，或这些底物的组合(见关于具体细节的例子；浓度以重量对体积(w/v)的％表示)。对于琼脂平板而言，对培养基补充2％(w/v)细菌学琼脂。

乙醇生产

通过在100ml摇瓶中用冰冻储用培养物或来自琼脂平板的单菌落对25ml补充2％葡萄糖的Verduyn-培养基(Verduyn等，Yeast 8：501-517，1992)接种，来制备预培养物。在30℃下定轨摇床(280rpm)中孵育约24小时之后，收获该培养物并用于测定CO₂进展和乙醇生产实验。

在BAM(生物活性监测器，Halotec，荷兰)中，在100ml合成模型培养基(含5％葡萄糖、5％木糖、3.5％阿拉伯糖和1％半乳糖的Verduyn-培养基(Verduyn et al.，Yeast 8：501-517，1992))中于30℃下进行乙醇产生的培养。在灭菌前用2M NaOH/H₂SO₄将培养基的pH调节至4.2。对厌氧培养的合成培养基补充溶于乙醇中的0.42g l^-1 Tween 80和0.01g l^-1麦角固醇(Andreasen和Stier.J.Cell Physiol.41：23-36，1953；和Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.43：271-281，1954)。在大约2的初始OD600下接种培养基。用磁力搅拌器搅拌培养物。因为不对培养物充气，所以发酵期间厌氧条件迅速发展。持续监测CO₂产生。通过NMR分析糖转化和产物形成(乙醇、甘油)。通过在LKB Ultrospec K分光光度计上于600nm下跟踪培养物的光密度来监测生长。

S.cerevisiae的转化

S.cerevisiae的转化如Gietz和Woods所述进行(2002；Transformationof the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Methods in Enzymology350：87-96)。

菌落PCR

用塑料牙签挑取单个菌落隔离群，并重悬于50μl milliQ水中。将样品在99℃下孵育10分钟。使用5μl经孵育的样品作为PCR反应的模板，所述PCR反应使用DNA聚合酶(Finnzymes)根据供应商提供的说明书进行。

PCR反应条件：

第1步    3’         98℃

第2步    10”        98℃

第3步    15”        58℃将第2步到第4步重复30个循环

第4步    30”        72℃

第5步    4’         72℃

第6步    30”        20℃

染色体DNA分离

酵母细胞于旋转式摇瓶(过夜，在30℃和280rpm下于定轨摇床中)中在含2％葡萄糖的YEP-培养基中生长。将1.5ml的这些培养物转移至Eppendorf管并在最大速度下离心1分钟。倒出上清液并将球团再悬浮在200μl的YCPS(10mM Tris.HCl pH 7.5中的0.1％SB3-14(Sigma Aldrich，荷兰)；1mM EDTA)和1μl RNase(来自牛胰脏的20mg/ml RNase A，Sigma，荷兰)中。细胞悬浮液在65℃下孵育10分钟。在Eppendorf离心机中以7000rpm对悬浮液离心1分钟。丢弃上清液。将球团小心地溶解在200μl CLS(25mM EDTA，2％SDS)和1μl RNase A中。在65℃下孵育10分钟之后，悬浮液在冰上冷却。添加70μl PPS(10M醋酸铵)之后，在Vortex混合器中充分混合溶液。离心(在Eppendorf离心机中以最大速度5分钟)之后，上清液与200μl冰冷的异丙醇混合。DNA容易沉淀并通过离心(5分钟，最大速度)成为球团。用400μl冰冷的70％乙醇洗涤球团。在室温下干燥球团并溶解在50μl TE(10mM Tris.HCl pH7.5，1mM EDTA)中。

通过电穿孔转化酵母细胞

通过用单个酵母菌落接种含2％葡萄糖的25ml YEP-培养基，来培养酵母细胞。摇瓶在30℃过夜孵育。

在600nm下测定光密度并且获得0.2的光密度所需的量被转移至含2％葡萄糖的100ml YEP-培养基。细胞培养4至5个小时，以达到约1.2至1.3的光密度，其对应于2至3代。通过离心收集细胞并在28ml TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中再悬浮。添加3ml的1M LiAC溶液(用浓缩的HAc设定pH为7.5)。将细胞在旋转式孵育器(150rpm，30℃)中轻轻摇动45分钟。添加500μl的1M DTT(二硫苏糖醇)溶液后，将细胞再一次在这些条件下孵育15分钟。用无菌冰冷的milliQ水将体积补至100ml。通过离心收集细胞。

丢弃上清液并用50ml的无菌冰冷的milliQ水洗涤球团细胞，并通过离心收集。用30ml的冰冷的1M山梨醇溶液进行随后的洗涤处理。离心之后，丢弃上清液并且在4ml的冰冷的1M山梨醇溶液中再悬浮细胞球团。离心之后，丢弃上清液并且在300μl的冰冷的1M山梨醇溶液中再悬浮细胞球团。

对于每一次转化，将40μl的细胞悬浮液转移至冰冷的Eppendorf管中。添加总共最大体积为20μl的转化的DNA和5μg鲑精DNA(作为载体DNA)。DNA应溶解在TE中。小心地敲打Eppendorf管，以轻轻地将内容物混合。将内容物转移至预冷(在冰上)的具有间隙为0.2cm的电穿孔试管。在1.5kV，200 Ohm和25μF下应用脉冲(使用例如BioRad电穿孔装置)。脉冲时间应在5ms左右。

将细胞立即转移至200μl的1M山梨醇。添加4ml的YEP 2％葡萄糖并在30℃下孵育1小时。通过离心收集细胞，丢弃上清液并在4ml的1M山梨醇中再悬浮球团。通过离心收集细胞，丢弃上清液并在300μl的1M山梨醇中再悬浮球团。适当地稀释细胞并在选择性平板上涂布或在选择性培养基中使用。

在实际水解产物上的酵母应用测试

通过使用试验用广谱纤维素酶制备物，将玉米秸秆和小麦秸的稀酸预处理的样品在60℃下水解3天(72小时)。水解开始时的pH为5.0。水解开始时的干物质含量为10％w/w。

除水解温度为50℃并且水解开始时的干物质含量为13.8％，用于水解预处理的玉米纤维样品的条件基本上相同。

水解后(72小时)，将样品冷却至室温。使用10％NaOH调pH至5.5。随后，添加1毫升的200克/升的(NH₄)₂SO₄和1毫升的100克/升的KH₂PO₄。最后，对应于每千克水解产物1克酵母的酵母干物质含量，添加酵母样品。使用AFM(乙醇发酵监测器；HaloteC Instruments BV，Veenendaal，荷兰)跟踪CO2随时间的进展。在33℃下至少一式三份进行实验72小时。以定时间隔对这些实验之一取样，以能分析乙醇形成和残留糖浓度。这些数据可用来计算发酵产率。对另外两个实验的发酵液不取样。代替地，在发酵结束时，使用Buchi K-355蒸馏装置在45％蒸汽下对发酵液蒸馏15分钟。使用Anton Paar DMA 5000(Anton Paar BeneluxBVBA，Dongen，荷兰)测定产生的乙醇。

定量PCR

进行定量PCR反应以测定在基因组中存在的基因特别是木糖异构酶基因的拷贝数目。为此，使用了来自Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美国)的Bio-Rad iCycler iQ系统。使用了iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。按照提供商指南中所建议的，建立实验。作为用于检测木糖异构酶基因的引物，使用了SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引物，

PCR条件如下：

在95℃下孵育3分钟

40个循环：在95℃下10秒

在58℃下45秒

在72℃下45秒

在95℃下孵育1分钟

在65℃下孵育1分钟

通过在65℃下开始测量荧光10秒测定熔融曲线。每10秒提高温度0.5℃，直到达到温度为95℃。从读数中，可计算和/或估计感兴趣的基因的拷贝数目。如会被本领域技术人员意识到的，就在某一阈值上的拷贝数目的准确测定而言，该方法具有其极限。

实施例1

菌株BIE104A2P1的构建

1.1构建含有阿拉伯糖途径的基因的表达载体

如下构建如图2中所展示的质粒pPWT018：用限制性酶BsiWI和MluI消化载体pPWT006(图1，由SIT2-基因座(Gottlin-Ninfa and Kaback(1986)Molecular and Cell Biology vol.6，no.6，2185-2197)和允许基于抗生素G418和在乙酰胺上生长的能力来选择转化体的标记物(见上文)组成)。从p427TEF(Dualsystems Biotech)分离赋予G418抗性的kanMX-标记物，含有amdS-标记物的片段已在文献中描述(Swinkels，B.W.，Noordermeer，A.C.M.and Renniers，A.C.H.M(1995)The use of the amdScDNA of Aspergillus nidulans as a dominant，bidirectional selectable marker foryeast transformation.Yeast Volume 11，Issue 1995A，page S579；and US6051431)。如专利申请WO2008/041840中公开的来自Lactobacillusplantarum的编码阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(araD)的基因由BaseClear(Leiden，荷兰)合成。合成一个大的片段，其带有位于来自S.cerevisiae的强启动子控制下(或于之可操作地连接)的上文提到的三个阿拉伯糖基因，即TDH3-启动子控制araA-基因的表达，ENO1-启动子控制araB-基因的表达，PGI1-启动子控制araD-基因的表达。该片段被特有的限制性酶Acc65I和MluI包围。将该片段克隆进用MluI和BsiWI消化的pPWT006中，得到质粒pPWT018(图2)。质粒pPWT018的序列在SEQ ID：1中公开。

1.2酵母转化

用质粒pPWT018转化CEN.PK113-7D(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1MAL2-8SUC2)，所述质粒之前已根据供应商的说明用SfiI(New EnglandBiolabs)线性化。在SIT2-基因的5’-侧翼设计合成的SfiI-位点(见图2)。将转化混合物涂布在每ml含100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升：10克酵母提取物，每升20克蛋白胨，每升20克葡萄糖，每升20克琼脂)上。两到四天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。质粒pPWT018的整合指向SIT2-基因座。使用PCR和Southern印迹技术表征转化体。

用SEQ ID：2和SEQ ID：3，和SEQ ID：3和SEQ ID：4所示引物进行指示单拷贝质粒pPWT018的正确整合的PCR反应。使用引物对SEQ ID：2和SEQ ID：3检查了SIT2-基因座上的正确整合。如果质粒pPWT018以多个拷贝被整合(头尾整合(head-to-tail integration))，则SEQ ID：3和SEQID：4的引物对会给出PCR产物。如果不存在后一PCR产物，则表示pPWT018的单拷贝整合。其中单拷贝的质粒pPWT018被整合在SIT2-基因座中的菌株被命名为BIE104R2。

1.3标记物补救(Marker rescue)

为了能够使用相同的选择标记物，用其他构建体转化酵母菌株，必须去除选择性标记物。质粒pPWT018的设计如下：将pPWT018整合在染色体中后，同源序列彼此密切接近。这种设计允许选择性标记物通过这些同源区域的自发性分子内重组而丢失。

营养性生长时会发生分子内重组，尽管以较低的频率发生。这种重组的频率取决于同源性的长度和基因组中的基因座(未公开的结果)。将培养物的亚级分相继转移至新鲜培养基时，分子内重组体会及时累积。

为此，从单个菌落隔离群开始在YPD-培养基(每升10克酵母提取物，每升20克蛋白胨，每升20克右旋糖)中培养菌株BIE104R2。使用25μl过夜培养物接种新鲜的YPD培养基。在至少五次这样的连续转移后，测定培养物的光密度，并将细胞稀释至每ml约5000个的浓度。将100μl细胞悬浮液涂布在含30mM KPi(pH 6.8)、0.1％(NH4)2SO4、40mM氟乙酰胺(Amersham)和1.8％琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上。与菌株BIE104R2的细胞相同(即无细胞内重组)的细胞仍然含有amdS-基因。对这些细胞而言，氟乙酰胺是有毒的。在含有氟乙酰胺的培养基上，这些细胞将不能生长，并且不会形成菌落。然而，如果发生了分子内重组，则丢失了选择性标记物的BIE104R2-变体将能够在氟乙酰胺培养基上生长，因为它们不能将氟乙酰胺转化成抑制生长的化合物。这些细胞会在该琼脂培养基上形成菌落。

使用引物SEQ ID：2和SEQ ID：3，和SEQ ID：4和SEQ ID：5对由此获得的氟乙酰胺抗性菌落进行PCR分析。如果如所预期地发生选择性标记物的重组，则SEQ ID：2和SEQ ID：3的引物会得到条带。因此，带有处于强酵母启动子控制下的基因araA、araB和araD的盒已被整合进宿主菌株基因座的SIT2-基因座中。在这种情况下，使用引物SEQ ID：4和SEQ ID：5的PCR反应应当不能得到PCR产物，因为引物4在应当由于重组而丢失的区域中发挥引物作用。如果使用后一对引物获得了条带，这表明基因组中存在完整的质粒pPWT018，因此未发生重组。

如果SEQ ID：2和SEQ ID：3的引物不得到PCR产物，则发生了重组，但是重组方式是整个质粒pPWT018被重组出基因组之外。不仅选择性标记物丢失，而且阿拉伯糖基因也丢失。事实上恢复了野生型酵母。

对显示与pPWT018的单拷贝整合一致的PCR结果的隔离群进行Southern印迹分析。用EcoRI和HindIII消化菌株CEN.PK113-7D的染色体DNA和正确的重组体(双重消化)。使用CEN.PK113-7D的染色体DNA作为模板，用引物SEQ ID：6和SEQ ID：7制备SIT2-探针。杂交实验的结果展示于图3中。

在野生型菌株中观察到2.35 kb的条带，其与野生型基因的预期大小一致。质粒pPWT018的整合和通过重组部分丢失后，预期有1.06 kb的条带。事实上观察到了这一条带，如图3中所示(第2道)。

(如从图3中可推出的)在Southern印迹上显示正确条带模式的菌株之一是被命名为BIE104A2的菌株。

1.4引入非氧化性戊糖磷酸途径的四个组成型表达的基因

用质粒pPWT080转化组成型表达基因araA、araB和araD的Saccharomyces cerevisiae BIE104A2(图4)。质粒pPWT080的序列在SEQ ID NO：8中展示。在选择单拷贝整合转化体之后，用于转化和选择的程序与上文第1.1、1.2和1.3部分中所述相同。简言之，用经SfiI-消化的pPWT080转化BIE104A2。将转化混合物涂布在每ml含有100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升：10克酵母提取物，每升20克蛋白胨，每升20克右旋糖，每升20克琼脂)上。

两到四天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中未添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。

质粒pPWT018的整合指向GRE3-基因座。使用PCR和Southern印迹技术表征转化体。使用引物对SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10通过PCR检查pPWT018在GRE-3-基因座处的正确整合，并且引物对SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11用来检测质粒pPWT018的单拷贝整合或多拷贝整合。对于Southern分析，使用扩增S.cerevisiae的RKI1-基因的一部分的SEQID NO：12和SEQ ID NO：13，通过PCR制备探针。除了天然的基因，获得由于质粒pPWT018的整合而导致的额外的信号(数据未显示)。

显示与预期的杂交模式一致的单拷贝质粒pPWT080正确整合的转化体被命名为BIE104A2F1。为了去除通过质粒pPWT080的整合引入的选择标记物。从单个菌落隔离群开始在YPD-培养基中培养菌株BIE104A2F1。使用25μl过夜培养物接种新鲜的YPD培养基。五次连续转移后，测定培养物的光密度，并将细胞稀释至每ml约5000个的浓度。将100μl细胞悬浮液涂布在含30mM KPi(pH 6.8)、0.1％(NH4)2SO4、40mM氟乙酰胺(Amersham)和1.8％琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上。使用引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10对氟乙酰胺抗性菌落进行PCR分析，并且在正确的PCR谱的情况下，再次使用RKI1-基因的探针，进行Southern印迹分析，以证实正确整合。在Southern印迹上显示正确条带模式的菌株之一是被命名为BIE104A2P1的菌株。

实施例2

在摇瓶中的适应性进化导致BIE104A2P1c和BIE201

2.1适应性进化(需氧)

使用菌株BIE104A2P1的单菌落隔离群接种补充有2％半乳糖的YNB-培养基(Difco)。将预培养物在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞并接种于0.2的起始OD 600下的含1％半乳糖和1％阿拉伯糖的YNB培养基中(图5)。细胞在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下培养。有规律地监测600nm下的光密度。

当光密度达到5的数值时，将一小份培养物转移至含有相同培养基的新鲜YNB培养基中。添加的细胞量使得培养物的初始OD 600为0.2。再次达到5的OD 600后，将一小份培养物转移至含2％阿拉伯糖作为惟一碳源的YNB培养基上(如图5中(1)所示事件)。

转移至含2％阿拉伯糖作为惟一碳源的YNB上后，可以在约两周后观察生长。当600nm处的光密度达到至少1的数值后，将细胞以0.2的起始OD 600转移至含有补充有2％阿拉伯糖的新鲜YNB培养基的摇瓶中(图5，28天)。

将连续转移重复三次，如图5中所示。得到的能够在阿拉伯糖上快速生长的菌株被命名为BIE104A2P1c。

2.2适应性进化(厌氧)

在需氧条件下在阿拉伯糖上适应生长后，将来自菌株BIE104A2P1c的单个菌落接种进补充有2％葡萄糖的YNB培养基中。将预培养物在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞，并以0.2的初始OD⁶⁰⁰接种于含2％阿拉伯糖的YNB培养基中。用水封(waterlocks)闭合摇瓶，确保从培养基和液面上空间(head space)耗尽氧后厌氧的生长条件。达到3的OD 600最小值后，每次在0.2的初始光密度OD⁶⁰⁰值下，将一小份培养物转移至含2％阿拉伯糖的新鲜YNB培养基上(图6)。

若干次转移后，将得到的菌株命名为BIE104A2P1d(＝BIE201)。

实施例3

菌株BIE201X9的构建

3.1菌株BIE201的转化

用质粒pPWT042转化菌株BIE201。质粒pPWT042的物理图谱在图7中示出。质粒pPWT042(SEQ ID NO：14)含有4630bp的插入片段，所述插入片段含有经密码子对优化的在TPI1启动子控制下的来自Bacteroidesuniformis的xylA-基因和在TDH1-启动子控制下的来自S.cerevisiae的XKS1-基因。在转化BIE201之前，使用限制性酶SfiI，根据供应商提供的说明书将pPWT042线性化。将转化混合物涂布在每ml含有100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升10克酵母提取物，每升20克蛋白胨，每升20克右旋糖，每升20克琼脂)上。

两到四天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。

用SfiI消化质粒pPWT042后，其整合指向基因组中的SIT4-基因座(Gottlin-Ninfa and Kaback(1986)Molecular and Cellular Biology Vol.6，No.6，2185-2197)。用SEQ ID NO’s 15和16(pPWT042在SIT4-基因座处正确整合)，和SEQ ID NO’s 16和17(仅在多拷贝整合的情况下出现条带)表示的引物，使用

DNA聚合酶(Finnzymes)，进行指示质粒pPWT042的单拷贝的正确整合的PCR反应。具有整合进基因组中的单拷贝质粒pPWT042的菌株被命名为BIE201Y9。

3.2标记物补救

为了去除通过质粒pPWT042的整合引入的选择标记物，进行下述步骤。质粒pPWT042的设计是这样的，当pPWT042整合进染色体时，同源的序列彼此紧密接近。该设计允许选择性标记物通过这些同源区的自发分子内重组而被丢失。营养生长时会发生分子内重组，尽管以低的频率发生。该重组的频率取决于同源性长度和基因组中的基因座(未公布结果)。当将培养物的亚级分连续转移至新鲜培养基时，分子内重组体会及时累积。

为此，从单菌落隔离群开始，在YPD-2％葡萄糖中培养菌株BIE201Y9。使用25μl的过夜培养物接种新鲜的YPD-2％葡萄糖培养基。连续5次转移后，测定培养物的光密度，并将细胞稀释至每ml约5000个的浓度。将100μl细胞悬浮液涂布在含有30mM KPi(pH 6.8)、0.1％(NH4)2SO4、40mM氟乙酰胺(Amersham)和1.8％琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上。与菌株BIE201Y9的细胞相同的，即没有分子内重组的细胞仍含amdS-基因。对于这些细胞，氟-乙酰胺是有毒性的。这些细胞将不能生长并不会在含氟-乙酰胺的培养基上形成菌落。但是，如果发生了分子内重组，已丢失选择性标记的BIE201Y9-变体将能在氟-乙酰胺培养基上生长，因为它伯不能将氟-乙酰胺转化成生长抑制性化合物。这些细胞将在这种琼脂培养基上形成菌落。

使用SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，和SE ID NO：17和SEQ IDNO：18的引物，使因此获得的氟-乙酰胺抗性菌落经受PCR分析。如果选择性标记的重组如预期的发生，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物会给出条带。结果，基因xylA和XKS1已被整合进SIT4-基因座。在那种情况下，使用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引物进行PCR反应不会导致PCR产物，因为引物17在重组出基因组的区域中起引物作用。如果条带是用这些引物获得的，表示完整的质粒pPWT042在基因组中存在，因此没有发生重组。

如果SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物不导致PCR产物，重组已发生，但是以完整的质粒pPWT042在基因座的外部重组的方式发生，不仅仅选择性标记物丢失，xylA-和XKS1-基因也丢失了。事实上，已恢复了野生型酵母。

使展示了期望PCR结果的隔离群经受Southern印迹分析(见上文)。将在Southern印迹上显示正确条带谱的菌株之一命名为BIE201X9菌株

实施例4

菌株BIE252的构建和选择

4.1xylA-表达盒的扩增

为了将额外拷贝xylA-基因引入基因组中，用质粒pPWT042作为模板，并用有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的寡核苷酸作为引物，使用DNA聚合酶(Finnzymes)进行PCR反应。使用这些引物，扩增包含TPI1-启动子、密码子对优化的xylA-基因和PMA1-终止子的xylA-表达盒。引物设计使得PCR片段的侧翼与酵母转座子Ty-1的δ序列的共有序列同源。这些序列可从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得并使用允许比对的软件包，例如Clone Manager 9 Professional Edition(Scientific &Educational Software，Cary，USA)进行比对。

xylA-表达盒不含有使用其进入基因组的整合可被选择的选择性标记物。为了估计转化频率，用kanMX-标记物进行第二对照转化。为此，使用对应于SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物，在PCR反应中扩增来自质粒p427TEF(Dualsystems Biotech)的kanMX-表达盒。

4.2 BIE201X9的转化

用包含30μg xylA-表达盒(命名为X18-Ty1)或10μg kanMX-表达盒的片段，根据电穿孔方案(如上所述)，转化BIE201X9。将kanMX-转化混合物涂布在每ml含有100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升：10克酵母提取物，每升20克蛋白胨，每升20克右旋糖，每升20克琼脂)上。两到四天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。转化频率显现出高于每μg的kanMX-表达盒600个菌落。

X18-Ty1转化混合物用来接种含有100ml的补充2％木糖的Verduyn培养基的摇瓶。作为对照，使用了转化的阴性对照(即，在转化实验中没有添加DNA)。在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下孵育摇瓶。通过测量在常规基线上的在600nm下的光密度，来跟踪生长。

生长曲线的结果在图8中描绘。可以看出，在20天和25天之间，X18-Ty1摇瓶的光密度引人注意地增加，而仍没有阴性对照的生长。在第25天，从X18-Ty1培养物中对含有补充2％木糖的新鲜Verduyn培养基的摇瓶接种，至600nm下的开始光密度为0.15。从图8中清楚地看出，当再接种时，培养物在木糖上立即且快速地开始生长。因为有可能培养物由继代培养物的混合物组成，所述继代培养物因而由有X18-Ty1表达盒的拷贝数目差异和在木糖上的生长速率差异的细胞组成，将细胞在milliQ水中稀释并在YPD-琼脂平板上涂布，以得到单菌落隔离群。这对其利用不同碳源的能力测试单菌落隔离群。

4.3选择菌株BIE252

为了选择在作为唯一碳源的木糖上已获得改进生长而不会丢失其利用其他重要糖(葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖)的能力的菌株，将适应性进化的10个单菌落隔离群在YPD-琼脂上再次划线分开。随后，在补充2％葡萄糖的YPD-培养基上进行预培养。将10个培养物在30℃和280℃下过夜孵育。每个培养物的小份试样用来以0.15的初始光密度接种补充2％葡萄糖或2％木糖或2％阿拉伯糖或2％半乳糖的新鲜Verduyn培养基。作为对照，菌株BIE201、BIE201X9和混合种群(从其重新获得10个单菌落隔离群)包括在实验中。在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下培养细胞。基于600nm下的光密度测量值，评定生长。孵育19小时后在600nm下的光密度结果在图9中列出。

图9结果显示了，混合培养物和10个单菌落分离群都在木糖上展示了在600nm下的更高的最终光密度。尽管这些菌株在作为唯一碳源的阿拉伯糖上生长，但是较之亲本菌株BIE201和BIE201X9，在接种19小后，在600nm下的最终光密度更小。延长生长若干天后，选择菌落3，因为其较之其他单菌落隔离群培养物已达到了最高光密度(数据未显示)。在所有测试的菌落中在木糖上的生长是没有差异的。

稀释菌落3培养物并在YPD-琼脂上涂布。针对其在补充2％阿拉伯糖或2％木糖的Verduyn培养基上生长的能力测试11个单菌落隔离群。为此，在Verduyn 2％葡萄糖上进行预培养。在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下过夜培养。将一个等分式样以0.15的初始光密度转移至补充2％阿拉伯糖或2％木糖的Verduyn培养基。作为对照的菌落3的培养物包括在该测试中，在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下过夜培养细胞。基于600nm下的光密度测量值，评定生长。孵育4天后在600nm下的光密度结果在图10中列出。

结果显示了，在木糖上，菌落3.7已达到了类似于对照菌落3培养物的光密度。此外，较之菌落3的培养物，其在作为唯一碳源的阿拉伯糖上生长的能力已有很大改进。其他单菌落隔离群还显示了明显地在木糖上生长的能力消耗下在阿拉伯糖上的改进生长，单菌落隔离群3.7的培养物被命名为菌株BIE252。遵循在于2011年4月19日提交的要求EP10160647.3的权益的共同待决PCT申请中描述的相同步骤，测定在BIE252中的SNP和扩增。这些测试显示了BIE252具有SNP：在SSY1基因中的G1363T、在YJR154w基因中的A512T、在CEP3基因中的A1186G和在GAL80基因中的A436C。这些与BIE201相同。在BIE201中存在的染色体VII的扩增也在BIE252中存在。这在图23中示出。

实施例5

BAM中的性能测试

为了测试选择的菌株BIE252的性能，在补充2％葡萄糖的Verduyn培养基中接种菌株。作为对照，包括了菌株BIE201和BIE104P1Y9mc。前者是能发酵葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖(见上文)的菌株，后者是能发酵葡萄糖、半乳糖和木糖的菌株。

在定轨摇瓶中在30℃和280rpm下过夜后，通过离心收获细胞并在BAM(Biological Activity Monitor)中在33℃下在补充5％葡萄糖、5％木糖、3.5％阿拉伯糖和1％半乳糖的100ml Verduyn培养基中进行针对CO₂产生的培养。在第一个实验——分批实验中，将细胞添加至补充糖的100ml Verduyn培养基中。在第二个实验——补料分批实验中，以3ml/分钟的速率将补充糖的100ml Verduyn培养基添加至细胞中。在一定间隔下持续监测CO₂产生，并取样用于分析(在600nm下的光密度，乙醇，残留糖)。在BAM实验开始之前，基于光密度，以1∶1的比率混合菌株BIE201和BIE104P1Y9mc。

BAM实验的结果在图11、12、13、14、15和16中示出。

在补料分批模式(图11)中的混合菌株(BIE201和BIE104P1Y9mc)的性能显示了尽管木糖和阿拉伯糖已在进料(约33hr下)结束之前随着时间累积到一定程度，但是消耗速率比进料速率快。72小时后，所有阿拉伯糖已被转化，而木糖未完全消耗。葡萄糖和半乳糖仍在或接近检测水平处，显示了这些糖比戊糖阿拉伯糖和木糖是优先的。

如在BAM中的补料分批模式(见图12)中测试的菌株BIE252的性能显示了与混合的菌株培养物基本上相同的特征。但是，阿拉伯糖和木糖累积到更高的浓度，而随后向乙醇的转化以更高的速率发生，这导致了相同的乙醇滴度和120小时后相同的累积的CO₂产生。

在分批模式中，分批模式中的混合菌株(BIE201和BIE104P1Y9mc)的性能显示了，在发酵试验开始后葡萄糖容易被消耗(图14)。随后，半乳糖、阿拉伯糖和木糖被一起发酵。约30小时后，消耗了半乳糖。约72小时后，阿拉伯糖也被全部消耗。都显著有助于CO₂和乙醇形成。在阿拉伯糖耗尽后，木糖消耗和因而的乙醇和CO₂产生显著减慢。在这方面菌株BIE252表现的更好(图15)。葡萄糖耗尽在10个内后，半乳糖、阿拉伯糖和木糖立即快速有效地共发酵。甚至在半乳糖耗尽后，戊糖阿拉伯糖和木糖二者完全共发酵，都有助于CO₂产生和乙醇形成。在菌株BIE252的情况下，在约72小时后完成所有糖的发酵。如在图16中所示的，这较之混合的菌株培养物(BIE201和BIE104P1Y9mc)，导致菌株BIE252的更高的累积CO₂产生。

实施例6

在实际的水解产物中的性能测试

使用在含补充2％葡萄糖的YEP培养基的摇瓶中过夜培养的菌株BIE252，进行实际水解产物中的性能测试。通过离心收获在50克干物质/升的浓度下再悬浮的细胞。

测试的原料由分批次的玉米纤维、玉米秸秆和小麦秸组成。如在材料和方法部分中描述的，进行水解和发酵。

结果在图17(玉米纤维)、18(玉米秸秆)和19(小麦秸)中列出。在具有相对低量的半乳糖和阿拉伯糖但主要由葡萄糖和木糖组成的原料——玉米秸秆和小麦秸的情况下，所有的糖在72小时内被转化为CO₂和乙醇。在玉米纤维的情况下(图17)，有相对低残留量剩余的阿拉伯糖、半乳糖和木糖。

在下表中，基于在水解结束时释放的糖和在发酵结束时产生的乙醇量，计算了发酵的产率。

表2：针对不同的木质纤维素原料，BIE252的BAM发酵释放的总糖(g/l)、产生的乙醇(g/l)和乙醇产率(g_乙醇/g_糖)

*(在开始发酵时释放的单体糖)

基于如通过Anton Paar DMA 5000密度计测量测定的在发酵结束时产生的乙醇量，和使用的预处理原料的量，计算了总水解和发酵的产率。这些数字在表3中示出。

表3针对不同的木质纤维素原料，BIE252的BAM发酵的总水解和发酵产率(每吨干物质的乙醇的加仑)

实施例7

菌株BIE252的稳定性测试

7.1菌株BIE252的稳定性

为了测试菌株BIE252的稳定性，使用单菌落隔离群来接种25ml的YEP 2％葡萄糖。在600nm下测量培养物的光密度。在旋转式摇床中在30℃和280rpm下过夜孵育培养物。

过夜孵育后，测定光密度。基于孵育之前和之后的OD⁶⁰⁰值，计算在孵育期间所进行的传代数目。将25μl的过夜培养物用来接种含25ml新鲜培养基的摇瓶。如上所述的在相同条件下再次孵育培养物。重复该步骤直到获得培养物，所述培养物中除最初单菌落隔离群之外，细胞为至少一百代。选择补充2％葡萄糖的YEP培养基，因为在这些条件下，没有应用选择压，用于保持在转化阿拉伯糖和木糖所需的在菌株BIE252中引入的基因。

稀释至少100代后所获得的细胞培养物并涂布在YPD-琼脂上。在2％葡萄糖的Verduyn-培养基中接种两个单菌落分离群。作为对照，同取亲本菌株BIE252。在旋转式摇床中在30℃和280rpm下过夜孵育培养物。一小份的过夜培养物用来以0.15的开始光密度接种含有25ml的补充1％葡萄糖、1％木糖、0.7％阿拉伯糖、0.3％半乳糖和0.1％甘露糖的Verduyn培养基。以定时间隔，取样用于分析：在600nm下的光密度测量值，和用于通过NMR测定残留糖。如图20a (在稳定性测试之前的BIE252培养物)、20b(来自超过100代后的BIE252菌落的培养物)和20c(来自超过100代后的BIE252的第二菌落的培养物)，显示了在测试的条件下三种菌株培养物的行为实际上是相同的。换句话说，在该生长培养基中的性能已没有改变；在超过100代的培养后，菌株仍能以相同的速率利用五种不同的糖，这表示菌株在遗传上是稳定的。

此外，进行了定量PCR(Q-PCR)实验，以评定在补充2％葡萄糖的YEP培养基中的在100代培养之前和之后的BIE252的拷贝数目。使用来自Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美国)的Bio-Rad iCycler iQ系统，进行Q-PCR分析。使用了iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。如提供商的指导建议的建立实验。

通过测定编码木糖异构酶的xylA基因的拷贝数目，评定菌株BIE252的稳定性。作为对照单拷贝基因，选择了ACT1基因。

用于检测基因xylA和ACT1的引物是：

正向引物xylA    SEQ ID NO 23

反向引物xylA    SEQ ID NO 24

正向引物ACT1    SEQ ID NO 25

反向引物ACT1    SEQ ID NO 26

结果显示，相对于ACT1基因，BIE252的拷贝数目为约8个拷贝的xylA基因。在补充2％葡萄糖的YEP-培养基上100代培养之前和之后测定拷贝数目并且将定量PCR分析的极限考虑进去，拷贝数目好像基本上相同。

分离在补充2％葡萄糖的YEP培养基中的100代培养之前和之后的若干菌落的染色体DNA。通过XbaI切割染色体DNA。引物对SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的产物作为探针，使用PCR，进行Southern印迹分析。得到的放射自显影图显示，条带谱没有改变，这表示在非选择性条件下在100代生长后，菌株在遗传上是稳定的。

比较试验A

7.2用Yep和YCp载体转化的BIE201X9的稳定性

用载体pPWT148(YCp质粒)和pPWT 152(YEp质粒)转化菌株BIE201X9。质粒pPWT148的物理图谱在图21中示出。质粒pPWT152的物理图谱在图22中示出。转化混合物在每ml含有100μg G418(SigmaAldrich)的YPD-琼脂(每升：10克酵母提取物，每升20克的蛋白胨，每升20克的右旋糖，20克琼脂)上涂布。2至4天后在平板上出现菌落，而阴性对照(即在转化实验中没有添加DNA)产生了空白YPD/G418-平板。

每次转化的三个菌落用作测试稳定性的混合物。为此，混合的菌落用来接种补充2％葡萄糖和100μg G418/ml的YEP培养基。在旋转式摇床中在30℃和280rpm下过夜孵育细胞。在600nm下测量光密度。过夜培养物用来接种补充2％葡萄糖的新鲜YEP培养基和补充100μg G418/ml的相同培养基，至600nm下的开始光密度为0.02。基于在文献(见上文)中报道的，期望细胞在存在G418时(即应用选择性压力)培养，大多数细胞会在细胞内部保留质粒。但是，缺乏G418时，细胞被期望快速丢失其质粒。

在旋转式摇床中在30℃和280rpm下过夜孵育培养物。在600nm下测量光密度。基于光密度测量值，对在两种培养基(即有和没有G418)二者中已进行8代的培养物计算。进行稀释并在有和没有100μg G418/ml的YPD-平板上涂布。将平板在30℃下孵育约2天或根据需要孵育更长时间，以制造可见的且可计数的菌落。

此外，将25μl的过夜培养物用来接种25ml的补充2％葡萄糖的新鲜YEP培养基和补充100μg G418/ml的相同培养基。在旋转式摇床中在30℃和280rpm下过夜孵育培养物。在600nm下测量光密度。基于光密度测量值，对在两种培养基(即有和没有G418)二者中已进行8个额外代的培养物计算。进行稀释并在有和没有100μg G418/ml的YPD-平板上涂布。将平板在30℃下孵育约2天或根据需要孵育更长时间，以制造可见的且可计数的菌落。

基于在有和没有G418的YDP-琼脂上计数的菌落，可在存在或不存在G418时在8代和16代后计算稳定性。结果总结在表4中。

表4：比较试验A的菌株的稳定性(G418抗性菌落％)

从该表中，可以看出，即使在培养期间应用选择压(在这种情况下通过添加G418至培养基)，YCp-质粒和YEp-质粒二者(即分别为pPWT148和pPWT152)在转化的酵母细胞中不都是稳定保持的。但必须注意，在没有选择压的情况下，质粒丢失严重得多。

该实验结合实施例7，提供了这样的理解，木糖异构酶基因染色体整合进基因组对获得稳定酵母转化体而言是必须的。

实施例8

GAL80的缺失导致更好的阿拉伯糖转化

在实施例4中，其显示GAL80基因中的鉴定的SNP对在阿拉伯糖上的生长具有正面的加性作用，如果也存在染色体VII的一部分扩增的话。

GAL80编码参与响应半乳糖转录抑制物转录调节的转录抑制物(Timson DJ等.(2002)Biochem J 363(Pt 3)：515-20)。结合Gal4p和Gal3p，Gal80p协作调节在它伯的启动子(UAS-GAL)中包含GAL上游活性位点的基因的表达，其包括GAL代谢基因GAL1、GAL10、GAL2和GAL7(LohrD等.(1995)FASEB J 9(9)：777-87综述)。就gal80而言无表面标记的细胞组成型表达GAL基因，即使在非诱导培养基中(Torchia TE等.(1984)MolCell Biol 4(8)：1521-7)。

假设在GAL80基因中鉴定的SNP影响Gal80p、Gal3p和Gal4p之间的相互作用。因此，与具有野生型GAL80等位基因的酵母细胞相比较，半乳糖代谢基因，包括编码半乳糖通透酶的GAL2的表达也将改变。Gal2p(半乳糖通透酶)是用于阿拉伯糖的主要糖运输蛋白(Kou等(1970)J Bacteriol.103(3)：671-678；Becker和Boles(2003)Appl Environ Microbiol.69(7)：4144-4150)。

明显地，GAL80基因中的SNP对转化L-阿拉伯糖的能力具有正面作用。为了调查是否可进一步改进阿拉伯糖生长表型，使用PCR-介导的基因置换策略整体删除GAL80基因的编码序列。

8.1 GAL80基因的破坏

使用引物SEQ ID NO 58和59(分别是正向和反向引物)用于扩增来自质粒p427-TEF(Dualsystems Biotech，Schlieren，瑞士)的kanMX-标记物。引物的侧翼与GAL80基因的5’-区域和3’-区域同源。与Wach(Wach等(1994)Yeast 10，1793-1808)描述的类似，一旦同源重组，GAL80基因的ORF将被kanMX标记物置换。获得片段被命名为GAL80::kanMX片段。

根据Gietz和Woods (2002，Methods in Enzymology 350：87-96)描述的方案用纯化的GAL80::kanMX片段，进行菌株BIE252的酵母转化。菌株BIE252的构建已经描述在EP10160622.6中。菌株BIE252是S.cerevisiae的木糖和阿拉伯糖发酵菌株，其是BIE201的衍生物。菌株BIE252也包含GAL80SNP。

将转化的细胞在包含用于选择的100μg/ml G418的YEPD-琼脂上涂布。在30℃下孵育平板直到菌落可见。包括作为阳性对照的质粒p427-TEF并产生许多菌落。包括作为阴性对照的MilliQ(即没有DNA)并且不产生菌落。GAL80::kanMX片段产生许多菌落。通过Southern印迹验证两个独立的菌落，以便验证正确的整合(数据未显示)。具有正确缺失GAL80基因的菌落被命名为BIE252ΔGAL80。

8.2 GAL80基因置换对BAM性能的作用

进行BAM (Biological Activity Monitor；Halotec BV，Veenendaal，荷兰)实验。菌株BIE252和菌株BIE252ΔGAL80(其中GAL80基因的ORF被kanMX标记物正确置换的转化体)的单菌落隔离群用来接种补充2％葡萄糖的Verduyn培养基(Verduyn等，Yeast 8：501-517，1992)。预培养物在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞并在合成模拟培养基(补充5％葡萄糖、5％木糖、3.5％阿拉伯糖、1％半乳糖和0.5％甘露糖的Verduyn培养基，pH 4.2)中以每kg培养基1g干重的细胞密度接种。持续监测CO₂产生。通过NMR分析糖转化和产物形成。数据表示在指示的时间点下糖的残留量(葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和木糖，以g/L表示)，以及副产物的形成(乙醇、甘油等等)。通过在600nm下跟踪培养物的光密度来监测生长。实验进行约72小时。

数字在图23(BIE252)和24(BIE252ΔGAL80)中展示。

实验清楚地显示参照菌株BIE252快速转化葡萄糖和甘露糖。在葡萄糖耗尽后(10小时左右)，开始木糖和阿拉伯糖的转化。一些半乳糖已经在约10小时左右的时间点发酵，其可能是由于在该菌株中的GAL80 SNP，所述GAL80 SNP可允许(部分)同时利用葡萄糖和半乳糖。在实验结束时，72小时左右，几乎所有的糖(约99％)被转化。获得了每克糖0.37克乙醇的乙醇产量。

菌株BIE252ΔGAL80比菌株BIE252展示更快的糖转化能力。而且在该菌株的情况下，甘露糖和葡萄糖在发酵的第一小时中被转化。但是，与菌株BIE252相反，在该转化体中，有葡萄糖、半乳糖和甘露糖与阿拉伯糖和尤其是木糖的一些共同消耗。一般而言，糖消耗更快，导致更充分地使用所有可利用的糖。这也可从随着时间的CO₂进展中显而易见。在BIE252的情况下，观察到第一个峰，其基本上是由葡萄糖和甘露糖形成的CO₂。在到达仅仅高于10ml/hr的最低点(图20)时，观察到第二个更平的峰。但是，如从NMR的糖分析中显而易见的，在BIE252ΔGAL80的情况下(图21)，第二个峰作为第一个峰的尾部出现，这归因于加强的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的共同使用。在亲本菌株BIE252中，不同的糖的使用是更加持续的。因此，菌株BIE252ΔGAL80的产量在实验结束时(72h)更高：每克糖0.40克的乙醇。

总之，如在菌株BIE252中验证的，GAL80基因ORF的缺失导致性能进一步改进。

Claims (15)

1.适于从包含葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖的糖组合物中生产一种或多种发酵产物的细胞，其中所述细胞包含2至15个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因或2至15个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，以及2至10个拷贝的araA、araB和araD基因，其中，这些基因被整合进细胞基因组中。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞能将90％或更多的可利用的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖转化为发酵产物。

3.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞具有GAL80基因的打断或缺失。

4.根据权利要求1-3任一项的细胞，其中所述细胞是Saccharomyces属，任选地是Saccharomyces cerevisiae种的细胞。

5.根据权利要求1-4任一项的细胞，其中所述细胞包含过表达的PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1。

6.根据权利要求1-5任一项的细胞，其中所述细胞包含XKS1-基因。

7.根据权利要求1-6任一项的细胞，其中缺失醛糖还原酶基因。

8.根据权利要求1-7任一项的细胞，其中对所述细胞而言外源性的所有基因被整合进细胞的基因组中。

9.根据权利要求1-8任一项的细胞，其中所述基因通过如下被引入所述细胞中：

向宿主细胞中引入：

a)处于强组成型启动子控制下的由基因araA、araB和araD构成的簇，

b)任选地处于强组成型启动子控制下的由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1构成的簇，并缺失醛糖还原酶基因；

c)处于强组成型启动子控制下的由xylA-基因和XKS1-基因组成的簇；

d)处于强组成型启动子控制下的包含xylA基因的构建体，其能在多个基因座上整合进基因组中；

并进行混合糖构件体的适应性进化，以产生混合糖细胞。

10.根据权利要求9的细胞，其中所述细胞是抑制剂抗性细胞。

11.根据权利要求9或10的细胞，其中所述细胞是工业细胞。

12.由包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，其中用根据权利要求1-11任一项的混合糖细胞发酵所述糖组合物。

13.根据权利要求12的方法，其中通过：

a)预处理一种或多种木质纤维素材料以产生经预处理的木质纤维素材料；

b)酶处理所述经预处理的木质纤维素材料以产生所述糖组合物，

由木质纤维素材料生产所述糖组合物。

14.根据权利要求12或13的方法，其中所述发酵是厌氧进行的。

15.根据权利要求12-14任一项的方法，其中所述发酵产品选自由下述组成的组：乙醇；正丁醇；异丁醇；乳酸；3-羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；琥珀酸；延胡索酸；苹果酸；衣康酸；马来酸；柠檬酸；己二酸；氨基酸，诸如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；1，3-丙二醇；乙烯；甘油；β-内酰胺抗生素和头孢菌素；维生素；药物制剂；动物饲料添加剂；专用化学品；化学原料；塑料；溶剂；燃料，包括生物燃料和生物气或有机聚合物；和工业酶，比如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。

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