CN104178443B - 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104178443B
CN104178443B CN201310198953.9A CN201310198953A CN104178443B CN 104178443 B CN104178443 B CN 104178443B CN 201310198953 A CN201310198953 A CN 201310198953A CN 104178443 B CN104178443 B CN 104178443B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
escherichia coli
coded
genes
enhancing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310198953.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104178443A (zh
Inventor
张学礼
朱欣娜
徐洪涛
谭在高
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201310198953.9A priority Critical patent/CN104178443B/zh
Priority to CA2913197A priority patent/CA2913197C/en
Priority to PCT/CN2014/078284 priority patent/WO2014187357A1/zh
Priority to US14/891,776 priority patent/US10006063B2/en
Priority to EP14800490.6A priority patent/EP3006556B1/en
Priority to JP2016514268A priority patent/JP6191061B2/ja
Publication of CN104178443A publication Critical patent/CN104178443A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104178443B publication Critical patent/CN104178443B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C12Y108/01004—Dihydrolipoyl dehydrogenase (1.8.1.4), i.e. lipoamide-dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有如下的一或多种修饰：a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因的活性增强，b)sthA基因的活性增强,和c)突变的lpdA基因。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，以及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。

Description

生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用
发明领域
本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产丁二酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二酸的方法。
发明背景
丁二酸又称作琥珀酸，是一种优秀的平台化合物，在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途，被美国能源部列为未来12种最有价值的平台化合物之一(McKinlay etal.2007,Appl Microbiol Biotechnol76:727-740)。丁二酸目前主要应用于酯化溶剂、除冰装置、发动机冷却剂、食品香精、水处理化学品等。丁二酸还可以用于生产很多下游产品，如1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。另外，丁二酸和1,4-丁二醇聚合能得到PBS(聚丁二酸丁二醇酯)塑料，其是一种性能优良的生物全降解塑料。据估计丁二酸未来的市场潜力每年将超过270万吨。大约有250种可以用苯为原料生产的化工产品都可以通过丁二酸为原料生产(McKinlay et al.2007,Appl Microbiol Biotechnol76:727-740)。
目前丁二酸的生产主要是基于顺酐为原料的石油化工路线。石油价格近年来波动很大，这严重制约了丁二酸生产的可持续性和价格稳定。另一方面，化学合成法工艺复杂且常需高温高压，这大大增加了生产所需的能耗物耗；同时化学合成还会造成严重的环境污染。开发丁二酸的高效生物制造技术能从根本上解决石油化工路线的弊端：保证丁二酸价格稳定不受制于石油价格波动，降低PBS塑料的制造成本，促进其进一步的推广应用；实现绿色可持续生产、简化生产工艺、节能减排、减少环境污染。另外，丁二酸的生物制造过程中还可以吸收二氧化碳，对实现低碳经济具有很好的促进作用。丁二酸生物制造技术的核心就是能够将生物质原料高效转化为丁二酸的微生物菌株。
目前丁二酸发酵菌种主要有两大类。第一类是天然产丁二酸菌，主要有产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)(Guettler et al.1996,US PatentNo.5504004)、产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)(Glassnerand Datta1992,US Patent No.5143834)、产丁二酸曼海姆菌(Mannheimiasucciniciproducens)(Lee et al.2002,Appl Microbiol Biotechnol58:663-668)和巴斯夫琥珀菌(Basfia succiniciproducens)(Scholten et al.2009,Biotechnol Lett31:1947-1951)。另一类是通过代谢工程改造的工程菌，主要是大肠杆菌。
天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸，但其自有很多缺陷。发酵过程中，糖酸转化率低，有相当一部分碳源流入到其他有机酸的合成。另外，天然产丁二酸菌发酵过程 中需要丰富培养基，提高了生产成本和下游分离纯化成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁二酸，但由于其生理遗传背景都很清晰，易于改造，因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌种，将其改造成高产丁二酸的工程菌。
磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是丁二酸合成途径的关键前体。将PEP羧化成草酰乙酸(OAA)是丁二酸合成途径的关键步骤。Millard等人通过过表达大肠杆菌的PEP羧化酶基因ppc，将丁二酸的产量提高了3.5倍(Millard et al.,1996,Appl Environ Microbiol62:1808-1810)。Kim等人发现在野生型大肠杆菌中过表达PEP羧化激酶基因pck，对丁二酸生产没有影响，但在敲除了ppc基因的大肠杆菌中过表达pck基因,能将丁二酸的产量提高6.5倍(Kim et al.,2004,Appl Environ Microbiol70:1238-1241)。韩国Kwon等人进一步发现当发酵液中含有高浓度碳酸氢根离子时，在野生型大肠杆菌中过表达pck基因,能将丁二酸的产量提高2.2倍(Kwon et al.,2006,J Microbiol Biotechnol16:1448–1452)。
Chatterjee等人通过在大肠杆菌中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脱氢酶基因ldhA，构建了工程菌NZN111。该菌株不能以葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。在此基础上筛选出能够重新利用葡萄糖为碳源发酵生长的突变菌株AFP111(Chatterjee et al.,2001,Appl EnvironMicrobiol67:148-154;Donnelly et al.,1998,Appl Biochem Biotechnol70-72:187-198)。Vemuri等人通过在AFP111中高表达埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶基因pyc，进一步提高了丁二酸的产量。在两步法培养(先好氧培养，然后厌氧发酵产酸)条件下，丁二酸的最终浓度可达到99.2g/L(841mM)，糖酸转化率为1.1g/g(1.68mol/mol)(Vemuri et al.,2002,J Ind Microbiol Biotechnol28:325-332)。
Sanchez等人通过敲除醇脱氢酶基因adhE、ldhA、乙酸激酶基因ackA、磷酸乙酰转移酶基因pta、异柠檬酸裂解酶调控蛋白基因iclR，构建出工程菌SBS550MG。在两步法培养(先好氧培养，然后厌氧发酵产酸)条件下，可以生产40g/L(339mM)的丁二酸，糖酸转化率达到1.06g/g(1.61mol/mol)(Sanchez et al.,2005,Metab Eng7:229-239)。
Vemuri等人和Sanchez等人构建出的重组大肠杆菌虽然能生产高浓度的丁二酸，但仍有一些缺陷。发酵过程采用的是两步发酵，即先采用好氧过程将细胞培养生产起来，再转变为厌氧过程进行发酵。这种工艺操作复杂，而且好氧工艺会大大提高设备的构建和运行成本。这些重组大肠杆菌都需要使用丰富培养基，这将极大地提高发酵的原料成本，并导致计算的转化率偏高。
Jantama等人通过敲除ldhA、adhE、甲酸转运蛋白基因focA、pflB、ackA、甲基乙二醛合成酶基因mgsA、丙酮酸氧化酶基因poxB，并经过进化代谢，构建出重组大肠杆菌KJ073。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产79g/L(668mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.79g/g(1.2mol/mol)(Jantama et al.,PCT/US2008/057439;Jantama et al.,2008a,Biotechnol Bioeng99:1140-1153)。进一步敲除丙酸激酶基因tdcD、2-酮基丁酸甲 酸裂解酶/丙酮酸甲酸裂解酶基因tdcE、天冬氨酸氨基转移酶基因aspC、苹果酸酶基因sfcA，并经过进化代谢，构建出重组大肠杆菌KJ122。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产80g/L(680mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.89g/g(1.36mol/mol)(Jantamaet al.,PCT/US2008/057439;Jantama et al.,2008b,Biotechnol Bioeng101:881-893)。上述的两个重组大肠杆菌都是经过进化代谢提高了丁二酸的生产能力。Zhang等人还通过敲除PEP-糖磷酸转移酶的酶I基因ptsI、pflB基因，并增强PEP羧化激酶(PCK)的活性，构建出重组大肠杆菌XZ721。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以生产39g/L(327mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.82g/g(1.25mol/mol)(Zhang et al.,PCT/US2010/029728;Zhang et al.,2009b,ApplEnviron Microbiol75:7807-7813)。
为了提高大肠杆菌生产丁二酸的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。
发明概述
一方面，本发明提供了一种用于生产丁二酸的重组大肠杆菌。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰：(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制，(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制，和(4)galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b)sthA基因表达的增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAGlc的基因crr和编码PTS系统酶IICBGlc的基因ptsG。
在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编码5-磷酸核糖异构酶的基因rpi、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醛醇酶的基因talB。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中sthA基因和tktA基因的表达增强、和/或sthA基因和tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于染色体中或者质粒中。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达的增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b)sthA基因表达的增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质活性的增强；和(c)突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQID No.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：(5)ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；(6)aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因簇所编码的蛋白质活性的增强；和(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰：(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰：(10)adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制;和(11)tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：(12)aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
在第二方面，本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
附图简述
图1：改造大肠杆菌获得重组菌株NZ-037的示意图。X代表基因敲除，包括ldhA、pflB、ptsI、ackA-pta基因。四角星代表基因表达的增强，包括galP、pck、aceBA、dcuC基因。
图2：NZ-037经过1080代进化获得菌株HX021。
图3：HX023经过360代进化获得菌株HX024。
图4：HX024在5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。
图5：HX027经过650代进化获得菌株HX028。
图6：HX028在5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。
图7：HX024的转录组分析。灰色方框和白色方框中的数字代表HX024基因表达强度和野生型大肠杆菌ATCC8739的相对值；缩写词：GLC：葡萄糖；G6P：6-磷酸葡萄糖；F6P：6-磷酸果糖；FBP：1,6-二磷酸果糖；GAP：3-磷酸甘油醛；DHAP：磷酸二羟基丙酮；GBP：1,3-二磷酸甘油酸；G3P：3-磷酸甘油酸；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；OAA：草酰乙酸；MAL：苹果酸；FUM：富马酸；SUC：丁二酸；6PGCL：6-磷酸葡萄糖酸内酯；6PGC：6-磷酸葡萄糖酸；RL5P：5-磷酸核酮糖；X5P：5-磷酸核糖；R5P：5-磷酸木糖；S7P：7-磷酸景天庚酮糖；E4P：4-磷酸赤鲜糖；PYR：丙酮酸；ACA：酰基辅酶A；ACP：酰基磷酸；ACE：乙酸；CIT：柠檬酸；ICIT：异柠檬酸；GLO：乙醛酸；DLAC：D-乳酸；FOR：甲酸；ETH；乙醇；NAD+：氧化型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH：还原型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADH：还原型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP+：氧化型尼克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。galP：半乳糖透型酶基因；glk：葡萄糖激酶基因；gapA：3-磷酸甘油脱氢酶基因；pfkA：6磷酸果糖激酶基因；pck：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；mdh：苹果酸脱氢酶基因；fumA：富马酸水合酶酶I基因；frdABCD：富马酸还原酶基因；zwf：6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因；pgl：6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因；gnd：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因；rpe：5-磷酸核酮糖差向异构酶基因；rpiAB：5-磷酸核糖差向异构酶基因；tktA：转酮醇酶基因；tktB：转酮醇酶基因；talB：转醛醇酶基因；pykF：丙酮酸激酶基因；pdh：丙酮酸脱氢酶基因；pta：磷酸乙酰转移酶基因；ackA：乙酸激酶基因；gltA：柠檬酸合成酶基因；acn：顺乌头酸酶基因；aceB：苹果酸合成酶基因；aceA：异柠檬酸裂解酶基因；sthA：嘧啶核苷酸转氢酶基因；maeB：NADPH依赖苹果酸酶基因；dcuB：厌氧C4双羧酸转运蛋白基因；dcuC：C4双羧酸转运蛋白基因；dctA：好养C4双羧酸转运蛋白基因。
图8：(A)野生型lpdA基因以及突变的lpdA基因(lpdA*)的核苷酸序列比对；(B)野生型以及突变的lpdA基因(lpdA*)所编码的多肽的氨基酸序列比对。
发明详述
除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
一方面，本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化改造的重组大肠杆菌。在本发明的大肠杆菌中，通过调节代谢途径中所涉及的一些酶的活性，从而改善了大肠杆菌丁二酸的产量和/或转化率。
如本文所用，术语“经工程化改造的重组大肠杆菌”、“工程化的大肠杆菌”和“重组大肠杆菌”可互换使用，均是指经过修饰的大肠杆菌，其中所述的修饰可以是，例如，基因表达的增强、基因表达的抑制、引入新的基因、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲除、改变基因的拷贝数、引入质粒、改变基因的启动子(例如使用强启动子或弱启动子)等。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下的一或多种修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强；和(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强。
如本文所用，术语“磷酸戊糖途径(pentose-phosphate pathway)”具有本领域内熟知的含义。磷酸戊糖途径是在动物、植物和微生物中普遍存在的一条糖的分解代谢途径，其特征在于葡萄糖被直接氧化脱氢和脱羧，而不经过糖酵解，脱氢酶的辅酶不是NAD+而是NADP+，产生的NADPH作为还原力以供生物合成用，而不是传递给O2。
在一些实施方案中，本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、或者磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码转酮醇酶的基因tktA、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因zwf、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd、编码5-磷酸核糖异构酶的基因rpi、编码5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因rpe和编码转醛醇酶的基因talB。
在本发明中，tktA基因(Genbank No:ACA76448.1)所编码的蛋白质的是转酮醇酶(ECNo:2.2.1.1)，zwf基因(Genbank No:ACA77430.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(EC No:1.1.1.49)；pgl基因(Genbank No:ACA78522.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC No:3.1.1.31)；gnd基因(Genbank No:ACA76645.1)所编码的蛋白质的是6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(EC No:1.1.1.44)；rpi基因(Genbank No:ACA76468.1)所编码的蛋白质的是5-磷酸核糖异构酶(EC No:5.3.1.6)；rpe基因(Genbank No:ACA76005.1)所编码的蛋白质的是5-磷酸核酮糖差向异构酶(EC No:5.1.3.1)；talB基因(Genbank No:ACA79258.1)所编码的蛋白质的是转醛醇酶(EC No:2.2.1.2)。
sthA基因(Genbank No:ACA79653.1)编码一种可溶性转氢酶(EC No:1.6.1.1)。在一个实施方案中，本发明的sthA基因的序列如SEQ ID No.:5所示。在一个实施方案中，本发明的sthA基因的序列与SEQ ID No.:5所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性。
在一个实施方案中，本发明的tktA基因的序列如SEQ ID No.:6所示。在一个实施方案中，本发明的tktA基因的序列与SEQ ID No.:6所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性
如本文所用，术语“基因表达增强”，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式实现，例如但不限于：在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白活性增强”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因的表达增强”以及“基因所编码的蛋白质的活性增强”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一些实施方案中，使用的强启动子例如是：Ppck*(SEQ ID No.:108)(Zhang et al.,2009b,ApplEnviron Microbiol75:7807-7813)、M1-37(SEQ ID No.:109)、或M1-93(SEQ ID No.:110)(Lu et al.,2012,Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下的一或多种修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强；和(c)突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ IDNo.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
术语“突变”具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于质粒中或者染色体中。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于染色体中。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，并且所述突变的lpdA基因位于质粒中。
如本文所用，术语“质粒”具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有：pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A-M、pTrc99A-M-Kan、pKD4和pKD46等。
如本文所用，术语“染色体”具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人员熟知的，例如可以参见Michael R.Green和Joseph Sambrook的"Molecular Cloning:ALaboratory Manual"(Fourth Edition)。
lpdA基因(Genbank No:ACA79157.1)是编码硫辛酰胺脱氢酶(EC No:1.8.1.4)的基因。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型lpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.:2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示，而本发明的大肠杆菌中所引入的突变的lpdA基因则含有如下的一或多种突变：C242T、C823T、和C1073T；而所述突变的lpdA基因所编码的多肽具有如下的一或多种氨基酸置换：T81I、P275S、和A358V(参见图8)。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，所述突变的lpdA基因在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的lpdA基因序列可能与SEQ ID No.:2所示lpdA基因序列不完全等同，以及不同大肠杆菌菌株的lpdA基因所编码的多肽序列可能与SEQ ID No.:1所示的多肽序列不完全等同。在本发明的某些实施方案中，所述突变的lpdA基因中的突变位于对应于SEQ ID No.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本发明的某些实施方案中，所述突变的lpdA基因所编码的多肽中的置换位于对应于SEQ ID No.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
在本发明中，“对应于”SEQ ID No.:1或SEQ ID No.:2中某一特定位置的位置可以通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽或核苷酸序列，本领域技术人员可以在适当的位置引入相应的突变，从而实现本发明的技术效果。另外，本领域技术人员也可以使用保守和类似的氨基酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基，或者在lpdA基因序列中引入同义突变，而实现本发明的技术效果。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中sthA基因和tktA基因的表达增强、或者sthA基因和tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下遗传修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增；和(c)突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ IDNo.:1所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因在对应于SEQID No.:2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下遗修饰：(a)磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因表达增强、和/或磷酸戊糖途径(PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强；(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强；和(c)突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ IDNo.:1所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ IDNo.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中含有如下修饰：(a)tktA基因的表达增强、和/或tktA基因所编码的蛋白质的活性增强，(b)sthA基因的表达增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质的活性增强，和(c)突变的lpdA基因，其在对应于SEQ ID No.:2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变：C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的，其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的lpdA基因的表达增强，和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因ptsI、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAGlc的基因crr和编码PTS系统酶IICBGlc的基因ptsG。
在本发明中，ptsI基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I(EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。crr基因(GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGlc(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBank No:ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IICBGlc(EC No:2.7.1.69)。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：(1)ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：(1)ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：(1)ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰：(1)ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB基因表达的抑制、和/或pflB 所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
在本发明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC No.2.3.1.54)。adhE基因(Genbank No:ACA78022.1)编码乙醇/乙醛脱氢酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase)(EC No:1.1.1.1,EC No:1.2.1.10)。ldhA基因(GenBank No:ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶A(lactatedehydrogenase A)(EC No:1.1.1.28)。galP基因(GenBank No:ACA76443.1)编码半乳糖MFS转运蛋白。glf基因(GenBank No:AAA27691.1)编码葡萄糖转运蛋白Glf(glucosefacilitator protein)。pck基因(GenBank No:ACA75988.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,又称作PCK酶(EC No:4.1.1.49)。
如本文所用，术语“基因表达的抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方式实现，例如但不限于：基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子(例如使用弱启动子)等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白质的活性抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因表达的抑制”以及“基因所编码的蛋白质的活性抑制”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰：(1)ptsI基因表达的抑制、和/或ptsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；(2)pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；(4)galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：(5)ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；(6)aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因簇所编码的蛋白质活性的增强；和(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质的活性增强。在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中的pck基因被敲除。
pta基因(GenBank No:ACA77021.1)编码磷酸乙酰转移酶(EC No:2.3.1.8)，而ackA基因(GenBank No:ACA77022.1)编码乙酸激酶(EC No:2.7.2.1)。aceBA基因簇包括aceB基因(GenBank No:ACA79615.1)编码苹果酸合成酶(EC No:2.3.3.9)和aceA基因(GenBank No:ACA79614.1)编码异柠檬酸裂解酶(EC No:4.1.3.1)。dcuC基因(GenBank No:ACA78647.1)编码C4二羧酸转运蛋白DcuC。mgsA基因(GenBank No:ACA78263.1) 编码甲基乙二醛合成酶(EC No:4.2.3.3)。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰：(10)adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制;和(11)tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
tdcDE基因簇包括tdcD基因(GenBank No:ACA76259.1)和tdcE基因(GenBank No:ACA76260.1)，其中tdcD基因编码丙酸激酶（EC No:2.7.2.15），而tdcE基因编码2-酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酸甲酸裂解酶（EC No:2.3.1.54）。adhE基因（GenBank No:ACA78022.1）编码乙醇/乙醛脱氢酶（EC No:1.1.1.1/EC No:1.2.1.10）。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰：(12)aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强;(13)dcuB基因表达的增强、和/或dcuB基因所编码的蛋白质活性的增强;(14)mdh基因表达的增强、和/或mdh基因所编码的蛋白质活性的增强;(15)fumA基因表达的增强、和/或fumA基因所编码的蛋白质活性的增强;(16)fumB基因表达的增强、和/或fumB基因所编码的蛋白质活性的增强;和(17)frdABCD基因簇表达的增强、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
aceEF基因簇编码丙酮酸复合体E1/E2(EC No:1.2.4.1)，包括aceE基因(GenBankNo:ACA79159.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E1和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E2。dcuB基因(GenBank No:ACA79506.1)编码厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuB。mdh基因(GenBank No:ACA76147.1)编码苹果酸脱氢酶(EC No:1.1.1.37)。fumA基因(GenBank No:ACA77662.1)编码好氧富马酸酶I(EC No:4.2.1.2)。fumB基因(GenBank No:ACA79507.1)编码厌氧富马酸酶I(EC No:4.2.1.2)。frdABCD基因簇编码富马酸还原酶(ECNo:1.3.5.4)，包括frdA基因(GenBank No:ACA79460.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)编码富马酸还原酶铁硫蛋白亚基、frdC基因(GenBankNo:ACA79462.1)编码富马酸还原酶C亚基、和frdD基因(GenBank No:ACA79463.1)编码富马酸还原酶D亚基。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7260(2013年2月25日，分类命名：大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物所)的菌株。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7259(2013年2月25日，分类命名：大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物所)的菌株。
在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7550(2013年5月3日，分类命名：大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物所)的菌株。
在第二方面，本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法包括培养本发明的大肠杆菌，以及任选的收集或者纯化丁二酸。
在一个实施方案中，本发明所述的“培养”包括种子培养和发酵培养。
如本文所用，术语“种子培养”是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
如本文所用，术语“发酵培养”是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。
在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。
如本文所用，术语“厌氧发酵”是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。
在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。
在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤：
(1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下培养一段时间得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养。
本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟知的(诸葛健等，1994，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社)。
在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：温度为30-45℃，例如30-31℃、31-32℃、32-33℃、33-34℃、34-35℃、35-36℃、36-37℃、37-38℃、38-39℃、39-40℃、40-41℃、41-42℃、42-43℃、43-44℃、或44-45℃。
在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：种子培养的时间为6-16小时，例如6-7小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14小时、14-15小时、或15-16小时。
在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：发酵培养的时间为2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，例如OD550为0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或0.4-0.5。
在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源， 例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。
在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、和甜菜碱-KCl；
微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、ZnCl2、Na2MoO4·2H2O、MnCl2·4H2O2、和H3BO3。
在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20-120g/L，KH2PO42-5g/L、K2HPO44-8g/L、(NH4)2HPO43-5g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KCl0.1-1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 1-5μg/L、CoCl2·6H2O 0.05-1μg/L、CuCl2·2H2O 0.05-1μg/L、ZnCl20.05-1μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05-1μg/L、MnCl2·4H2O20.1-1μg/L,H3BO30.01-0.5μg/L。
在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、和甜菜碱-KCl；
微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、ZnCl2、Na2MoO4·2H2O、MnCl2·4H2O2、和H3BO3。
在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20-120g/L，NH4H2PO40.5-1.5g/L、(NH4)2HPO42-5g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KCl 0.1-1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1-5μg/L、CoCl2·6H2O 0.05-1μg/L、CuCl2·2H2O 0.05-1μg/L、ZnCl20.05-1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.05-1μg/L、MnCl2·4H2O20.1-1μg/L,H3BO30.01-0.5μg/L。
在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下：
将菌株厌氧发酵，包括以下步骤：
(1)种子培养：将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷却后将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种；
(2)发酵培养：将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，37℃培养2-5天，得到发酵液。
在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法中还包括从发酵液中提取和/或纯化丁二酸的步骤。
在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体包括如下实施例：
实施例1、重组大肠杆菌NZ-037的构建
重组大肠杆菌NZ-037的构建(表1)，分为以下八个步骤：
(1)乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
(1-1)：首先构建质粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表达调控和外源基因整合。
质粒构建操作步骤共四步：
第一步，以pACYC184质粒DNA(Mok et al.,1991,Nucleic Acids Res19:2321-2323)为模板，使用引物184-cat-up(SEQ ID No.:7)和184-cat-down(SEQ ID No.:8)，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列，称为片段I。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
第二步，以芽孢杆菌Bacillus subtilis sp subtilis168的染色体DNA(该菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC No.1.1390)为模板，使用引物Bs-sacB-up(SEQ IDNo.:9)和Bs-sacB-down(SEQ ID No.:10)进行PCR扩增果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)，基因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。扩增体系和扩增条件参见上文第一步。
第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶SacI(NEB公司)在37℃酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；各取20ng片段I和片段II，加入1μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μlT4-DNA连接酶(NEB公司)，补充蒸馏水至10μl，25℃反应5分钟；以酶连片段为底物，取1μl，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参见上文第一步，得到含有cat-sacB的连接片段III。
第四步，将PCR获得的片段III取1μl，加入1μl pEASY-blunt simple载体(试剂盒，北京全式金生物技术有限公司)，25℃反应15分钟；氯化钙转化法：加入50μl Trans10感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行，冰浴30分钟。42℃热激30秒， 立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F(SEQ IDNo.:11)/M13-R(SEQ ID No.:12)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ-CS(表3)。
(1-2)：从大肠杆菌ATCC8739(Gunsalus et al.,1941,J Biol Chem141:853-858)出发，采用两步同源重组的方法敲除ldhA基因，获得重组大肠杆菌Suc-T102，包括以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up(SEQIDNo.:13和XZ-ldhA-down(SEQ ID No.:14)进行PCR扩增，PCR产物为1753bp，该PCR产物包含大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶编码基因ldhA(GenBank No:ACA77176.1)及其上下游各大约400个碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例上文(1-1)中的第一步。
将扩增得到的1753bp PCR产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系及氯化钙转化法参见上文(1-1)中质粒pXZ-CS构建方法中的第四步。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，将得到的重组质粒命名为pXZ001。
第二步，以pXZ001质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-1(SEQ ID No.:15和XZ-ldhA-2(SEQ ID No.:16)进行PCR扩增，得到4758bp的PCR产物，该PCR产物包含pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各约400个碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例上文(1-1)中的第一步。
第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段cat-sacB连接至第二步的PCR扩增产物，具体如下：
以pXZ-CS为模板，使用引物cat-sacB-up(SEQ ID No.:17)和cat-sacB-down(SEQIDNo.:18)进行PCR扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。
连接体系为：10ng的第二步4758bp的PCR产物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)，1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μl。室温连接2小时。取10ul用氯化钙转化法转入Trans10，过程参见上文(1-1)中质粒pXZ-CS构建方法中的第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ001中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ002C。
第四步，以pXZ002C质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出3447bp DNA片段I。扩增体系和扩增条件参见上文(1-1)中质粒pXZ-CS构建步骤中的第一步。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因ldhA上游约400个碱基、cat-sacB DNA 片段、乳酸脱氢酶编码基因ldhA下游约400个碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645;质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为Suc-T101。
第五步，将第二步得到的4758bp的PCR产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组；具体步骤如下：将第二步的4758bp的PCR产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000粘附末端单位/ml)，室温反应2小时得到连接产物。酶连产物取10ul用氯化钙转化法转入Trans10，过程参见上文(1-1)中质粒pXZ-CS构建步骤中的第四步。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒pXZ003。
第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出829bpDNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Suc-T101。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Suc-T101的电转化感受态细胞(制备方法参见Dower et al.,1988)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时，去除pKD46质粒。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为763bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T102(表1)。
敲除ldhA基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
(2)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB的敲除
从重组大肠杆菌Suc-T102出发，使用上文(1)部分中相同的方法敲除pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)，获得重组大肠杆菌Suc-T104。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldhA替换为pflB。
(3)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I基因ptsI的敲除
从重组大肠杆菌Suc-T104出发，使用上文(1)部分中相同的方法敲除ptsI基因(GenBank No:ACA76928.1)，获得重组大肠杆菌Suc-T106。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldhA替换为ptsI。
(4)半乳糖MFS转运蛋白GalP的激活
从重组大肠杆菌Suc-T106出发，将galP基因(GenBank No:ACA76443.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*(SEQ ID No.108)，获得重组大肠杆菌Suc-T108。在本发明中，Ppck*代表大肠杆菌pck启动子突变体，也即在相对于ATG起始处的-64位处G变为A(Zhanget al.,2009b,Appl Environ Microbiol75:7807-7813)。
包括以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up(SEQIDNo.:27)和XZ-galP-P-down(SEQ ID No.:28)进行PCR扩增，得到841bp扩增产物，为大肠杆菌ATCC8739的半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件以及其上下游各约400个碱基。将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ011。
第二步，以pXZ011质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-1(SEQ ID No.:29和XZ-galP-P-2(SEQ ID No.:30)进行PCR扩增，得到4614bp扩增产物，其扩增产物包含pEASY-Blunt载体和半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及上下游各约400个碱基。
第三步，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down进行PCR扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。
将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的4614bp PCR扩增产物。转化Trans1-T1感受态细胞。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ010中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构 建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ012C。
第四步，以pXZ012C质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down进行PCR扩增，得到3303bp DNA片段I；该DNA片段I包含半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件上游约400个碱基、cat-sacB DNA片段、半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件下约400个碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T106，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc-T106。
电转条件参见上文(1-2)中ldhA基因敲除的第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物为XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，得到验证正确的单菌落，将其命名为Suc-T107。
第五步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI(SEQID No.:31)和P-pck*-down-KpnI(SEQ ID No.:32)扩增大肠杆菌ATCC8739的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的调控元件pck，引物序列见表2。PCR产物进行SpeI(购自NEB公司)和KpnI(购自NEB公司)酶切。将其克隆到经过相同酶酶切的质粒pTrc99A(Amann et al.,1998,Gene69:301-15)表达载体上，命名为质粒pXZ602。以质粒pXZ602为模板，使用引物pck*-F(SEQ ID No.:33)和pck*-R(SEQ ID No.:34)进行扩增，引物序列为见表2。扩增产物经过T4多核苷酸激酶(购自NEB公司)磷酸化，自连得到阳性质粒，测序验证无误后，命名为pXZ603。
以pXZ603为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI和P-pck*-down-KpnI进行PCR扩增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突变调控元件Ppck*，与第二步得到的4614bp扩增产物连接，得到质粒pXZ013。
用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物对以质粒pXZ013为模板扩增出DNA片段II。
第六步，DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Suc-T107。电转条件参见上文(1-2)中ldhA基因敲除步骤中的第六步。用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down进行PCR以及测序验证，得到1051bp为正确的单菌落，将其命名为Suc-T108(表1)。
将半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件置换成Ppck*所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
(5)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的激活
从重组大肠杆菌Suc-T108出发，将pck基因(GenBank No:ACA75988.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*，获得重组大肠杆菌Suc-T110(表1)。
具体如下：
第一步同源重组：以pXZ-CS为模板，使用引物pck-cat-sacB-up(SEQ ID No.:35)和pck-cat-sacB-down(SEQ ID No.:36)扩增DNA片段I，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组 菌Suc-T108，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以pXZ603质粒为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI扩增(引物序列见表2)，得到378bp人工调控元件Ppck*；将378bp人工调控元件Ppck*电转入整合了片段I的中间重组菌，得到重组菌1。重组菌1PCR验证的引物pck-YZ-up(SEQ IDNo.:37)和pck-YZ-down(SEQ ID No.:38)，得到676bp且测序正确的单菌落，将其命名为菌株Suc-T110。
(6)磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA的敲除
从重组大肠杆菌Suc-T110出发，使用上文(1)部分中相同的方法敲除磷酸乙酰转移酶编码基因pta(GenBank No.ACA77021.1)和乙酸激酶编码基因ackA(GenBankNo.ACA77022.1)，获得重组大肠杆菌NZ-035(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅分别将ldhA替换为ackA或者pta。
(7)苹果酸合成酶AceA和异柠檬酸裂解酶AceB的激活
以重组大肠杆菌NZ-035出发，使用和实施案例上文(4)部分中相同的方法将aceBA基因簇(aceB GenBank No:ACA79615.1,aceA GenBank No:ACA79614.1)的原始启动子替换为Ppck*启动子，获得重组大肠杆菌NZ-036(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2,其中引物的命名对应于激活galP基因过程中所使用的引物的名称，仅将galP替换为aceB。
(8)二羧酸Dcu转运蛋白DcuC的激活
以重组大肠杆菌NZ036出发，使用和上文(4)部分中相同的方法将dcuC基因(GenBank No.ACA78647.1)的原始调控元件替换为调控元件Ppck*，获得重组大肠杆菌NZ-037(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2,其中引物的命名对应于激活galP基因过程中所使用的引物的名称，仅将galP替换为dcuC。
表1、生产丁二酸的重组大肠杆菌
表2、本发明中使用的引物
表3、本发明中构建的质粒
实施例2：使用重组大肠杆菌Suc-T110、NZ-035、NZ-036和NZ-037生产丁二酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，KH2PO43.5g/L、K2HPO46.55g/L、(NH4)2HPO43.5g/L、MgSO4·7H2O 0.12g/L、和甜菜碱-KCl 0.15g/L。
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L、CoCl2·6H2O 0.1μg/L、CuCl2·2H2O 0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为50g/L、另外还加入了100mM KHCO3。
Suc-T110,NZ-035,NZ-036和NZ-037厌氧发酵，包括以下步骤：
(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Suc-T110,NZ-035,NZ-036和NZ-037按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度OD550=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵4天，得到发酵液。中和 剂为2.4MK2CO3和1.2M KOH。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对第4天发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。
结果见表4。Suc-T110发酵96小时后，丁二酸产量达280mM，产率达1.12mol/mol；NZ-035发酵96小时后，丁二酸产量达286mM，产率达1.16mol/mol；NZ-036发酵96小时后，丁二酸产量达298mM，产率达1.19mol/mol；NZ-037发酵96小时后，丁二酸产量达357mM，产率达1.28mol/mol。
表4：重组大肠杆菌Suc-T108,Suc-T110,NZ035,NZ036和NZ037发酵生产丁二酸
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了100mM KHCO3。使用的中和剂为2.4M K2CO3和1.2M KOH。
实施例3：使用钠盐发酵重组大肠杆菌NZ037生产丁二酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-KCl 0.15g/L。
微量元素：FeCl3·6H2O 2.4μg/L、CoCl2·6H2O 0.3μg/L、CuCl2·2H2O 0.15μg/L、ZnCl20.3μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3μg/L、MnCl2·4H2O 0.5μg/L,H3BO30.072μg/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为100g/L、另外还加入了35mM NaHCO3。使用2.4M Na2CO3和1.2M NaOH为中和剂。
种子培养、发酵培养以及分析方法和实施例2相同。
结果：发酵96小时后，丁二酸产量达226mM，产率达1.27mol/mol。
实施例4：重组大肠杆菌HX021的构建
从NZ-037出发，通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产能力。
进化代谢所使用的发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖100-120g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-KCl 0.15g/L、35mM NaHCO3。
微量元素：FeCl3·6H2O 2.4μg/L、CoCl2·6H2O 0.3μg/L、CuCl2·2H2O 0.15μg/L、ZnCl2 0.3μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3μg/L、MnCl2·4H2O 0.5μg/L,H3BO30.072μg/L。
进化代谢过程使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。使用2.4M Na2CO3和1.2MNaOH为中和剂。
第1-80代，发酵培养基中葡萄糖浓度为100g/L(即10%)；每48小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05；
第81-780代，发酵培养基中葡萄糖浓度为100g/L；每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05；
第781-1080代，发酵培养基中葡萄糖浓度为120g/L(即12%)；每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05。
经过1080代进化，获得菌株HX021(图2)。
实施例5：重组大肠杆菌HX023的构建
从重组大肠杆菌HX021出发，使用和实施例1中(1)部分相同的方法敲除mgsA基因(GenBank No:ACA78263.1)，获得重组大肠杆菌HX023。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldhA替换为mgsA。
实施例6：重组大肠杆菌HX024的构建
从HX023出发，通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产能力。
进化代谢所使用的发酵培养基和实施案例4相同。
第1-360代，发酵培养基中葡萄糖浓度为120g/L(即12%)；每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05；
经过360代进化，获得菌株HX024(图3)。
实施例7：不同浓度的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌HX024发酵的影响
使用不同的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌HX024进行发酵。
种子培养基和实施例3相同。
使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基基本上和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为120g/L、另外还加入了35mM NaHCO3。使用的中和剂有5种不同的配比方式，6M氢氧化钠和3M碳酸钠的配比组成分别是1:4、1:2、1:1、3:2、2:1。
HX024在500ml发酵罐中的厌氧发酵，包括以下步骤：
(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌HX024按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml中发酵培养基体积为250ml，115℃灭菌25min。将种子液按 照终浓度OD550=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃厌氧培养4天，搅拌转速150rpm，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程没有通任何气体。
结果：发酵结果见表5。在氢氧化钠和碳酸钠不同配比中，当CO2在碱液中的摩尔比例低于33.3%时，丁二酸转化率明显下降，而高于33.3%时，丁二酸转化率没有明显差别。
表5：不同的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌HX024发酵的影响
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了35mM NaHCO3。不同比例的NaOH(6M)和Na2CO3(3M)组成的碱液自动控制pH，使pH保持在7.0。
b CO2(%mol)表示CO2在碱液中的摩尔比例。
实施例8：重组大肠杆菌HX021,HX023和HX024在500ml发酵罐中的发酵
种子培养基和实施例3相同。
使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基基本上和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为120g/L、另外还加入了35mM NaHCO3。使用的中和剂为1.5M Na2CO3和3MNaOH。
结果：HX021发酵96小时后，丁二酸产量达618mM，产率达1.24mol/mol；HX023发酵96小时后，丁二酸产量达594mM，产率达1.25mol/mol；HX024发酵96小时后，丁二酸产量达798mM，产率达1.33mol/mol(表6)。
表6：重组大肠杆菌HX021,HX023和HX024发酵生产丁二酸
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了35mM NaHCO3。使用的中和剂为1.5M Na2CO3和3M NaOH。
实施例9：重组大肠杆菌HX024在5L发酵罐中的发酵
种子培养基、发酵培养基、分析方法和实施例8相同
HX024在5L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中的厌氧发酵，包括以下步骤：
(1)种子培养：500ml三角瓶中种子培养基为150ml，115℃灭菌15min。冷却后将 重组大肠杆菌HX024按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：5L中发酵培养基体积为3L，115℃灭菌25min。将种子液按照终浓度OD550=0.2的接种量接种于发酵培养基，37℃厌氧培养4天，搅拌转速200rpm，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程没有通任何气体。
结果：发酵96小时后，丁二酸产量达915mM(相当于108g/L)，产率达1.37mol/mol(相当于0.9g/g)(图4)
实施例10：重组大肠杆菌HX041-HX044的构建和发酵
(1)重组大肠杆菌HX041-HX044的构建
按照实施例1中(1-2)部分的方法，对HX024菌株中的pck基因(GenBank No:ACA75988.1)、maeA基因(GenBank No:ACA77817.1)、maeB基因(GenBank No:ACA76880.1)和ppc基因(GenBank No:ACA79659.1)分别进行单基因敲除，得到菌株HX041-HX044(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的引物的名称，仅分别将ldhA替换为pck、maeA、maeB或者ppc。
(2)重组大肠杆菌HX041-HX044的发酵
使用和实施例8相同的方法发酵重组大肠杆菌HX041-HX044生产丁二酸。
结果：发酵结果见表7。HX041菌株中的pck基因被敲除后，细胞仍然能够产生大量的丁二酸；说明大肠杆菌菌株可以不使用PCK酶进行PEP羧化反应生产丁二酸。另一方面，HX024菌株中的maeB基因被敲除后，丁二酸产量下降29%，表明MaeB在HX024中起一定作用，有一部分碳代谢流通过MaeB进行丁二酸合成。HX024菌株中的maeA基因被单敲除后，丁二酸产量下降49%，表明MaeA在HX024中起一定作用，有一部分碳代谢流通过MaeA进行丁二酸合成。
此外，HX024菌株中的ppc基因单敲除后，不能在无机盐培养基中进行种子培养；用LB培养基进行种子培养，再在无机盐发酵培养基中发酵，丁二酸产量下降70%，表明PPC在HX024中起到了重要的催化作用，这可能与其优良的酶动力学催化特性有关。
表7:重组大肠杆菌HX041-HX044发酵生产丁二酸
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了35mM NaHCO3。使用的中和剂为1.5M Na2CO3和3M NaOH。
b HX044使用LB培养基准备种子，再在无机盐发酵培养基中发酵；其他菌株使用的种子培养基为无机盐培养基+2%葡萄糖。
实施例11：重组大肠杆菌HX027和HX028的构建和发酵
(1)重组大肠杆菌HX-027的构建
按照实施例1中(1)部分的方法，从HX-024菌株出发，先敲除adhE基因(GenbankNo:ACA78022.1)，得到重组菌株HX-026(表1)；再敲除tdcDE基因簇(tdcD基因:GenBankNo:ACA76259.1;tdcE基因GenBank No:ACA76260.1)，得到重组菌株HX-027(表1)。构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除ldhA基因过程中所使用的名称，仅分别将ldhA替换为adhE或tdcDE。
(2)重组大肠杆菌HX-028的构建
从HX027出发，通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产能力。
进化代谢所使用的发酵培养基和实施案例4相同。
第1-650代，发酵培养基中葡萄糖浓度为120g/L(即12%)；每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05(图5)；
经过650代进化，获得菌株HX028(图5)。
(3)重组大肠杆菌HX-028的发酵
使用和实施例9相同的方法，在5L发酵罐中对重组大肠杆菌HX-028进行发酵。
发酵结果见图6。发酵96小时，丁二酸产量达到1042mM(相当于123g/L)，产率达1.02g/g(相当于1.56mol/mol)。
实施例12：重组大肠杆菌HX024的转录组分析
对重组大肠杆菌HX024的转录组分析，包括以下步骤：
(1)发酵培养
HX024的种子培养和发酵培养与实施例8中的方法相同。共设3个平行厌氧发酵，
野生型ATCC8739菌株的种子培养和发酵培养基本上与实施例5中的方法相同，区别是使用的葡萄糖浓度为50g/L。
(2)RNA制备：
HX024发酵至OD550=3.9时三个平行发酵样品分别取样，混匀，抽提RNA。
野生型ATCC8739发酵至OD550=2.5时三个平行发酵样品分别取样，混匀，抽提RNA。
RNA抽提使用的RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒完成，DNase经由The RNase-Free DNase Set(Qiagen)试剂盒处理完成。
(3)转录组测序：
转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成。每个样品产生1Gb清单数据(cleandata)。序列分析的参考序列为ATCC8739的基因组序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1)。
HX024菌株和丁二酸合成相关的基因表达变化见表8和图7。
表8：重组大肠杆菌HX024的转录组分析
a相对表达水平表示HX-024对野生型大肠杆菌ATCC8739基因表达强度倍数。
根据转录组分析，表明HX024菌株中以下基因的表达显著提高了。
1)磷酸戊糖途径(PPP)相关基因tktA的表达提高，糖酵解途径(EMP)相关基因pfkA的表达降低，表明碳代谢流更多地流入磷酸戊糖途径。利用磷酸戊糖途径，相对糖酵解途径，能产生更多的还原力，并且是NADPH形式。苹果酸酶基因maeB的表达提高， 表明细胞通过maeB进行羧化反应的能力提高了。细胞产生更多的NADPH，有利于maeB的羧化反应。
2)转氢酶基因sthA的表达提高，表明细胞将NADPH转化为NADH的能力提高了。细胞产生更多的NADPH，这些NADPH再被转化为NADH，用于提供丁二酸合成所需的还原力。
实施例13：重组大肠杆菌HX024的lpdA基因序列分析
对重组大肠杆菌HX024进行基因组测序，由深圳华大基因科技有限公司完成。测序发现lpdA基因(GenBank No:ACA79157.1)含有3个点突变：C242T、C823T和C1073T，导致LpdA蛋白的3个氨基酸位点突变T81I、P275S和A358V(图8)。
实施例14：激活TktA和SthA提高丁二酸生产能力
(1)重组大肠杆菌ZT-251，ZT-252和ZT-253的构建
将Suc-T110菌株中tktA基因(GenBank No:ACA76448.1)的原始调控元件替换为人工调控元件M1-37(SEQ ID No.:109)，得到菌株ZT-251。
重组菌ZT-251的构建方法如下：
第一步同源重组：以pXZ-CS质粒为模板，使用引物tktA-cat-sacB-up(SEQ IDNo.:79)和tktA-cat-sacB-down(SEQ ID No.:80)扩增DNA片段I，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌Suc-T110中，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以重组大肠杆菌M1-37(Lu et al.,2012,Appl MicrobiolBiotechnol.93:2455-2462；SEQ ID No.:109)的基因组DNA为模板，使用引物tktA-P-up(SEQ IDNo.:81)和tktA-RBS-down(SEQ ID No.:82)，得到包含tktA启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-37的193bp的DNA片段tktA-M1-37；引物序列见表2。
将所述193bp的片段tktA-M1-37电转入整合DNA片段I的中间重组菌，得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1中(1-2)部分ldhA敲除步骤中第六步相同。
重组菌的PCR验证的引物tktA-YZ-up(SEQ ID No.:83)/tktA-YZ-down(SEQIDNo.:84)，得到测序正确的阳性菌落，将其命名为菌株ZT-251；
使用同样的方法，将Suc-T110菌株中sthA基因(GenBank No:ACA79653.1)的原始调控元件替换为人工调控元件M1-37，得到菌株ZT-252，所使用的引物见表2，其中所使用的引物的命名对应于tktA调控元件替换过程中所使用的引物的名称，仅将tktA替换为sthA；
使用同样的方法，将Suc-T110菌株中sthA和tktA基因的原始调控元件都替换为人工调控元件M1-37(SEQ ID No.:109)，得到菌株ZT-253，所使用的引物见表2。
(2)重组大肠杆菌ZT-251，ZT-252和ZT-253的发酵
按照实施例2的方法，对菌株进行培养发酵。发酵结果见表9。结果表明，在Suc-T110 菌株中增强磷酸戊糖途径中tktA基因的表达强度，使得丁二酸产量和转化率分别提高了4%和13%；增强tktA基因的表达强度可以增强流经磷酸戊糖途径的碳代谢流，提高还原力的生产，有利于丁二酸合成。
增强转氢酶编码基因sthA的表达强度，使得丁二酸的产量和转化率分别提高了5%和13%；增强sthA基因的表达强度可以催化细胞中部分NADPH转变成NADH，有利于丁二酸合成。
同时增强tktA和sthA基因的表达强度，使得丁二酸产量和转化率分别提高了10%和19%。协同利用tktA和sthA基因，可以将磷酸戊糖途径产生的NADPH转变成NADH，更有利于丁二酸合成。将获得的丁二酸高产菌株ZT-253在含糖浓度更高(7%葡萄糖)的NBS发酵培养基中发酵，丁二酸产量达到506mM，糖酸转化率达到1.36mol/mol。
表9激活sthA和tktA对丁二酸生产的影响
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了100mM KHCO3。使用的中和剂为2.4M K2CO3和1.2M KOH。
b初始葡萄糖浓度为5%。
c初始葡萄糖浓度为7%。
实施例15：激活TktA、SthA和丙酮酸脱氢酶提高丁二酸生产能力
(1)重组大肠杆菌ZT-273的构建
使用和实施例14中(1)部分相同的方法，将ZT-253菌株中aceEF基因的原始调控元件替换为人工调控元件M1-93；调控元件替换引物的命名对应于tktA基因过程中所使用的引物名称，仅将tktA替换为aceEF(表2)；得到中间重组菌株ZT-273A，用引物AP1-up(SEQ IDNo.:95)/aceEF-1(SEQ ID No.:96)验证。
在中间重组菌株ZT-273A的ackA位点整合lpdA*，得到中间重组菌株ZT-273B。具体包括以下步骤：
第一步：构建整合载体pTrc99A-M-Kan。
具体步骤如下：以pKD4质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad SciUSA97:6640-6645;质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心)DNA为模板，用引物Kan-up-PacI(SEQ ID No.:97)/Kan-down-EcoRI(SEQ ID No.:98)进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例1中(1-1)部分质粒pXZ-CS构建步骤中的第一步。得到 FRT-Km的DNA片段，用限制性内切酶PacI/EcoRI(NEB公司)在37℃处理30分钟；用相同的酶和条件酶切质粒pTrc99A-M(Zhao et al2013,Met Eng doi:10.1016/j.ymben.2013.02.002;本实验室构建，其序列为SEQ ID No.:111)。用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；取50ng纯化后的FRT-Km的DNA片段和30ng pTrc99A-M载体片段，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物。酶连产物取10ul，用氯化钙转化法转入Trans10，同实施例1中(1-1)部分质粒pXZ-CS构建步骤中的第四步。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度50μg/ml)和氨苄霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，用引物Kan-F(SEQ IDNo.:99)/pTrc99A-R(SEQ ID No.:100)进行PCR验证，正确的质粒命名为pTrc99A-M-Kan。
第二步，将lpdA*连接到整合型载体pTrc99A-M-Kan上，获得质粒pXZ177。
具体步骤如下：取质粒pXZ174，用限制性内切酶SacI和HindIII(NEB公司)在37℃酶切30分钟，胶回收得到大小1455bp的片段；用相同的限制性内切酶处理pTrc99AM-Kan，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司)；取50ng胶回收的片段，20ng载体pTrc99AM-Kan片段，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5μl连接产物化转于50μl Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)和氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为Kan-F/lpdA-R-170(SEQ ID No.:101)。测序结果证明质粒构建正确，得到质粒pXZ177。
第三步，将lpdA*片段整合于重组大肠杆菌ZT-273A菌株的ackA位点。
一步法整合片段的准备：以pXZ177为模板，用引物ackA-FRT-up(SEQ IDNo.:102)/pta-rrnB-down(SEQ ID No.:103)进行PCR扩增，获得一步法整合片段。一步法整合片段包括：ackA左同源臂50bp；FRT-km-lpdA*序列；pta右同源臂50bp。
一步法整合：首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至ZT-273A，然后将一步法整合片段电转至带有pKD46质粒的ZT-273A。电转条件同实施例1中(1-2)部分ldhA基因敲除步骤中的第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，引物XZ-ackA-up(SEQ ID No.:39)/lpdA-R-170(SEQID No.:101)进行PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为ZT-273B。
使用和实施例14中(1)部分相同的方法，将人工调控元件M1-93插入到ZT-273B的lpdA*基因前，调控元件替换引物的命名对应于tktA基因过程中所使用的引物名称，仅将tktA替换为ackA或lpdA(表2)，得到菌株ZT-273。
(2)重组大肠杆菌ZT-273的发酵
按照实施例2的方法，对菌株进行培养发酵。发酵结果见表10。结果表明，在Suc-T110菌株中同时增强tktA和sthA基因的表达强度，使得丁二酸产量和转化率分别提高了10%和19%。在此基础上激活丙酮酸脱氢酶，获得额外的还原力供给丁二酸合成。相比Suc-T110，重组大肠杆菌ZT-273的丁二酸产量提高了24%；转化率提高了34%，达到1.5mol/mol。将获得的丁二酸高产菌株ZT-273在含糖浓度更高(7%葡萄糖)的发酵培养基中发酵，丁二酸产量达到566mM，糖酸转化率达到1.48mol/mol。
表10、激活sthA、tktA和丙酮酸脱氢酶对丁二酸生产的影响
a使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。发酵培养基中加入了100mM KHCO3。使用的中和剂为2.4M K2CO3和1.2M KOH。
b初始葡萄糖浓度为5%。
c初始葡萄糖浓度为7%。
将本发明获得的重组大肠杆菌和他人获得的重组大肠杆菌进行比较(表11)，可以到得如下结论：
1)相同发酵条件下，本发明获得的高产菌株HX028的产量和转化率是最高的。与使用钾盐培养的KJ073、KJ122菌株相比，本发明的发酵中使用的是钠盐，比钾盐的成本要低很多。另外，由于激活的磷酸戊糖途径自身能产生二氧化碳，本发明获得的HX024和HX028对碳酸氢根离子的需求量比较低。中和剂组成由2.4M Na2CO3+1.2M NaOH改为1.5M Na2CO3+3MNaOH，丁二酸产量和转化率基本保持一致。这就减少了碳酸钠的使用量，降低了生产成本。
2)AFP111、SBS550MG这两个菌株，虽然转化率达到1.68和1.61mol/mol，但其都是使用丰富培养基，一方面增加了生产成本；另一方面，丰富培养基本身含有碳源，导致得到的转化率偏高。例如，AFP111菌株，其丁二酸产量达99.2g/L，丁二酸转化率达1.68mol/mol(1.1g/g)，乙酸产量达10g/L，乙醇产量达5g/L(Vemuri et al.,2002,J IndMicrobiolBiotechnol28:325-332)，推算出其消耗的葡萄糖为90.2g/L。然而，生产99.2g/L丁二酸，需要消耗葡萄糖88.6g/L(1g葡萄糖转化为1.12g丁二酸)；生产10g/L乙酸，需要消耗葡萄糖15g/L(1mol葡萄糖转化为2mol乙酸)；生产5g/L乙醇，需要消耗葡 萄糖9.2g/L(1mol葡萄糖转化为2mol乙醇)；总共需要消耗88.6+15+9.2=112.8g/L的葡萄糖。实际消耗的葡萄糖比理论上需要消耗的葡萄糖少了112.8-90.2=22.6g/L，是因为发酵培养基中还添加了10g/L酵母膏和20g/L蛋白胨。如果葡萄糖是发酵培养基中的唯一碳源，那么丁二酸的转化率会降低很多。推算最多只有88.6/112.8=78.5%的葡萄糖用于丁二酸合成，另外21.5%的葡萄糖用于乙酸和乙醇的合成。丁二酸的转化率最多只有78.5%×1.71=1.34mol/mol。
另外，AFP111、SBS550MG这两个菌株还使用了好氧-厌氧两步法发酵工艺，好氧培养使菌株生长的过程需要通空气，增加了能量损耗，降低了发酵罐的使用率，提高了生产成本。
3)菌株KJ073在丁二酸合成过程中主要使用PCK进行羧化反应，单独敲除pck基因，丁二酸产量降低88%；其他三个羧化酶对丁二酸合成的贡献不大，分别敲除其他三个羧化酶基因(ppc,maeA,maeB)，丁二酸产量分别降低4%，7%和7%(Zhang et al.,2009a,Proc NatlAcad Sci USA106:20180-20185)。
本发明获得的高产菌株HX024，四个羧化酶对丁二酸合成都有一定的贡献，PPC的贡献最大。单独敲除ppc基因，种子不能在无机盐培养基中生产；使用LB培养基准备种子，再在无机盐发酵培养基中发酵，丁二酸产量下降70%。单独敲除pck,maeA,maeB基因，丁二酸产量分别降低38%，49%和29%。
4)和Suc-T110系列菌株背景最相似的是XZ721(Zhang et al.,AEM,2009b,75:7807-7813)，它们都没有经过进化代谢。
和Suc-T110相比，本发明通过组合改造tktA和sthA，获得重组大肠杆菌ZT-253，将丁二酸的产量提高了10%，转化率提高了19%。和Suc-T110相比，本发明通过组合改造tktA、sthA和丙酮酸脱氢酶，获得重组大肠杆菌ZT-273，将丁二酸的产量提高了24%，转化率提高了34%。
本发明获得的重组菌株ZT-273发酵50g/L葡萄糖，能生产40.8g/L(346mM)丁二酸，转化率达0.98g/g(1.50mol/mol)，丁二酸生产能力优于XZ721。重组菌株ZT-273发酵70g/L葡萄糖，能生产66.8g/L(566mM)丁二酸，转化率达0.97g/g(1.48mol/mol)。
表11比较不同重组大肠杆菌生产丁二酸的能力
参考文献：
Amann E,Ochs B,Abel KJ(1988)Tightly regulated tac promoter vectorsuseful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichiacoli.Gene69:301-315.
Chatterjee R,Millard CS,Champion K,Clark DP,Donnelly MI(2001)Mutationof the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentationof glucose by Escherichia coli.Appl Environ Microbiol67:148-154.
Datsenko KA,Wanner BL(2000)One-step inactivation of chromosomal genesin Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA97(12):6640-6645.
Donnelly MI,Millard CS,Clark DP,Chen MJ,Rathke JW(1998)A novelfermentation pathway in an Escherichia coli mutant producing succinic acid,acetic acid,and ethanol.Appl Biochem Biotechnol 70-72:187-198.
Dower WJ,Miller JF,Ragsdale CW(1988)High efficiency transformation ofE.coli by high voltage electroporation.Nucleic Acids Res16:6127-6145.
Glassner D,Datta R(1992)Process for the production and purificationof succinic acid.US patent5143834.
Guettler M,Jain M,Soni B(1996)Process for making succinic acid,microorganisms for use in the process and methods of obtaining themicroorganisms.US patent5504004.
Gunsalus IC,Hand DB(1941)The use of bacteria in the chemicaldetermination of total vitamin C.J Biol Chem141:853-858.
Jantama K,Haupt MJ,Zhang X,Moore JC,Shanmugam KT,Ingram LO(2008)Materials and methods for efficient succinate and malate production.PCT/US2008/057439.
Jantama K,Haupt MJ,Svoronos SA,Zhang X,Moore JC,Shanmugam KT,IngramLO(2008a)Combining metabolic engineering and metabolic evolution to developnonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate andmalate.Biotechnol Bioeng99:1140-1153.
Jantama K,Zhang X,Moore JC,Shanmugam KT,Svoronos SA,Ingram LO(2008b)Eliminating side products and increasing succinate yields in engineeredstrains of Escherichia coli C.Biotechnol Bioeng101:881-893.
Kim P,Laivenieks M,Vieille C,Zeikus JG(2004)Effect of overexpressionof Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase on succinateproduction in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol70:1238-1241.
Kwon YD,Lee SY,Kim P(2006)Influence of gluconeogenicphosphoenolpyruvate carboxykinase(PCK)expression on succinic acidfermentation in Escherichia coli under high bicarbonate condition.J MicrobiolBiotechnol16:1448–1452.
Lee PC,Lee SY,Hong SH,Chang HN(2002)Isolation and characterization ofa new succinic acid-producing bacterium,Mannheimia succiniciproducensMBEL55E,from bovine rumen.Appl Microbiol Biotechnol58:663-668.
Lu J,Tang J,Liu Y,Zhu X,Zhang T,Zhang X(2012)Combinatorial modulationof galP and glk gene expression for improved alternative glucoseutilization.Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426.
McKinlay JB,Vieille C,Zeikus JG(2007)Prospects for a bio-basedsuccinate industry.Appl Microbiol Biotechnol76:727-740.
Millard CS,Chao YP,Liao JC,Donnelly MI(1996)Enhanced production ofsuccinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase inEscherichia coli.Appl Environ Microbiol62:1808-1810.
Mok YK,Clark DR,Kam KM,Shaw PC,Bsi YI,(1991)A novel thermophilicrestriction endonuclease that recognizes5'CCNNNNNNNGG3'and the discovery of awrongly sequenced site in pACYC177.Nucleic Acids Res19:2321-2323.
Sánchez AM,Bennett GN,San KY(2005)Novel pathway engineering design ofthe anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increasesuccinate yield and productivity.Metab Eng7:229-239.
Scholten E,Renz T,Thomas J(2009)Continuous cultivation approach forfermentative succinic acid production from crude glycerol by Basfiasucciniciproducens DD1.Biotechnol Lett31:1947-1951.
Vemuri GN,Eiteman MA,Altman E(2002)Succinate production in dual-phaseEscherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobicto anaerobic conditions.J Ind Microbiol Biotechnol28:325-332.
Zhang X,Jantama K,Moore JC,Jarboe LR,Shanmugam KT,Ingram LO(2010)Engineering the pathway for succinate production.PCT/US2010/029728.
Zhang X,Jantama K,Moore JC,Jarboe LR,Shanmugam KT,Ingram LO(2009a)Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production inEscherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA106:20180-20185.
Zhang X,Jantama K,Shanmugam KT,Ingram LO(2009b)ReengineeringEscherichia coli for succinate production in mineral salts medium.ApplEnviron Microbiol75:7807-7813.
Zhao J,Li Q,Sun T,Zhu X,Xu H,Tang J,Zhang X,Ma Y(2013)Engineeringcentral metabolic modules of Escherichia coli for improvingβ-caroteneproduction.Metab Eng17:42-50.

Claims (14)

1.一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰：
(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，
(2)pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制，
(3)ldhA基因表达的抑制、和/或ldhA基因所编码的蛋白质活性的抑制，和
(4)galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；
其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰：
(a)编码转酮醇酶的基因tktA表达的增强、和/或基因tktA编码的转酮醇酶活性的增强；和
(b)sthA基因表达的增强、和/或sthA基因所编码的蛋白质活性的增强。
2.权利要求1的大肠杆菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统中所涉及的基因是选自如下的一或多种基因：编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统酶I的基因ptsI、编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统酶Hpr的基因ptsH、编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统酶IIAGlc的基因crr和编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统酶IICBGlc的基因ptsG。
3.权利要求1的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中sthA基因和tktA基因的表达增强、和/或sthA基因和tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。
4.权利要求1-3任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰：
(5)ackA和pta基因表达的抑制、和/或ackA和pta基因所编码的蛋白质活性的抑制；
(6)aceBA基因簇表达的增强、和/或aceBA基因簇所编码的蛋白质活性的增强；
(7)dcuC基因表达的增强、和/或dcuC基因所编码的蛋白质活性的增强；和
(8)mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
5.权利要求1-3任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有突变的lpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修饰：T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID No.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A，
任选地，所述大肠杆菌中所述突变的lpdA基因的表达增强、和/或所述突变的lpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
6.权利要求5的大肠杆菌，其中所述突变的lpdA基因位于质粒或染色体中。
7.权利要求5的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC 7260保藏于CGMCC。
8.权利要求1-3任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的修饰：(9)pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
9.权利要求8的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC 7259保藏于CGMCC。
10.权利要求8的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下修饰：
(10)adhE基因表达的抑制、和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；和
(11)tdcDE基因簇表达的抑制、和/或tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
11.权利要求10的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC 7550保藏于CGMCC。
12.权利要求8的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的遗传改造：aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
13.生产丁二酸的方法，所述方法包括培养权利要求1-12任一项的大肠杆菌。
14.权利要求1-12任一项的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。
CN201310198953.9A 2013-05-24 2013-05-24 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用 Active CN104178443B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310198953.9A CN104178443B (zh) 2013-05-24 2013-05-24 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用
CA2913197A CA2913197C (en) 2013-05-24 2014-05-23 Recombinant e. coli for producing succinate and use thereof
PCT/CN2014/078284 WO2014187357A1 (zh) 2013-05-24 2014-05-23 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用
US14/891,776 US10006063B2 (en) 2013-05-24 2014-05-23 Recombinant Escherichia coli for producing succinate acid and application thereof
EP14800490.6A EP3006556B1 (en) 2013-05-24 2014-05-23 Recombinant escherichia coli for producing succinic acid and application thereof
JP2016514268A JP6191061B2 (ja) 2013-05-24 2014-05-23 コハク酸を生産するための組換え大腸菌、及び組み換え大腸菌の使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310198953.9A CN104178443B (zh) 2013-05-24 2013-05-24 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104178443A CN104178443A (zh) 2014-12-03
CN104178443B true CN104178443B (zh) 2017-04-12

Family

ID=51932910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310198953.9A Active CN104178443B (zh) 2013-05-24 2013-05-24 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10006063B2 (zh)
EP (1) EP3006556B1 (zh)
JP (1) JP6191061B2 (zh)
CN (1) CN104178443B (zh)
CA (1) CA2913197C (zh)
WO (1) WO2014187357A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
CN104178442B (zh) * 2013-05-24 2017-10-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用
KR102266177B1 (ko) * 2013-07-23 2021-06-17 피티티 글로벌 케미컬 퍼블릭 컴퍼니 리미티드 당 이입을 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 및 기타 화학물질의 제조방법
US10301653B2 (en) 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN106995794B (zh) * 2017-04-19 2020-09-18 广西科学院 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途
CN113710807A (zh) * 2019-02-20 2021-11-26 布拉斯科公司 用于由己糖生产含氧化合物的微生物和方法
CN109652434B (zh) * 2019-02-25 2023-03-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
CN112575041B (zh) * 2019-09-30 2022-12-13 江南大学 一种混合碳源高效发酵生产phb的工程菌及其应用
CN112852692B (zh) * 2020-04-14 2022-05-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN114457122B (zh) * 2020-05-13 2023-06-20 安徽华恒生物科技股份有限公司 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN112280725B (zh) * 2020-10-29 2022-08-30 江南大学 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
WO2023093796A1 (zh) * 2021-11-24 2023-06-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产丁二酸的耐酸酵母菌株及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023178A (zh) * 2004-09-17 2007-08-22 莱斯大学 高琥珀酸产出细菌
CN101128577A (zh) * 2004-12-22 2008-02-20 密歇根生物技术研究所 一种提高有机酸产量的重组微生物
WO2009062190A2 (en) * 2007-11-10 2009-05-14 Joule Biotechnologies, Inc. Hyperphotosynthetic organisms
CN102174455A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 天津工业生物技术研究所 生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN102803470A (zh) * 2009-04-02 2012-11-28 佛罗里达大学研究基金会公司 针对生产琥珀酸路径的工程方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143834A (en) 1986-06-11 1992-09-01 Glassner David A Process for the production and purification of succinic acid
US5504004A (en) 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
JP2013524797A (ja) * 2010-04-21 2013-06-20 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． アラビノースを転化できる細胞を製造する方法
RU2466186C2 (ru) 2010-11-13 2012-11-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") БАКТЕРИЯ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ
WO2012071439A1 (en) * 2010-11-22 2012-05-31 The Regents Of The University Of California Host cells and methods for producing diacid compounds
AU2012249389A1 (en) * 2011-04-29 2013-11-14 Danisco Us Inc. Production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids using genes encoding polypeptides having thiolase, HMG-CoA synthase and HMG-CoA reductase enzymatic activities
US9850507B2 (en) * 2012-07-25 2017-12-26 Cargill, Incorporated Yeast cells having reductive TCA pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous NAD(P)+ transhydrogenase enzyme
EP2909325A4 (en) 2012-10-22 2016-05-25 Genomatica Inc MICROORGANISMS AND METHODS FOR ENHANCING THE AVAILABILITY OF REDUCING EQUIVALENTS IN THE PRESENCE OF METHANOL, AND THE PRODUCTION OF SUCCINATE CORRESPONDING
CN104178442B (zh) 2013-05-24 2017-10-31 中国科学院天津工业生物技术研究所 含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023178A (zh) * 2004-09-17 2007-08-22 莱斯大学 高琥珀酸产出细菌
CN101128577A (zh) * 2004-12-22 2008-02-20 密歇根生物技术研究所 一种提高有机酸产量的重组微生物
WO2009062190A2 (en) * 2007-11-10 2009-05-14 Joule Biotechnologies, Inc. Hyperphotosynthetic organisms
CN102803470A (zh) * 2009-04-02 2012-11-28 佛罗里达大学研究基金会公司 针对生产琥珀酸路径的工程方法
CN102174455A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 天津工业生物技术研究所 生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014187357A1 (zh) 2014-11-27
CA2913197C (en) 2019-01-22
CN104178443A (zh) 2014-12-03
EP3006556A4 (en) 2016-11-30
US10006063B2 (en) 2018-06-26
EP3006556A1 (en) 2016-04-13
US20160097064A1 (en) 2016-04-07
CA2913197A1 (en) 2014-11-27
JP2016518145A (ja) 2016-06-23
EP3006556B1 (en) 2020-04-29
JP6191061B2 (ja) 2017-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104178443B (zh) 生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用
CN104694449B (zh) 用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法
AU2004292642B2 (en) Novel rumen bacteria variants and process for preparing succinic acid employing the same
Wang et al. Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinant Escherichia coli with ptsG mutation
US8247201B2 (en) Method for producing an organic acid
Bai et al. Efficient production of succinic acid from macroalgae hydrolysate by metabolically engineered Escherichia coli
CN102803470A (zh) 针对生产琥珀酸路径的工程方法
CN102174455B (zh) 生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN101974476A (zh) 一种高产l-丙氨酸的xz-a26菌株及构建方法与应用
CN104812889B (zh) 通过在低ph下发酵产生有机酸
CN102365357A (zh) 通过发酵产生大量乙醇酸的方法
CN104278003B (zh) 生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用
CN102686718A (zh) 产生有机酸的大肠杆菌菌株的代谢进化
CN102352382A (zh) 一种两阶段发酵生产苹果酸的方法
CN104178442B (zh) 含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用
CN109929786B (zh) 发酵法生产酪氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用
WO2010137130A1 (ja) 有機酸の製造方法
Skorokhodova et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of succinic acid from glucose
Shen et al. Reduced acetic acid formation using NaHSO3 as a steering agent by Actinobacillus succinogenes GXAS137
CN101988079A (zh) 一种利用廉价原料发酵生产d-乳酸的方法
Lee et al. Kinetic study of organic acid formations and growth of Anaerobiospirillum succiniciproducens during continuous cultures

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant