KR102266177B1 - 당 이입을 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 및 기타 화학물질의 제조방법 - Google Patents

당 이입을 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 및 기타 화학물질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효 배지가 하나 이상의 당을 함유하고, 하나 이상의 당이 촉진 확산에 의해 세포로 이입되는 미생물과 함께 발효하여 PEP(phosphoenolpyruvate)에서 유도된 석신산 및 기타 화학물질의 생성에 관한 것이다. 특정 예로서, 석신산은 생체촉매를 이용하여 발효를 통해 글루코오스-함유 재생가능한 공급원료로부터 생성된다. 이러한 생체촉매의 예는 탄소 및 에너지 공급원으로서 글루코오스를 이용하는 이의 능력을 향상시키는 미생물을 포함한다. 본 발명의 생체촉매는 글루코오스, 프럭토오스, 또는 수크로오스를 포함하는 공급원료를 이용하여 상업적 규모에서 하나 이상의 화학물질 (예를 들어, 석신산 및/또는 석신산의 염)을 생성하기 위한 목적으로 원래 구축된 부모 균주의 유전자 조작으로부터 유도된다. 본 발명의 유전자 조작은 글루코오스 또는 프럭토오스의 수송 및 대사에 수반된 외인성 유전자를 부모 균주에 도입하는 것을 포함한다. 또한, 특정 화학물질을 생성하기 위해 유기체를 성장시키기 전에, 글루코오스 또는 프럭토오스의 수송 및 대사에 수반된 유전자를 미생물에 도입시킬 수 있다. 또한, 수크로오스의 수송 및 대사에 수반된 유전자를 사용하여 생물학적 발효에 글루코오스를 이용하는 일부 능력을 가지는 것으로 이미 알려진 균주에 의해 당 수송 및 대사의 효율성을 증대 또는 개선시킬 수 있다.

Description

당 이입을 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 및 기타 화학물질의 제조방법 {Method of Producing Succinic Acid and Other Chemicals Using Facilitated Diffusion for Sugar Import}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2013년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/857,300호의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 당-함유 공급원료를 이용하여 이의 효율성을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 생체촉매 (박테리아 및 기타 미생물)를 이용한 특수 및 범용 유기 화학물질의 제조 분야에 있다. 더 상세하게는, 본 발명은 석신산 및 기타 화학물질의 생물학적 생성을 위해 당의 수송 및 대사를 수반하는 기능을 인코딩하는 유전자의 유전자 변형에 관한 것이다.
다수의 유기 화학물질은 일반적으로 석유화학 공급원료에서 유래된다. 재생가능한 공급원료를 이용한 생물학적 발효 공정을 통해 많은 이러한 석유화학-유래 유기 화합물의 제조에 대한 관심이 증가하고 있다. 재생가능한 공급원료에서 유래될 수 있는 유기 화합물의 목록은 α,ω-디산(diacids) (석신산, 푸마르산, 말산, 글루카르산, 말론산, 및 말레산), 2,5-퓨란 디카복실산, 프로피온산, 3-히드록시 프로피온산, 아스파르트산, 글루카르산, 글루탐산, 이타콘산, 레불린산, 3-히드록시부티로락톤, 글리세롤, 및 부탄디올, 예를 들어 1,4-부탄디올 (미국특허출원 제 20090047719호), 1,3-부탄디올 (미국특허출원 제 20090253192호), 및 2,3-부탄디올을 포함한다. 아미노산, 비타민, 알콜 (예를 들어, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 및 고급 알콜), 지방산, 지방산의 에스터, 탄화수소, 이소프레노이드, 테르펜, 카로테노이드, 아민을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 다른 유형의 유기 화합물도, 재생가능한 공급원료를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 화합물은 본 명세서에서 "원하는 화합물"로 언급될 것이다. 비록 많은 이러한 원하는 화합물의 발효 공정이 개발되었을지라도, 석유화학 공정과 경쟁하기 위하여, 발효의 전반적인 경제성을 개선하기 위해, 예를 들어 생성물 역가 (생성물의 리터 당 그램의 최종 농도) 및 생성물 수율 (글루코오스와 같은 탄소원의 그램 당 생성물의 그램)을 개선하기 위해, 그리고 원하지 않는 부산물, 예를 들어 아세테이트의 역가를 감소시키기 위해 지속적인 필요성이 있다.
대장균(Escherichia coli)을 포함하여, 많은 박테리아는 PTS (phosphotransferase system)라고 불리는 세포에 글루코오스와 기타 당을 활성적으로 수송하기 위해 시스템을 사용한다. 이 시스템은 당을 동시에 수송하고 인산화하기 위해 포스페이트 및 에너지원으로 PEP(phosphoenol pyruvate)를 사용한다. PTS 시스템은 일반적으로 들어오는 당을 이입하고 인산화하기 위해 함께 작용하는 4 이상의 단백질을 필요로 한다. 이들 단백질 중 일부는 정해진 유기체가 PTS에 의해 이입되는 모든 당에 공통적인 반면, PTS의 다른 단백질 성분은 하나 이상의 특정 당에 특이적이다.
예를 들어, 대장균에서, 모든 PTS 경로에 공통적인 단백질은 각각 유전자 ptsH 및 ptsI에 의해 인코딩된 PtsH 및 PtsI 이다. 이러한 2개의 "공통" PTS 단백질 이외에, 하나 이상의 추가 당-특이적 PTS 단백질이 특정 당을 이입하고 인산화하는데 필요하다. 예를 들어, PTS에 의한 글루코오스의 이입은 Crr 및 PtsG로 명명된 2개의 추가 단백질을 필요로 한다. Crr은 A로 불리는 단일 도메인을 가진 세포질 단백질이고, PtsG는 B 및 C로 불리는 2개의 도메인을 가지는 막 단백질이다. PEP의 포스페이트 기는 단백질에서 단백질로 전달되고, 이것이 이입되는 것처럼 최종적으로 6번 위치에 있는 글루코오스로 전달되어 세포 내부에 글루코오스-6-포스페이트를 제공한다. 전달 순서는 PEP로 시작하여 PtsI, PtsH, Crr, 및 최종적으로 PtsG 이다. 역사적으로, 이러한 단백질은 다른 이름, 예를 들어 각각 EI, HPr, EIIAGlc, 및 EIIBC로도 불리웠다. 대장균의 다른 예로서, 프럭토오스는 PtsI, PtsH, FruA, 및 FruB를 이용하여 유사한 전달에 의해 이입되고, 이들 중 마지막 2개는 각각 EIIFru 및 EIIFru로 알려져 있다. 일부 당, 예를 들어 만니톨의 경우, 글루코오스에 대해 상기 언급한 바와 같이 A, B, 및 C에 상응하는 당-특이적 단백질 도메인은 하나의 막 결합 폴리펩티드에 융합되고, 다른 당, 예를 들어 만노오스의 경우, A 및 B 도메인은 하나의 세포질 폴리펩티드에 융합되며, 막 결합 성분은 C 및 D로 불리는 2개의 서브유닛으로 구성된다.
모든 경우에, 시스템은 "공통 서브유닛" (대장균 내 PtsI 및 PtsH)을 필요로 하고, PEP는 에너지 및 포스페이트의 공급원이다. 결과적으로, PTS 시스템에 의해 이입된 모든 당 분자는 하나의 PEP 분자를 이용하고, 하나의 인산화 당 분자 및 하나의 피루베이트 분자를 생성한다. 그러나, PEP는 또한 여러 생화학적 경로, 예를 들어 1) 피루베이트 키나제에 의해 피루베이트 및 ATP의 형성, 2) PEP 카복시키나제 및 PEP 카복실라제에 의해 촉진된 보충 경로(anapleurotic pathways), 둘 다 TCA (tricarboxylic acid) 회로에 탄소를 공급함, 및 3) 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 합성효소 (DAHP 합성효소)의 하나 이상의 동위 효소 (isozymes)에 의해 촉진된 공통의 방향족 아미노산 및 방향족 비타민 생합성 경로에의 진입에서 필수 중간체이다. 따라서, 당 이입을 위한 PTS 시스템과 방금 언급한 기타 경로 사이에 PEP에 대해 불가피한 경쟁이 있다.
그람 양성균 및 그람 음성균 둘 다를 포함하여, 많은 박테리아가 PTS 시스템을 사용하고 있기 때문에, 이것은 분명 진화하는 동안 많은 상황 하에 성행하는 시스템이다. 그러나, 혐기성(anaerobic) 조건 하에, 글루코오스와 같은 당으로부터 ATP의 생성은 호기성(aerobic) 조건 하에서보다 훨씬 덜 효율적이고, 소위 피루베이트 키나제에 의한 "기질 수준" 인산화는 산화성 인산화가 ATP 예산의 대부분을 제공하는 경우 호기성 조건 하에서보다 ATP 생성 예산의 대부분이 된다. 이와 같이, 몇몇 유기체, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) (둘 다 글루코오스 및 기타 당에서 혐기성 성장에 잘 적응함)는, PTS 시스템을 가지지 않으나, 대신 촉진 확산 단백질 (투과효소(permease)라고도 함)을 사용하여 글루코오스 및 기타 당을 이입한다는 것은 주목할 만하다. 또한, PTS를 선천적으로 사용하는 유기체가 유전자 변형되어 발효에 의해 특정 화합물을 과잉 생성하는 경우, 많은 경우에 있어서 경로는 중간체로서 PEP를 사용하고, 그래서 PTS가 PEP의 원하는 생합성 경로와 경쟁한다. PTS의 활성을 감소시킴으로써 이러한 경쟁으로부터의 완화는 원하는 생합성 경로로 흐름을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
예를 들어, PEP는 석시네이트를 야기하는 TCA(tricarboxylic acid) 회로의 환원 지점에서 중간체이다. 대장균 석시네이트 생성자인 KJ122의 대사 진화 동안, ptsI 유전자에서 발생하는 프레임이동 돌연변이(frameshift mutation)는 글루코오스로부터 석시네이트 생성을 증가시켰다. 야생형 ptsI 유전자의 재설치는 석시네이트 생성의 현저한 감소를 야기하였고, 이는 ptsI 돌연변이가 균주 개량에 강하게 기여함을 입증하는 것이다.
또 다른 예로, 방향족 아미노산은 PEP 및 에리트로오스-4-포스페이트로부터 만들어진다. 대장균 균주에서 3개의 pts 유전자의 결실 (ΔptsHI , crr)은, 세포가 탄소원으로 글루코오스에서 성장할 때 방향족 아미노산 생합성 경로로 흐름을 증가시키는 것으로 나타났다.
상기한 예 둘 다에서, 글루코오스의 이입은 아마도 여전히 소위 갈락토오스 투과효소 (GalP, galP 유전자에 의해 인코딩됨)에 의해 일정 수준에서 달성된다. 첫 번째 예에서, galP 유전자의 억제제 (GalS)의 활성을 감소시키는 돌연변이는 대사 진화에 기인하는 것으로 확인되었다 (WO2011/123154). 두 번째 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 성장 속도를 증가시키는 pts 유전자의 결실 후에 발생하였다. 결과로 생긴 균주는 글루코오스에서 유의한 성장을 위해 galP에 의존하고, 균주에서 하나 이상의 돌연변이는 galP의 발현의 증가와 관련될 수 있었다 (US 6,962,794). 그러나, 이러한 두 번째 예의 균주는 방향족 아미노산 생성을 위한 "Pts-/Glu+" 균주를 유전자 변형한 후 방향족 아미노산의 낮은 역가만 생성하였다. 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판은 각각 1.7, 0.8, 및 2.2 g/l에서 생성되었다. 이러한 역가는 경제적으로 매력적인 상업적 과정을 지지하기에 충분히 높지 않기 때문에, US 6,962,794에 개시된 발명이 상업적 생산에 유용하다는 것은 확실하지 않다. 이와 같이, 발효에 의한 화학 물질의 경제적으로 실행가능한 상업적 생산에 대한 발효 매개변수를 개선할 필요성이 여전히 존재한다.
비록 글루코오스 이입을 위해 GalP의 사용이 PEP를 보존할지라도, 이것은 양성자 공동수송체(proton symporter)이고, 그래서 이것은 수송된 각 글루코오스 분자에 대해 ATP의 약 1/3을 소비한다. 몇몇 미생물, 예를 들어 박테리아 지모모나스 모빌리스 및 효모 사카로마이세스 세레비지애는 글루코오스 이입을 위해 촉진 확산을 사용한다. 지모모나스 모빌리스(Z. mobilis)는 글루코오스와 프럭토오스 둘 다를 이입하기 위해 작용하는 하나의 촉진자 단백질(facilitator protein)을 가진다. 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)는 적어도 14개의 다른 헥소오스 이입자를 가지며, 대부분은 글루코오스를 이입하고 그 중 몇몇은 프럭토오스도 이입한다. 이러한 글루코오스 이입 방법은 ATP가 소비되어 글루코오스-6-포스페이트를 형성하고 당이 해당 작용(glycolysis)으로 들어갈 수 있게 된 후, 당이 세포질 내부에 있을 때까지 ATP 소비를 필요로 하지 않는다. 가장 중요한 것은, PTS 시스템과는 달리, PEP를 소비하지 않는다. 이와 같이, 촉진 확산은 명백하게 몇몇 유기체에 대해 잘 작동하고, PTS 시스템 또는 GalP와 같은 양성자 공동수송체보다 PEP 및 ATP에 관하여 세포가 비용이 덜 든다. 잉그램 등 (Ingram et al.) (US 5,602,030)은, 부모가 본래의 글루코오스 촉진 확산 능력을 가지지 않고 다른 글루코오스 이입 시스템이 돌연변이에 의해 비활성화하는 경우, 지모모나스 모빌리스로부터의 촉진 확산 단백질 (Glf, glf 유전자에 의해 인코딩됨), 또한 다중복제 플라스미드에서 이러한 유전자들로부터 발현된 지모모나스 모빌리스로부터의 글루코키나제 (Glk, glk 유전자에 의해 인코딩됨)와 함께, 대장균 균주의 최소 글루코오스 배지에서 성장을 지지하기 위해 기능적으로 PTS를 대체할 수 있음을 입증하였다. 플라스미드에서 2개의 지모모나스 모빌리스 유전자 glf 및 glk를 함유하는 재조합 대장균 ptsG - , ptsM - , glk - 균주 ZSC113은 최소 글루코오스 배지에서 호기적으로 성장할 수 있다.
이러한 개시 내용은 지모모나스 모빌리스 단백질이 대장균에서 0.53 hr-1의 특정 성장 속도와 함께 호기성 성장을 지지하기에 충분하게 작용할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 글루코오스 이입을 위해 본래의 PTS를 이용한 야생형 대장균은 1.0 내지 1.2 hr-1의 호기성 특정 성장 속도를 가지므로, glf를 사용하기 위해 US 5,602,030에서 유전자 변형된 균주는 글루코오스 흡수에 의해 엄격하게 제한되는 것처럼 보인다. 또한, 개시 내용은 촉진 확산 시스템이 혐기성 성장을 지지할 수 있는 것으로 보이지 않았다. 발효에 의해 생성된 많은 중요한 화학 물질은 경제적으로 매력적인 상용 생성 시스템 (WO2012/018699)을 지지하기 위해 양호한 혐기성 성장을 필요로 한다. US 5,602,030 및 스놉 등(Snoep et al) (1994)에 있는 예들은, 완만한 성장이 다중복제 플라스미드로부터 glf 및 glk를 발현함으로써 얻어질 수 있음을 나타내었으나, 성장이 glf 및 glk 유전자의 통합된 복제(integrated copies)에 의해 지지될 수 있다는 것은 입증하지 못하였고, 아직도 종종 플라스미드를 함유하지 않은 균주를 사용하기 위해서는 상업적 규모의 생산이 바람직하다. 최종적으로, US 5,602,030은 glf-기반 시스템이 선천적으로 촉진 확산을 사용하지 않은 대장균 또는 다른 유기체에서 에탄올 또는 석시네이트와 같은 범용 화학물질의 높은 역가 생성을 지지할 수 있다는 것을 입증하지 못하였다. 이와 같이, glf가 PTS를 대체할 수 있고 본래의 촉진 확산 시스템을 가지지 않는 숙주 균주에서 원하는 화학물질을 생성하기 위해 경제적으로 매력적인 발효 공정을 야기한다는 것은 US 5,602,030 단독의 개시 내용으로부터 확실하지 않았다.
탕 등(Tang et al) (2013)은 석시네이트의 혐기성 생성이 ΔptsI, ΔldhA, ΔpflB, pck *인 대장균 균주 환경에서 글루코키나제와 조합하여 지모모나스 모빌리스 glf의 발현에 의해 달성될 수 있음을 나타내기 위해 몇 단계를 더 수행하였다. 그러나, 이 시스템에서 최상의 석시네이트 생성은 단지 96시간에 220 mM (26 g/l)로 적당하였다. glf 및 glk의 발현을 조합 조절하여 최적화함에도 불구하고, 이러한 역가 및 생산성은 glf를 사용하지 않고 83 g/l 석시네이트를 생성하는 앞서 발표된 균주의 것과는 거리가 멀다. 따라서, 탕 등의 보다 향상된 작업에도 불구하고, 글루코오스 이입을 위해 촉진 확산의 사용은 경제적으로 매력적인 상업적 생산에 필요할 수준에서, 즉 적어도 83 g/l (WO2012/018699)의 기준(benchmark)에서 발효 생성 매개변수를 실제로 개선시키는데 유용하였다는 것이 여전히 입증되지 않았다. 대장균 및 다른 박테리아에서 glf에 의한 PTS의 잠재적인 대체를 더 복잡하게 하기 위해, PTS의 성분은 많은 다른 대사 경로에 영향을 미치는 많은 다양한 조절 기능을 가지고 있다, 그래서 이러한 영향이 임의의 결과의 변형된 균주의 전체 생리학 및 발효 특성에 대해 임의의 하나 이상의 PTS 유전자에서 결실일 것이라는 것을 예측하는 것은 불가능하다. 글루코오스 흡수를 위해 선천적으로 촉진 확산을 사용하는 본래의 지모모나스 모빌리스는, 최대 약 60 g/l의 에탄올 및 유사한 양의 글루코오스로부터의 이산화탄소를 생성할 수 있다. 지모모나스 모빌리스의 유전자 변형된 균주는 글루코오스로부터 64 g/l의 석시네이트를 생성한다고 보고되어 있다 (EP20070715351). 그러나, 발효 배지에서 10 g/l의 효모 추출물을 필요로 하는 이러한 발효는, 이의 비용 및 효모 추출물 성분으로부터 석시네이트의 하류 정제에 필요한 증가된 경비 때문에, 석신산의 상업적 생산에는 바람직하지 않다. 또한, 지모모나스 모빌리스는 종종 발효 공정에서 사용하는데 알맞거나 또는 최적의 숙주 유기체가 아니다.
따라서, 종래 기술을 요약하면, 대장균은 글루코오스의 촉진 확산을 사용하기 위해 유전자 변형하여 적당한 속도로 호기성 성장을 지지할 수 있고, 호기적으로 적당한 수준의 석시네이트 생성을 지지할 수 있음을 나타내었으나, 글루코오스 이입을 위해 촉진 확산의 외래(non-native) 사용을 부여하기 위해 유전자 변형되고, 발효에 의한 화학물질의 생성을 위해 PTS 및/또는 GalP와 같은 본래의 글루코오스 이입 시스템을 이용한 균주에 비해 향상된 임의의 박테리아 균주 또는 공정에 대해서는 개시되어 있지 않았다. 또한, 글루코오스 이입을 위해 촉진 확산을 사용하고, 상업적으로 매력적인 배지, 예를 들어 최소 글루코오스 배지에서 충분히 높은 역가, 수율, 및 속도에서 석시네이트 또는 에탄올 및 이산화탄소 이외의 임의의 화학물질을 생성할 수 있는 임의의 박테리아 균주 또는 공정에 대해서도 개시되어 있지 않았다. 이와 같이, 생산성, 배지의 비용, 및 하류 정제를 포함하여 모든 요인을 고려할 때, 경제적으로 매력적인 공정으로 석시네이트 및 화학물질을 생성할 수 있는 개선된 균주가 여전히 필요하다.
미국특허번호 제 5,602,030호 미국특허번호 제 6,962,794호 미국특허번호 제 7,220,561호 미국특허번호 제 8,389,214호 미국특허번호 제 8,476,041호 미국특허출원 공개번호 제 20050079617호 미국특허출원 공개번호 제 20090047719호 미국특허출원 공개번호 제 20090253192호 미국특허출원 공개번호 제 20100184171호 유럽특허 문서번호 제 EP20070715351호 유럽특허 문서번호 제 EP0785275B1호 국제특허출원 공개번호 WO 2010/115067 국제특허출원 공개번호 WO2011/123154 국제특허출원 공개번호 WO2012/018699
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본 발명은 생체촉매 (예를 들어, 유전자 변형된 미생물) 및 상업적으로 중요한 생성물, 예를 들어 특수 및 범용 화학물질이나 이에 한정되지 않는 생성물의 발효 생성을 개선시키기 위해 글루코오스의 촉진 확산을 이용하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 당-함유 재생 가능한 공급원료를 이용하여, 유기산, 아미노산, 및 이의 생합성 경로에서 생화학 중간체로서 PEP를 가지는 기타 생화학물질의 발효 생성에서 유용하다. 특정 예로서, 본 발명은 당의 촉진 확산을 사용하도록 구축된 생체촉매를 이용하여 글루코오스, 프럭토오스, 또는 수크로오스-함유 재생가능한 공급원료로부터 석신산의 발효 생성에서 유용하다. 본 발명의 원리는 발효에 의해 생성될 수 있는 많은 다른 원하는 화합물, 특히 TCA 회로의 화학물질 중간체 또는 이의 유도체, 예를 들어 푸마르산, 말산, 글루타메이트, 글루타메이트의 유도체, 아스파르테이트, 아스파르테이트의 유도체, 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판), 및 중심 방향족 경로에서 중간체로부터 유도된 화합물, 예를 들어 비타민 및 시스,시스-뮤콘산(cis,cis-muconic acid)에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 글루코오스와 같은 당의 촉진 확산에 수반된 단백질을 코딩하는 유전자는, 촉진 확산에 의해 발효 배지로부터 에너지 및 탄소원으로서 당을 이입하기 위해 생체촉매에 새로운 능력을 부여하기 위하여, 또는 당 수송 및 대사를 위해 생체촉매의 이미 존재하는 능력을 증대 또는 개선시키기 위하여 다양한 생체촉매에 도입될 수 있다. 촉진 확산에 의해 당을 추가 이입하는 능력을 가지도록 유전자 변형된 균주는 부모 균주의 매개변수, 예를 들어 증가된 역가 (g/l의 원하는 화학물질), 증가된 수율 (소비된 당의 그램 당 생성된 생성물의 그램), 증가된 특정 생산성 (g/l-hr의 생성물 형성), 및/또는 아세테이트, 피루베이트 및/또는 아미노산과 같은 원하지 않는 부산물의 감소된 역가와 비교할 때, 개선된 발효 매개변수를 가질 수 있다. 이러한 개선된 매개변수는 에너지의 보존 (예를 들어, GalP와 같은 양성자 공동수송체를 구동하기 위해 양성자 구배(proton gradients)의 형성에 대해 ATP의 덜 사용), 중간체로서 PEP를 사용하는 경로, 예를 들어 석시네이트 경로를 위해 PEP의 보존, 및 아세테이트 생성 경로 또는 기타 원하지 않은 경로로 과잉 대사의 감소에 기인할 수 있다.
이러한 방법은 PEP를 통해 적어도 부분적으로 유도된 화학물질, 예를 들어 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 락테이트, 에탄올, 부탄올, 프로판디올, 3-히드록시프로피온산, 아크릴산, 프로피온산, 젖산; 글루타메이트, 아스파르테이트, 메티오닌, 리신, 트레오닌, 및 이소류신과 같은 아미노산; 중심 방향족 경로로부터 유도된 화합물, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 방향족 비타민, 방향족 비타민-유사 화합물; 및 생합성 중간체로서 PEP로부터 유도된 임의의 기타 화합물의 생성에 특히 유리하다.
일 실시예에서, 본 발명은 촉진 확산에 의해 당을 이입하기 위한 새로운 능력을 부여하는 추가의 이종 유전자 (또는 유전자들)와 함께 촉진 확산에 의해 당을 이입하는 능력을 선천적으로 가지지 않은 생체촉매를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 부모 생체촉매보다 원하는 발효 생성물의 높은 역가를 생성하는 새로운 생체촉매를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 부모 생체촉매보다 원하는 발효 생성물의 높은 수율을 생성하는 새로운 생체촉매를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 부모 생체촉매보다 원하는 발효 생성물의 높은 특정 생산성을 생성하는 새로운 생체촉매를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 부모 생체촉매보다 원하지 않는 부산물의 낮은 역가를 생성하는 새로운 생체촉매를 제공한다.
당의 촉진 확산에서 작용하는 단백질 또는 단백질들을 코딩하는 유전자 또는 유전자들은 당의 촉진 확산을 수행하는 본래의 능력을 가지는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있으며, 단지 요건은 단백질 또는 단백질들이 새로운 숙주에서 작용할 수 있는 것이다. 당이 세포질에 들어간 후 당을 인산화하는데 필요한 당 키나제, 예를 들어 글루코키나제를 인코딩하는 유전자는, 촉진 확산을 위해 유전자에서 생성된 동일한 공여자(donor)로부터 유래될 수 있고, 또는 수여자 숙주로부터의 본래의 당 키나제 유전자가 사용될 수 있고, 또는 양쪽의 당 키나제의 조합이 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 당을 이입하기 위해 촉진 확산을 사용하는 유전자 변형된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 원하는 발효 생성물의 제조방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 촉진 확산을 사용하기 위해 유전자 변형된 균주의 발효 성능 매개변수 (역가, 수율, 특정 생산성, 부산물 형성의 최소화)를 개선하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 당을 이입하기 위해 촉진 확산을 사용하는 유전자 변형된 미생물에서 성장 및 발효 매개변수의 개선을 야기하는 촉진 확산 및 당 키나제 활성의 개선된 균형을 달성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 하나의 방법은 촉진 확산에 의해 당을 이입하기 위한 새로운 능력을 제 1 수여자 유기체에게 부여하기 위하여, 관련된 유전자 (예를 들어, glf 또는 glk 또는 이들의 조합)를 선천적으로 함유하는 제 2 공여자 유기체로부터 관련된 유전자를 선천적으로 함유하지 않는 제 1 수여자 유기체에게로 당을 이입하기 위한 촉진 확산 시스템을 유전적으로 전달하는 것이다. 바람직한 실시예에서, 제 1 수여자는, 제 1 수여자 균주의 부모 또는 조상에 존재하는 임의의 본래의 시스템 또는 시스템들에 의해 당을 이입하는 이의 능력이 없는, 또는 실질적으로 감소되는 것으로 미리 변형되거나 또는 구축되었다. 이러한 실시예에서, 결과의 균주는 사실상 상기 당에서 성장을 위해 촉진 확산을 사용하도록 강요당한다.
바람직한 실시예에서, 제 1 수여자 균주는 대장균 균주이고, 제 2 공여자 균주는 지모모나스 모빌리스 CP4이다. 더 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 균주는 WG53이고, 이는 ptsH , ptsI , 및 galP의 결실에 의해 KJ122로부터 유도된다. ptsH , ptsI, 및 galP의 결실의 추출물 특성은 크게 다를 수 있고, 단지 중요한 기준은 PtsH, PtsI, 및 GalP 단백질의 활성이 제거되거나 또는 실질적으로 감소된다는 것이다.
본 발명의 제 1 수여자 유기체는 크게 다를 수 있고, 단지 기준은 글루코오스와 같은 당에 대해 촉진 확산에서 작용하는 단백질을 선천적으로 함유하지 않는다는 것이다. 대장균 이외에, 제 1 수여자 유기체의 예는 하기의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마르베(Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코서스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티컴(Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis), 아트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아트로박터 투메센스(Arthrobacter tumescens), 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 히드로카르보글루타미쿠스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아우레오박테리움 사페르다에(Aureobacterium saperdae), 아조박터 인디커스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼(divaricatum), 브레비박테리움 락토페르멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보섬(Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 퍼스컴(Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글루타미컴(Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜럼(Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 퍼실룸(Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움(Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 임마리오필리움(Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨스 (Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미애(Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필럼(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리넘(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 퍼카툼(Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티눔 (Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세와넨스(Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레베 (Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닌고셉티컴(Flavobacterium meningosepticum), 마이크로코커스 균(Micrococcus sp.) CCM825, 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 노카디아 오파카(Nocardia opaca), 노카디아 루고사 (Nocardia rugosa), 플라노코커스 유시나터스(Planococcus eucinatus), 프로테우스 레테게리(Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 세르마니(Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 신젠타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스터트제리 (Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 아시도볼란스(Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시도렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 로도크로스 (Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스 균(Rhodococcus sp .) ATCC 15592, 로도코커스 균 ATCC 19070, 스포로사르시나 우레애(Sporosarcina ureae), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 비브리오 메츠니코비(Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로제네스(Vibrio tyrogenes), 악티노마두라 마두레(Actinomadura madurae), 악티노마이세스 비올라세오크로모제네스(Actinomyces violaceochromogenes), 키타사토스포리아 파룰로사(Kitasatosporia parulosa), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 플라벨러스(Streptomyces flavelus), 스트렙토마이세스 그리세올러스(Streptomyces griseolus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리바세우스 (Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 타나시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 버지니에(Streptomyces virginiae), 스트렙토마이세스 안티바이오티커스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이세스 카카오이 (Streptomyces cacaoi), 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 티아미놀리티커스(Bacillus thiaminolyticus), 에세리키아 프레운디(Escherichia freundii), 마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 스코트물레리(Salmonella schottmulleri), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀롤리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquifaciens), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 배일리(Acinetobacter baylyi), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacteium flavum), 맨하이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens) 및 안에어로비오스피릴룸 석시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 및 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri).
제 2 공여자 유기체의 예는 당에 대해 본래의 촉진 확산 시스템을 가지는 임의의 균주 또는 종, 예를 들어 지모모나스 모빌리스 균주 (균주 CP4 이외에), 호모 사피엔스, 아조스피릴룸 아마조넨스(Azospirillum amazonense), 플라보박테리아세애 박테리움(Flavobacteriaceae bacterium) S85, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 기타 효모 속(yeast genera) 이다.
다른 실시예에서, 제 1 부모 균주는 먼저 당의 이입을 위해 촉진 확산을 사용하도록 구축된 다음, 결과의 균주는 더 변형되어 석신산과 같은 관심있는 상용 화학물질을 과잉 생성한다.
본 발명의 새로운 측면은 새로 구축된 박테리아가 경제적으로 실행가능한 공정으로 상업적으로 실행가능한 생성물을 생성할 수 있도록, 비-병원성, 건강한 당 이용자로부터의 glf 유전자를 박테리아의 염색체에 안정되게 통합하는 것이다. 글루코오스 또는 다른 당으로부터의 생성물의 역가, 수율 및/또는 특정 생산성은 부모 유기체의 이러한 매개변수들보다 크다. glf 유전자는 성장 또는 생성물 생성의 임의의 관련 측면을 간섭하지 않는 염색체 내의 위치에서 통합된다. 아세테이트 역가는, 종래 기술의 예와는 달리, 2일 발효 주기 시간을 허용하는, 대표적인 발효에서 약 45 내지 48시간에 부모 균주의 역가보다 적다. 당 이입을 위해 촉진 확산을 사용한 종래 기술에서의 균주는 경제적으로 매력적이게 되는 원하는 생성물의 충분한 역가를 생성하지 않았다. 본 발명의 또 다른 새로운 측면은 뜻밖에도 당 이입을 위해 촉진 확산을 이용함으로써, 원하지 않은 부산물 아세테이트 또는 아세트산의 생성이 상당히 감소되었음을 확인하였다. 종래 기술 균주 KJ122는 일반적인 공급된 글루코오스 발효에서 약 5 내지 7 g/l 아세테이트를 생성하는 반면 (WO2012/018699), 본 발명의 새로운 균주는 단지 약 4.2 g/l 이하만 생성한다.
본 발명의 추가 이점은 하기의 설명으로부터 즉시 명백해질 것이다.
도 1. 지모모나스 모빌리스 glf 및 glk의 발현 카세트의 공급원인, 플라스미드 pAC19의 구조.
도 2. cat (클로람페니콜 내성) 및 sacB (레반 수크라제(levan sucrase)) 유전자를 함유하는 선별 및 역-선별(counter-selectable) 카세트의 공급원인, 플라스미드 pAC21의 구조.
도 3. glk 없이 지모모나스 모빌리스 glf의 발현 카세트의 공급원인, 플라스미드 pSS2의 구조.
도 4. pflD 좌(locus)에서 대장균 crr 유전자의 제 2 복제의 통합의 발현 카세트의 공급원인, 플라스미드 pMH68의 구조.
표 1. 7 리터 발효기에서 AC15에 의한 석시네이트의 생성.
표 2. 500 ml 미량호기성(microaerobic) 발효기에서 AC15의 적색 돌연변이체에 의한 석시네이트의 생성.
표 3. 500 ml 미량호기성 발효기에서 SS8의 2개의 분리물에 의한 석시네이트의 생성.
표 4. 20 리터 미량호기성 발효기에서 YSS41에 의한 석시네이트의 생성.
표 5. 500 ml 미량호기성 발효기에서 MH141에 의한 석시네이트의 생성.
표 6. 20 리터 발효기에서, 대장균 균주 KJ122 및 YSS41의 최적화된 통기 조건 하에 대장균 균주 KJ122 및 YSS41에 의한 석시네이트 생성.
정의.
문구 "예를 들어(for example)" 또는 "예를 들어(such as)"가 사용되는 경우, 이후에 언급된 사항은 개시되는 아이디어 또는 개념에 대한 예문을 의미한다. 이후에 언급된 사항은 아이디어 또는 개념의 일반화에 영향을 받는 다른 특정 사항 또는 예가 포함되는 것을 의미하기 때문에, 제공된 예에 한정되는 것으로 의미되지 않는다. 어떤 화합물의 경우, 상기 화합물의 염을 생성하는데 더 적당할 수 있으며, 예를 들어, 석신산은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 등의 염으로 거의 pH 7에서 생성될 수 있고, 리신은 염화물(chloride), 황산염(sulphate), 중탄산염 (bicarbonate) 등의 염으로 생성될 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에서 화합물로 불리는 것은, 상기 화합물의 임의의 염을 포함하는 것을 의미하며, 염으로 불리는 것은, 유리 산 또는 유기 염기를 포함하는 것으로도 의미한다. 따라서, "석시네이트"는 "석신산"을 포함하는 것을 의미하고 그 반대도 같으며, "아세테이트"는 "아세트산"을 포함하는 것을 의미하고 그 반대도 같다.
"촉진 확산(facilitated diffusion)"은 일반적으로 (ATP 또는 PEP의 가수분해에 의해 제공된 것과 같은) 임의의 에너지 또는 세포에 의해 시스템으로 직접 제공된 다른 화학물질의 구배 (예를 들어, 양성자 구배) 없이 막을 통과하기 위해, "기질"이라고 불리는 하나 이상의 화학물질 (예를 들어, 글루코오스 및/또는 프럭토오스)이나, 일반적인 화학물질 (예를 들어, 특정 기질 이외의 물 및 세포질 대사 산물)은 아닌 화학물질에 특이적으로 작용하는, 생물학적 막에 위치한 내재성 막 단백질(integral membrane protein) (예를 들어, 그람 음성 박테리아의 내막 (inner membrane) 또는 그람 양성 박테리아의 단일 막), 또는 생물학적 막에 위치한 하나 이상의 단백질 분자의 복합체를 포함하는, 시스템의 작용을 의미한다. 만일 농도 구배가 있는 경우, 예를 들어 만일 기질의 농도가 세포 내부에서보다 세포 외부에서 더 높으면, 촉진 확산 시스템이 없는 경우에 발생하는 것보다 더 빠른 속도에서 세포로 기질의 순 유출(net flux)이 있을 것이다. 일반적으로 촉진 확산에 작용하는 단백질은 하나 이상의 기질에 특이적인 결합 친화도를 가지며, 몇 밀리몰 이하의 상대적으로 낮은 농도에서 기질이 막을 횡단하여 통과하도록 시스템을 도울 수 있다. 몇몇 유형의 촉진 확산은 기질을 유리하게 구별하는 막을 통해 기공 또는 채널을 생성함으로써 작용할 수 있고, 다른 유형에서는 단백질이 막의 한쪽 면에 기질을 결합한 다음 막을 통해 회전하여 막의 반대쪽 면에 기질을 방출할 수 있다. 촉진 확산 단백질 (때때로 간단히 촉진자(facilitator)라고 함)은 이러한 시스템의 단백질 성분이다. 따라서, 촉진 확산의 열역학적 구동력(thermodynamic driving force)은 기질 농도의 구배이고, 기질 (예를 들어, 당)은 세포 외부의 높은 농도로부터 세포 내부의 낮은 농도로 흐른다. 우리는 촉진 확산 단백질 및 글루코오스에 대해 특이성을 갖는 이러한 단백질을 인코딩하는 유전자를 각각 의미하는 유전자 기호 Glf 및 glf를 사용할 것이다. 우리는 일반적으로 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되는 것으로 Glf를 고려하나, Glf는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성된 복합체일 수 있다. 비록 본 명세서에 쓰여진 Glf의 특정 예의 기원이 박테리아일지라도, 우리의 정의는 임의의 유기체로부터 유래된 촉진 확산 시스템을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 다른 효모는 HXT1, HXT2, HTX3, HTX4, HTX5, HTX6, HTX7 등으로 명명된 헥소오스 (예를 들어, 글루코오스 및 프럭토오스)를 이입하기 위해 하나 이상의 촉진 확산 단백질을 가지고 있고, 인간 적혈구는 GLUT1으로 명명된 단백질을 통해 글루코오스를 이입 및 이출하기 위해 촉진 확산을 사용한다는 것이 잘 알려져 있다. 기공-촉진 수송 및 담체-촉진 수송을 포함하여, Glf의 작용 메커니즘은 크게 다를 수 있다. 비록 이 명세서에 제공된 특정 예가 글루코오스에 우수한 특이성을 갖는 Glf를 개시하고 있을지라도, Glf 단백질이 하나 이상의 당에 대해 활성적일 수 있고, 예를 들어 지모모나스 모빌리스 및 사카로마이세스 세레비지애로부터의 Glf는 글루코오스 뿐만 아니라 프럭토오스에 대해 활성적일 수 있음이 기술분야에서 알려져 있다.
양성자 공동수송은 구동력으로 양성자 구배를 사용하는 생물학적 막을 통해 기질을 이입하기 위한 시스템으로서 정의된다. 세포의 외부에서 높은 농도의 양성자는 세포로 다시 확산하려는 열역학적 경향을 가진다. 이러한 열역학적 압력을 사용하여 당과 같은 기질을 반입한다. 양성자 공동수송체는 양성자 공동수송을 제공하기 위해 작용하는 단백질 또는 단백질들의 복합체이다. 양성자 공동수송체의 예는 대장균의 GalP 단백질이고, 이것은 갈락토오스, 글루코오스, 및 기타 당의 이입에서 작용하는 것으로 잘 알려져 있다.
글루코키나제 및 프럭토키나제는 일반적으로 6번째 탄소 위치에서 글루코오스, 프럭토오스, 또는 기타 당의 인산화를 촉진하는 효소이나, 대안적으로 첫 번째 탄소 위치 또는 다른 위치에서도 가능하다. 우리는 글루코키나제 및 글루코키나제를 인코딩하는 유전자를 각각 의미하는 것으로 유전자 기호 Glk 및 glk를 사용할 것이다. Frk 및 frk는 각각 프럭토키나제 및 프럭토키나제를 인코딩하는 유전자를 의미한다.
crr 유전자는 PTS의 EIIAglc 성분을 인코딩하는 유전자, 예를 들어 대장균 균주 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 crr 유전자, 또는 이러한 crr 유전자의 상동체이다.
PTS (phosphotransferase system)는 포스페이트와 에너지의 공급원으로서 PEP를 이용하여, 당을 세포질로 펌프하고 동시에 당을 인산화하기 위해 함께 작용하는 단백질들의 군이다. 대장균으로부터의 PTS 단백질을 인코딩하는 유전자의 예는 ptsH , ptsI , crr , ptsG , fruA , fruB , manX , manY , 및 manZ을 포함한다. 상응하는 단백질은 PtsH, PtsI, Crr, PtsG, FruA, FruB, ManX, ManY, 및 ManZ로 명명된다. 그러나, 대장균 및 다른 원핵생물로부터 더 많은 예들이 있으며, 이러한 단백질들은 다른 명칭을 가질 수 있고, 예를 들어 Crr은 때때로 EIIAglc로 명명된다. PTS 단백질 중 몇몇은 다른 당보다 하나 이상의 특정 당에 더 특이적인 반면, 몇몇 PTS 단백질, 예를 들어 대장균으로부터의 PtsH 및 PtsI는 많은 다른 당에 대해 공통적으로 사용된다.
이 명세서에서, 용어 "미량호기성(microaerobic)"은 공기의 공급 속도가 분당 액체 배양물의 부피당 0.1 부피 미만의 공기라는 것을 의미한다. 본 명세서에 개시된 7 및 20 리터 발효기 예에서, 이것은 살포기(sparger) 및 유량계(flow meter)로 달성되거나, 또는 탱크가 임의의 강제 공기 흐름 없이 탱크의 꼭대기에 부착된 멸균 막을 통해 호흡할 수 있음으로써 달성된다. 본 명세서에 개시된 500 ml 발효기 탱크 예에서는, 공기가 의도적으로 도입되지 않으나, 적은 양의 공기가 누출, 염기 용액의 공급, 및 시료의 채취로부터 도입된다.
"최소 배지"는 물, 순수한 탄소원 (예를 들어, 실질적으로 순수한 당 또는 실질적으로 순수한 당들의 혼합물), 무기염 (예를 들어, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 중탄산염 + 탄산염, 인산염, 황산염 및 염화물), 순수한 질소원, 예를 들어 암모늄 또는 우레아, 미량 금속 (철, 구리, 아연, 망간, 코발트, 몰리브덴, 및 임의로 보레이트), 임의로 글리신 베타인 (간단히 베타인으로도 알려짐), 및 임의로 소포제(antifoam agent)로 구성된 미생물 성장 배지이다. 최소 배지는 효모 추출물, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 콩 가수분해물(soy hydrolysate), 배양액 (broth), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 곡물(grain), 콩과 식물 (legume)과 같은 임의의 복합 ("풍부"로도 알려짐) 영양소 공급원, 또는 임의의 물리적 또는 화학적 정제 또는 분리 단계 없이 일반적으로 농업 공급원(agricultural source)으로부터 유도될 영양소들의 다른 "정의되지 않은" 혼합물을 함유하지 않는다. 사탕수수, 옥수수 전분, 수수 전분(sorghum starch), 타피오카 전분(tapioca starch)으로부터 유도된 상당히 순수한 당, 또는 다른 상당히 순수한 전분 공급원은 최소 배지에 허용되는 것으로 간주된다. 최소 배지는 특정 성장 요건 (영양요구성(auxotrophy) 또는 브래디트로피(bradytrophy))을 충족시키기 위해 또는 생화학적 경로를 향상시키기 위해 하나 또는 소수의 순수한 화학물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 균주는 바이오틴과 같은 비타민을 필요로 하고, 공정에 현저한 부정적인 영향을 미치지 않고 적은 농도로 가해질 수 있다. 또 다른 예로서, 성장에 전혀 필요하지 않은 티아민과 같은 비타민의 첨가는, 그럼에도 불구하고 성장 또는 생화학적 경로를 향상시킬 수 있다. 최소 배지는 성분의 상대적으로 낮은 비용, 및 원하는 화학물질의 하류 정제에 더 유리한 경제성을 고려하여 더 깨끗한 발효 배양액을 생성하기 때문에 많은 화학물질의 발효 생성에 바람직하다. 하류 정제는 복합 배지로부터 원하는 생성물의 경제적으로 매력적인 정제 방법인 증류로 달성될 수 있기 때문에, 에탄올 생성은 예외이다.
방향족 생화학 물질은 하기의 것들 중 하나 이상을 의미한다: 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판, 또는 이의 유도체 (예를 들어, L-디히드록시페닐알라닌, 멜라토닌, 인돌, 인돌 아세트산, 인디고, 세로토닌, 신남산, 히드록시 스티렌), 방향족 부분을 함유하는 비타민 또는 비타민-유사 화합물 (예를 들어, p-히드록시벤조산, 2,3-디히드록시벤조산, p-아미노 벤조산, 폴레이트(folate), 토코페롤, 피롤로퀴놀린 퀴논(pyrroloquinoline quinone)).
제 1 유전자 또는 단백질의 상동체는, 제 2 단백질 또는 제 2 유전자로부터 번역되는 것으로 유추되는 단백질이 제 1 단백질 또는 제 1 유전자로부터 번역되는 것으로 유추되는 단백질과 동일하거나 유사한 생화학적 기능을 가지고, BLAST와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 정렬 프로그램의 기본 매개변수(default parameter)를 이용할 때, 제 1 및 2 단백질 또는 제 1 및 2 유추된 번역된 단백질의 정렬(alignment)이 적어도 50 아미노산 길이의 영역에 대해 25% 이상 동일성 또는 유사성을 야기하는, 제 2 유전자 또는 단백질로 정의된다.
돌연변이는 관련된 야생형 또는 본래의 유전자의 DNA 서열에 관하여 DNA 서열의 임의의 변화이다. 돌연변이는 미성숙 정지 코돈(premature stop codon) 또는 그 위치에서 야생형 아미노산과 다른 아미노산을 도입하는 단일 또는 다중 염기 변화일 수 있다. 돌연변이는 야생형 단백질과 상당히 다른 단백질을 야기하는 프레임 이동을 일으키는 하나 이상의 염기의 삽입 또는 결실일 수 있다. 돌연변이는 코딩 영역 (orf(open reading frame)로도 알려짐)의 많은, 대부분, 또는 모두를 제거하는 결실일 수 있다. 하나의 유형의 돌연변이는 하나 이상의 완전한 orfs + 코딩 영역의 상류 또는 하류, 또는 둘 다의 추가 비-코딩 DNA를 제거한다. 돌연변이는 상대적으로 큰 DNA 서열 (약 100 이상의 염기)의 삽입, 예를 들어 삽입 요소 (예를 들어, IS186 또는 IS4) 또는 트랜스포존 (예를 들어, Tn10)에 기인할 수 있다. 취지가 기능을 제거하는 것인 경우, 바람직한 돌연변이는 orf의 모두 또는 대부분의 결실이나, 단일 염기 변화 또는 삽입과 같은 더 작은 돌연변이가 종종 실제로 기능의 제거를 달성할 수 있다. 돌연변이는 돌연변이생성에 의해 유도되거나, 또는 유전자 변형에 의해 구축되는, 자발적일 수 있다. 어떤 돌연변이는, 균주 개량을 달성하는 것이 바람직할 경우, 생물학적 기능, 예를 들어 PTS의 특정 요소를 감소 또는 제거하는 돌연변이이다. 그러나, 어떤 돌연변이는, 균주 개량을 달성하는 것이 바람직할 경우, 생물학적 기능을 증가시키는 돌연변이이고, 예를 들어 "프로모터 업 돌연변이(promoter up mutation)"는 바람직한 유전자, 예를 들어 glf 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
"외인성(exogenous)"은 제 1 속(genus)에서 설치된 제 2 속으로부터 유래된 유전자 또는 단백질을 의미하고, 상기 제 2 속은 상기 제 1 속과 다른 속이다.
유전자는 단백질 또는 효소를 인코딩하는 염색체의 영역으로 정의되며, 단백질 또는 효소에 상응하는 ORF(open reading frame) 및 단백질 또는 효소, 예를 들어 프로모터, 리보좀 결합 부위, 오퍼레이터(operators), 조절 단백질 결합 부위, 5' 번역되지 않은 mRNA 리더 서열에 상응하는 DNA, 종결자(terminators), 및 항종결자(antiterminator) 부위의 생성 수준 또는 속도를 조절하는데 기여하는 ORF 주위의 임의의 DNA 서열을 포함하는 것을 의미한다. DNA 서열을 코딩하는 단백질에 상응하는 2 이상의 ORF가 단일 프로모터 및 단일 종결자의 조절 하에 있을 때, 프로모터, DNA 서열을 코딩하는 단백질에 상응하는 ORF 및 종결자를 포함하는 전체 영역을 오페론이라고 한다. 예를 들어, 외인성 유전자 glf 및 glk가 단일 프로모터 및 단일 종결자의 조절 하에 있을 때, 이것을 glf - glk 오페론이라고 한다.
본 발명은 탄소원으로서 당이 있는 최소 배지를 이용하여 높은 역가, 수율 및 생산성의 석신산 생성을 위한 생체촉매를 제공한다. 본 발명에서 정의된 용어 "수율"은 소비된 당 (예를 들어, 글루코오스 또는 수크로오스)의 그램당 생성된 생성물 (예를 들어, 석신산)의 그램 수를 나타낸다. 본 발명에서 정의된 용어 "생산성"은 시간당 배양물의 리터당 생성된 생성물 (예를 들어, 석신산)의 그램 수를 나타낸다. 본 발명에서 정의된 용어 "역가"는 리터당 그램의 발효 배양액에서 생성물 (예를 들어, 석신산)의 농도를 나타낸다. 석신산의 바람직한 수율은 소비된 당의 그램당 생성된 석신산의 0.8 - 1.2 그램의 범위 내이다. 본 발명에서 석신산의 바람직한 생산성은 시간당 리터당 생성된 석신산의 1 그램 이상의 범위 내이다. 석신산의 바람직한 역가는 48시간 이하의 발효 시간에서 26 g/l 이상, 또는 바람직하게는 64 g/l 이상, 가장 바람직하게는 83 g/l 이상이다.
박테리아 성장 속도는 박테리아 증식으로 인한 액체 배양물의 550 또는 600 나노미터의 광학 밀도(optical density)의 증가 속도로 측정된다. 또한, 박테리아 성장 속도는 박테리아 세포의 두배(doubling)에 필요한 시간으로 나타낸다. 본 발명에 적합한 박테리아 세포에서, 박테리아 세포는 20분 및 3시간 사이의 배가 시간 (doubling time)을 가질 것으로 예상된다.
본 발명에 따른, 석신산 생성을 위한 생체촉매는 2개의 다른 방법으로 개발될 수 있다. 첫 번째 방법 하에서, 야생형 박테리아 종은 글루코오스 또는 다른 당의 이입을 위해 촉진 확산을 이용하여 효율적으로 성장시키기 위해 유전자 조작되고, 임의로 진화된다. 일단 이러한 균주가 구축되면, 기술분야에서 알려진 하기의 방법에 의해 높은 역가, 수율 및 생산성을 갖는 석신산 또는 다른 바람직한 화학물질을 생성하는 박테리아 균주를 얻기 위해 대사 경로에서 차후의 유전자 조작을 수행한다.
특허협력조약 하에 공개된 특허출원 공개번호 WO 2010/115067 및 미국특허출원 공개번호 US 20100184171은 개선된 석신산 생성 능력을 가진 대장균의 균주 생성에 유용한 유전자 변형 기술에 관하여 상세히 제공한다. 이러한 2개의 특허출원은 참조로 본 명세서에 포함된다.
두 번째 방법 하에서, 특허출원 공개번호 US 20100184171 및 WO 2010/115067에 기재된 석신산과 같은 화학물질의 상업적으로 매력적인 수율 및 생산성을 가지도록 이미 개발된 박테리아 균주는 부모 균주로서 사용된다. 상업적으로 매력적인 역가, 수율 및 생산성의 석신산을 생성하기 위해 글루코오스 또는 다른 당을 이입하기 위해 촉진 확산을 사용하는 능력을 가진 박테리아 균주를 얻기 위해 이 균주와 함께 유전자 조작, 및 임의로 진화를 더 수행한다.
특정 예로서, 본 발명은 촉진 확산에 의해 당을 이입하는 새로운 능력을 얻는 동안 충분히 높은 역가, 수율 및 생산성의 석신산을 생성하기 위해 종래 기술의 것보다 개선된 능력을 갖는 생체촉매 및 방법을 개시한다. 예를 들어, 잔타마 등 (Jantama et al.)에 의해 기재된 대장균의 KJ122 균주는 본 발명의 시작 균주로서 선별될 수 있다. 대장균의 KJ122 균주는 높은 역가 및 생산성으로 최소 배지에서 석신산을 생성하는 능력을 가지는 것으로 보고되어 있다.
대장균의 KJ122 균주는 미국특허출원 공개번호 제 20100184171호 및 국제특허출원 공개번호 WO 2010/115067에 기재된 유전자 결실 및 대사 진화를 통해 대장균 C 균주로부터 유래되었다. 대장균의 KJ122 균주의 성장으로 이어지는 유전자 변화에 관하여 상세히 제공하는 이러한 2개의 특허출원 공개 문서는 참조로 본 명세서에 포함된다. KJ122는 석신산의 생성에서 촉진 확산에 의해 탄소원으로서 글루코오스를 이입하는 임의의 실질적인 능력을 가지지 않는다. KJ122에서 이러한 기능의 부재는 Glf 단백질을 인코딩하는 유전자의 부족에 기인한다. 발명자들은 최소 배지에서 높은 역가, 수율, 및 생산성의 석신산을 생성하는 이의 원래 능력을 유지 또는 개선하는 동안, KJ122가 탄수화물의 공급원으로서 글루코오스를 더 효율적으로 사용할 수 있는 유전적 방법을 발견하였다.
본 발명에서 사용된 용어 "탄수화물"은 글루코오소, 프럭토오스, 자일로오스, 및 아라비노오스와 같은 단당류; 수크로오스, 멜리비오스(melibiose), 말토오스 및 락토오스와 같은 이당류; 라피노오스 및 말토트리오스와 같은 삼당류; 및 고급 올리고당; 및 전분, 셀룰로오스, 및 바이오매스와 같은 다당류의 효소 소화 또는 화학적 소화로부터 유도된 가수분해물 (hydrolysates)을 포함한다. 1 내지 3의 당류(saccharide) 단위를 가진 탄수화물인, 간단한 탄수화물은 "당(sugars)", 예를 들어 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 말토오스 등으로 본 명세서에 나타낸다.
용어 "PTS+ 유기체" 또는 "PTS+ 박테리아"는 PTS를 기반으로 한 탄수화물 수송 능력을 갖는 박테리아를 나타낸다. 용어 "비-PTS 유기체" 또는 "비-PTS 박테리아" 또는 "PTS-" 박테리아는, PTS의 활성이 야생형 PTS의 활성에 비해 감소되도록, PTS 기능을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에서 돌연변이되는 박테리아 세포를 나타낸다.
하나의 측면에서, 본 발명은 당의 이입 및 당을 대사 중간체, 예를 들어 세포에 의해 더 대사작용될 수 있는 글루코오스 6-포스페이트, 글루코오스 1-포스페이트, 프럭토오스 6-포스페이트, 또는 프럭토오스 1-포스페이트로 변환하는데 수반되는 하나 이상의 단백질 및/또는 효소의 활성을 설치하거나 또는 증가시키기 위하여, 유기체에 유전자를 첨가하는 것이 개시되어 있다. 관련된 단백질 또는 효소를 인코딩하는 유전자는 glf 유전자, HXT 유전자, glk 유전자, 및 frk 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 재생 가능한 공급원료로서 글루코오스와 같은 당을 이입하기 위해 촉진 확산을 이용한 석신산 또는 다른 화학물질의 제조방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 조상 또는 부모 균주의 것에 비해 유기체의 본래의 PTS 시스템의 적어도 하나의 단백질에서 감소된 활성을 가지는 생체촉매를 이용하는 당-함유 배지로부터 석신산의 제조방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 단백질 공동수송 시스템, 예를 들어 GalP의 이용을 수반하는 조상 또는 부모 균주의 것에 비해 유기체의 본래의 당 이입 시스템의 적어도 하나의 단백질에서 감소된 활성을 가지는 생체촉매를 이용하는 당-함유 배지에서 석신산 또는 다른 화학물질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 PTS 및 박테리아 탄수화물 흡수 시스템을 조작하는 방법을 제공한다. EI 및 HPr 단백질은 PTS 시스템의 "일반적" 또는 "공통" 성분으로 작용하기 때문에, EI 단백질을 코딩하는 ptsI 유전자 또는 HPr 단백질을 코딩하는 ptsH 유전자의 비활성화는 PTS의 완전한 활성화를 야기할 것이다. ptsH 또는 ptsI 또는 둘 다의 활성이 감소되거나 또는 제거될 때, 박테리아 세포에서 PTS 시스템을 통해 탄수화물 수송이 실질적으로 덜할 것이다. PTS가 부분적으로 또는 완전히 비활성화될 때, 박테리아 세포는 탄수화물 수송을 위해 하나 이상의 다른 대안적 투과효소에 의존해야 한다.
PTS를 통해 활성적인 글루코오스 수송이 있는 경우, EIIAGlc는 이의 포스페이트 기를 받아들이기 위한 탄수화물 기질이 있는 것처럼 비인산화 상태로 있다. 그러나, 배지에 글루코오스가 없는 경우, EIIAG lc 의 인산화 형태는 이의 포스페이트 기를 글루코오스로 전달하지 못할 수 있으므로, 이의 인산화 상태로 있다. 비인산화 EIIAGlc는 일반적으로 탄소 이화물 억제(carbon catabolite repression, CCR)로 알려진 현상을 매개한다. CCR 하에서, 글루코오스가 성장 배지에 존재할 때, 배지 내의 글루코오스가 낮은 농도로 감소될 때까지 배지 내의 다른 탄수화물의 수송 및/또는 이용을 막는다. 탄소 이화물 억제는 비인산화 EIIAGlc가 탄소원 이용의 투과효소 시스템 또는 다른 시스템에 미치는 저해 효과에 기인한다. 탄수화물 수송에 수반된 수많은 투과효소는 비인산화 EIIAGlc, 예를 들어 LacY 또는 락토오스 투과효소에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다. 또한, 비인산화 EIIAGlc는 아데닐레이트 시클라제 시스템(adenylate cyclase system)에 대한 이의 영향을 통해 탄수화물 수송 및 대사에 수반된 유전자 수의 전사에 대해 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
우수한 석시네이트 생성자인, 균주 KJ122는 ptsI 유전자에서 프레임이동 돌연변이를 함유하고, 이 돌연변이는 우수한 석시네이트 생성에 중요하다. 따라서, 석시네이트 생성의 추가 개선이 ptsHI 및 galP을 결실한 다음, 촉진 확산 시스템을 설치함으로써 제조될 수 있는 현재의 발명의 문맥에서 놀라운 일이었다.
다른 실시예에서, 본 발명은 EIIAGlc 단백질을 인코딩하는 crr 유전자의 비-자연적으로 발생하는 복제를 제공한다. 발명자들은 ptsHI 결실, galP 돌연변이, 및 기능성 glf 유전자의 설치를 함유하는 균주가 EIIAGlc 단백질의 기능의 감소 또는 제거를 야기한 다음, 석시네이트 생성 매개변수의 뜻밖의 바람직하지 않은 감소를 야기하는 crr 유전자의 돌연변이를 획득하려는 뜻밖의 경향을 가짐을 발견하였다. 본래의 crr 좌(locus)에서 분리한 좌에서 crr의 두 번째 복제를 통합함으로써 crr 유전자의 복제는 표현형으로 crr 음성이 되는 돌연변이체의 빈도수를 크게 감소시켜 이 문제를 해결한다.
본 발명은 하기에 상세히 설명할 것이다. 본 발명의 대장균 속에 속하는 박테리아 예는 당 이입을 위해 초기에 촉진 확산을 이용할 수 없는 부모 균주로부터 구축된 균주이나, 본 명세서에 개시된 유전자 변형 후 glf 유전자, 및 임의로 외인성 glk 유전자가 사는 균주이고, 글루코오스 및 프럭토오스의 이입을 위해 촉진 확산을 사용하는 능력을 가진다.
세포에 도입된 외인성 유전자는 자기-복제 플라스미드에 대하여 세포 내에서 유지될 수 있다. 플라스미드는 항생제 선택 또는 염색체 돌연변이의 상보성을 통해 유지될 수 있다. 그러나, 외인성 유전자가 세포 내에서 자기-복제 플라스미드에 대하여 생체촉매 내에서 유지되는 경우, 성장의 저해를 야기하는 에너지와 물질의 불필요한 낭비가 없고, 생체촉매를 이용하여 제조되는 유기 물질의 수율 또는 생산성의 감소를 학인할 필요가 있다. 우선적으로, 세포 내에서 플라스미드를 유지하기 위해 임의의 항생제를 첨가할 필요가 없고, 세포 대사 부담(metabolic burden)이 플라스미드 유지를 위해 세포에 거의 또는 전혀 놓이지 않도록, 외인성 유전자가 숙주 염색체에 통합된다. 외인성 유전자의 통합을 위해 세포 내에 많은 가능한 위치가 있다. 대장균 염색체 DNA 내에 외인성 유전자를 통합하기 위한 우선적 위치는 상용 발효 조건 하에 성장 및 생성물 형성을 위해 필수적인 기능을 인코딩하지 않는 영역을 포함한다.
외인성 유전자가 오페론으로서 얻어지는 경우, 오페론으로부터 임의의 가능한 음성 조절 유전자 또는 단백질을 제거하는 것이 바람직하다. 촉진 확산 및 대사에서 양성적으로 작용하는 유전자 및 단백질만을 가지는 것이 이상적이다. 따라서, 촉진 확산 유전자의 발현은 바람직하게는 억제제 또는 탄소 이화물 억제에 의해 저해되지 않는다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 방법으로 제공되며, 이에 한정되지 않는다.
당 이입을 위해 촉진 확산 시스템을 선천적으로 사용하지 않은 임의의 박테리아는 본 발명에 따라 개선될 수 있다.
본 발명의 박테리아는 원하는 화학물질을 생성하기 위해 미리 유전자 변형시킨 KJ122 또는 다른 균주와 같은 석신산 생성 균주에 촉진 확산의 이용을 가능하게 하는 하나 이상의 유전자의 도입에 의해 얻어질 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 박테리아는 촉진 확산의 이용이 이미 유전 공학, 및 임의로 진화에 의해 가능하였던 박테리아에 석신산 또는 다른 원하는 화학물질을 생성하는 능력을 부여함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 후자의 대안은 KJ122를 구축하는데 사용된 하기의 모든 단계에 의하나, 균주 ATCC 8739로 시작하는 것 대신에, 균주 ATCC 9637 또는 K-12 유형의 대장균 균주, 또는 다른 안전한 대장균 균주로 시작하여 달성될 수 있다.
실시예 1
지모모나스 모빌리스 CP4의 유전자 클러스터로부터 glf 및 glk 유전자를 함유하는 KJ122의 유도체인, AC15의 구축
DNA 및 플라스미드의 모든 조작, PCR(polymerase chain reaction), 변형, 및 염색체 통합은 기술분야에서 잘 알려진 표준 방법에 의해 달성되었다. DNA 서열을 복제하고 함께 결합하여 사실상 용이하게 확인될 수 없는 새로운 조합을 형성할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 제한 효소 및 DNA 리가제를 수반하는 더 종래의 방법 이외에, 효모에서 재결합을 이용한 더 새로운 방법, 소위 DNA의 생체 외 스플라이싱의 "깁슨 방법(Gibson Method)", 또는 임의의 다른 적당한 방법을 사용하여 이러한 새로운 DNA 서열을 구축할 수 있다. 필요한 DNA 단편은 복제의 라이브러리로부터 또는 적당한 주형 DNA로부터 PCR에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 많은 바람직한 DNA 서열이 화학 전구체로부터 설계되고 합성될 수 있다고 생각된다. 이러한 서비스는 수많은 상업 회사, 예를 들어 DNA 2.0 및 GeneArt (Invitrogen)에 의해 공급된다.
플라스미드 pAC19는 바실러스 서브틸리스 파지 SP01의 P 26 프로모터에 의해 구동된, 지모모나스 모빌리스의 glf 및 glk 유전자를 함유하는 인공 오페론을 함유하는 것으로 구축되었다. 이 오페론은 유전자 변형되도록 균주의 tdcCDE 좌(locus)로 통합을 촉진시키기 위하여, 대장균 C tdcC 유전자에 상동의 상류 서열 및 대장균 C tdcE 유전자에 상동의 하류 서열 사이에 끼워넣었다(embedded). 상기 기재된 카세트는 pSC101 복제 개시점(origin of replication) 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하는 pCL1921로부터 유래된 낮은 복제 플라스미드 벡터에서 수행된다. 카세트의 성분은 Sigma 및 IDT(Integrated DNA Technologies)와 같은 상업적 공급업체로부터 얻어진 적당한 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻어졌다. 지모모나스 유전자의 근원은, 원래 바람직한 glf 및 glk 유전자 이외에 zwf 및 edd 유전자를 함유한 pLOI1740이었다. glf , zwf , edd , glk 클러스터를 pCL1921로 전달한 다음, 불필요한 zwf 및 edd 유전자를 인사이드 아웃 PCR(inside out PCR)로 삭제하였다. 상류 및 하류 tdc 서열은 주형으로 KJ122 염색체 DNA로부터 PCR로 얻어졌다. P 26 프로모터는 박테리오파지 SP01로부터 얻어졌다. pAC19의 서열은 서열번호 1로 주어졌다.
모든 구축은 항생제 또는 수크로오스로 적당히 보충된 LB 배지 (10 그램 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 5 그램 박토-효모 추출물, 및 5 그램 염화나트륨)에서 균주가 성장하는 동안 수행되었다. 균주 AC15를 구축하기 위해, 이전에 기재된 2 단계 유전자 대체 방법을 이용하여, pAC19의 인공 오페론을 함유하는 카세트를 균주 WG53의 염색체에 통합하였다. 첫 번째 단계의 cat, sacB 카세트는 플라스미드 pAC21 (서열번호 2)에서 함유되었다. pAC21은 인공 오페론이 클로팜페니콜 내성 유전자 및 레반 수크라제를 인코딩하는 역선별(counterselectable) sacB 유전자를 함유하는 cat, sacB 카세트로 대체하는 것을 제외하고는, pAC19와 유사하였다. 변형 DNA는 첫 번째 단계의 pAC21로부터 PCR에 의해, 및 두 번째 단계의 pAC19로부터 PCR에 의해 얻어졌다.
균주 WG53은 상기 단락에 기재된 것과 유사한 2 단계 유전자 대체 방법을 이용하여, 석시네이트 생성 균주 KJ122로부터 ptsH , ptsI, 및 galP 유전자를 삭제하여 얻어졌다. ptsHI 결실을 스패닝(spanning)하는 DNA 서열은 서열번호 3으로 주어졌다. 이러한 결실은 자연적으로 ptsH 유전자로부터 상류에 존재하는 본래의 프로모터뿐만 아니라, 온전한 crr 유전자를 남겨둔다는 것을 유의하라. galP 결실을 스패닝하는 DNA 서열은 서열번호 4로 주어졌다.
중간체 균주 WG53이 최소 글루코오스 배지에서 극도로 좋지 않게 성장한 반면, 균주 KJ122 및 AC15는 최소 글루코오스 배지에서 잘 성장하였으며, 이는 1) ptsHI 및 galP 유전자가 WG53에서 성공적으로 결실되었고, 2) glf , glk 카세트가 AC15에서 글루코오스를 이입할 수 있게 작용하였다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 2
부모 KJ122 뿐만 아니라 균주 AC15도 석시네이트를 생성한다.
균주 KJ122 및 AC15는 글루코오스가 있는 최소 배지 유가식 시스템(fed batch system)을 이용하여, 39℃에서 7 리터 발효기 (New Brunswick Scientific)에서 미량호기성 조건 하에 성장하였다. 3 리터의 시작 부피는 인산 칼륨 일염기성 (potassium phosphate monobasic) (18 mM), 황산 마그네슘 (2 mM), 베타인 (1.33 mM), 미량 원소, 소포제 204 (8 ppm) 및 25 g/l 글루코오스를 함유하였다. pH는 초기에 pH 7.0으로 조정하였고, 이 후에 하기에 기재된 수산화 암모늄/중탄산 암모늄 용액을 첨가하여 제조된 산으로 pH 6.5로 유지하였다. 150 ml 접종물(inocula)은, 글루코오스가 20 g/l이고 염화칼슘을 0.1 mM의 최종 농도로 첨가한 것을 제외하고는, 상기 기재된 배지와 유사하게 함유된 최소 배지에서 호기적으로 성장시켰다. 750 RPM (분당 회전수(revolutions per minute))으로 교반하였다. 글루코오스가 5 g/l으로 감소할 때, 650 g/l 글루코오스 공급을 시작하고 목표로 한 속도로 유지하여 약 5 g/l 이하의 글루코오스 농도를 유지하였다. 중화에 사용된 저장 용액은 수산화 암모늄 및 중탄산 암모늄 (7 N NH4OH 및 3M NH4HCO3)을 함유하였다. AC15는 35 ml/min로 공기를 통하게 하였고, KJ122는 공간 부분(head space)에 존재하는 것 이외의 공기를 제공하지 않았으며, 통기성이 있는 멸균 막 여과기(breathable sterile membrane filter)를 통해 대기와 평형을 유지하였다. 이것은 각 균주에 대해 잘 작동하기 위해 나타낸 조건이었다. 48시간의 당, 석시네이트, 및 부산물 시료를 HPLC로 분석하였다. 평균 중복 결과를 표 1에 나타내었다. AC15는 부모 KJ122와 거의 동일한 역가를 생성하였으나, 아세테이트 부산물은 상당히 더 낮았고, 글루코오스에 대한 수율은 AC15가 더 높았다.
실시예 3
AC15로부터 유래된 자발적 "적색 돌연변이체"
KJ122는 맥콘키(MacConkey) 락토오스 플레이트 (Beckton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 적색 콜로니의 형성에 의해 입증된 바와 같이, 락토오스를 발효할 수 있다. 그러나, AC15는 맥콘키 락토오스 플레이트에서 "백색" (베이지색) 콜로니의 형성에 의해 입증된 바와 같이, 락토오스를 발효하지 않는다. 이러한 백색 콜로니 표현형의 AC15는 비인산화 EIIAGlc 단백질에 의해 락토오스 투과효소 (LacY)의 결합 및 저해에 기인한다. 이러한 백색 콜로니 표현형은, EIIAGlc를 인산화하는데 필요한 효소가 없기 때문에 ptsHI에 대해 결실된 모든 균주에서 존재하고, 그 결과, 세포에 존재하는 모든 EIIAGlc는 비인산화되어 있다. 따라서, 반어적으로(ironically), 비록 락토오스가 대장균에서 PTS 시스템에 의해 이입되지 않을지라도, 대장균 ptsHI 돌연변이체는 표현형으로 Lac-이다.
발명자들은 맥콘키 락토오스 플레이트가 AC15와 함께 줄무늬를 넣고 (streaked) 37℃에서 밤새도록 배양한 다음 실온 (약 22℃)에서 하루 더 배양할 경우, 다수의 적색 콜로니가 줄무늬의 더 밀집한 부분 위에서 성장한 백색 콜로니의 잔디(lawn)로부터 나왔다는 것을 우연히 발견하였다. 몇몇의 적색 콜로니가 다시 줄무늬를 넣자마자, 2 종류의 적색 콜로니가 진화되었음을 관찰하였다. 우리는 개개의 콜로니가 완전한 콜로니 쪽으로 균일하게 적색이었기 때문에, 제 1 종류를 "고체 적색"이라고 부를 것이다. 제 2 종류는 개개의 콜로니가 중심에서 적색이었으나, 콜로니의 외부 부분(outer portion)은 백색 또는 베이지색이었기 때문에, "후라이드 에그 적색(fried egg red)"이라고 부를 것이다. 우리는 맥콘키 락토오스에서 모든 유형의 적색 콜로니를 야기하는 균주를 일괄하여 "적색 돌연변이체"라고 부를 것이다.
AC15의 백색 콜로니, 및 AC15-R1, -R2, -R3, 및 -R4로 명명된 4개의 적색 돌연변이체 (이들 중 2개는 고체 적색이고, 이들 중 2개는 후라이드 에그 적색이다)는, 최소 배지의 출발 부피가 200 ml이었고, 모든 회분식(batched)에서는 글루코오스가 출발 배지에서 100 g/l이었으며, 유가식에서는 글루코오스가 없었고, 350 RPM으로 자석 교반 막대(magnetic stirring bar)로 교반하였으며, 공기를 의도적으로 도입하거나 또는 제거하지 않은 차이점과 함께, 7 리터 발효기에 대해 상기 기재된 것과 유사한 배지 및 방법을 이용하여, 500 ml 미량호기성 발효기 (Fleakers, Corning Glass, Corning, NY)에서 석시네이트 생성에 대해 시험하였다. 결과는 표 2에 나타내었다. 2개의 후라이드 에그 돌연변이체는 부모 AC15와 유사하게 수행하였으며, 2개의 고체 적색 돌연변이체는 부모 AC15 보다 상당히 나쁘게 수행하였다.
Illumina HiSeq2000 시스템을 이용하여, 부모 AC15 및 4개의 적색 돌연변이체의 게놈 시퀀싱(Genome sequencing)은, 2개의 고체 적색 돌연변이체가 각각 하나의 돌연변이체를 획득하였으며, 이러한 돌연변이체 모두 EIIAGlc를 인코딩하는 crr 유전자에 있음을 밝혔다. 둘 다 삭제 돌연변이(null mutation)인 것으로 판단되었다. 2개의 후라이드 에그 적색 돌연변이체는 각각 하나의 돌연변이를 획득하였으며, 이러한 돌연변이 모두 락토오스 오페론에 있었다. 이들 모두 락토오스 오페론의 더 높은 수준의 발현을 야기할 돌연변이인 것으로 판단되었다 (하나는 lacO 오퍼레이터에서 돌연변이였고, 다른 하나는 Lac 억제자를 인코딩하는 유전자인 lacI의 프레임이동이었다.). 4개의 돌연변이 모두 이들이 락토오스를 발효시킬 수 있는 증가된 능력의 관찰된 표현형을 설명할 수 있었다는 점에서 이해되었다. 예상되는 바와 같이, crr 삭제 돌연변이는 LacY 투과효소의 저해를 완화하였고, 락토오스 오페론 돌연변이는 적어도 일부가 저해로부터 달아나더라도 LacY를 과잉 생성할 것으로 예상될 것이다. 그러나, crr 삭제 돌연변이는 명백하게 세포에서 우리의 발효 조건 하에 석시네이트를 생성하는 능력을 감소시키는, 추가의 다면발현 효과 (pleiotropic effect)를 가졌다. 이것은 예측하지 못한 뜻밖의 효과이었다.
실시예 4
지모모나스 모빌리스 glk 유전자는 대장균에서 glf 유전자의 기능에 필수적이지 않다.
플라스미드 pSS2는 pAC19에 대해 상기 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 구축하였다. 단지 pSS2 및 pAC19 사이의 차이점은 지모모나스 모빌리스 glk 유전자가 인공 오페론으로부터 결실되었다는 점이다. 다른 측면에서, 예를 들어 벡터 백본, tdc 플랭킹 서열(flanking sequences)에서 인공 오페론을 끼워넣는 glf의 발현을 구동하는 프로모터, 및 다양한 성분의 방향(orientation)에서, pSS2는 pAC19와 유사하다. pSS2의 DNA 서열은 서열번호 5로 주어진다.
pSS2의 인공 오페론은, 2 단계 유전자 대체 방법을 이용하여, pAC19의 오페론에 대해 상기 기재된 바와 같이 KJ122의 tdc 좌에서 통합되었다. 아마도 서로 동일한 2개의 분리물은 SS8-9 및 SS8-11로 명명되었다. 이들 2개의 새로운 균주는 상기 실시예 3에서 기재된 바와 같이 500 ml 미량호기성 발효기에서 AC15와 비교하였다. 48시간에 분석된 이중 발효기의 평균인 결과는 표 3에 나타내었다. SS8-9 및 SS8-11 모두 AC15와 유사한 성장 및 석시네이트 역가를 얻은 반면, SS8 분리물 모두 아세테이트 생성이 AC15보다 약간 낮았다. 따라서, 지모모나스 모빌리스 glk 유전자는 이 문맥에서 glf 유전자의 기능에 불필요하며, 지모모나스 모빌리스 glk 유전자는 심지어 발효 매개변수에도 약간 유해할 수 있다. 아마도, SS8 분리물은 글루코오스를 인산화하기 위해 외인성 대장균 glk 유전자를 이용하고 있다.
실시예 5
균주 AC15의 대사 진화
상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, 균주 AC15는 7 리터 발효기에서 부모 KJ122보다 더 높은 수준의 통기를 받는 것을 선호하였다. 공기가 적은 곳에서 잘 해낼 수 있는 AC15의 유도체를 얻기 위하여, AC15는 200 ml의 출발 부피가 있고 의도적으로 통기의 공급이 없는 500 ml 발효기에서 대사 진화를 받았다. 산소를 제거하면 측정되지 않기 때문에, 조건은 미량호기성이었다. 진화 과정 동안 발효 용기로 소량의 공기가 누출되는 것으로 추측되었다. 성장 조건은 실시예 3에 기재된 바와 같다. 48시간 성장 후, 배양물을 200 ml의 새로운 배지를 함유하는 새로운 발효기에 1:100 희석한 다음, 이 단계를 40회 이상 반복하였다. 새로운 배지에 이러한 접종들 중 각 하나를 "전달"이라고 부를 것이다. 따라서, 균주는 새로운 배지에 총 41개의 전달을 받았다. 각 전달은 약 7 세대의 세포 분할과 일치한다. 마지막 전달의 액체 배양물의 시료를 맥콘키 락토오스 아가 페트리 플레이트에 플레이팅하였고, 단일 백색 콜로니를 선택하고, YSS41로 명명하였다.
7 리터 발효기에서 통기 속도를 달리함으로써, YSS41은 5 ml/min의 공기와 함께 석시네이트 생성을 잘 수행하였고, 실질적으로 부모 AC15의 최적의 성능에 필요한 35 ml/min 미만이었음을 측정하였다. 5 ml/min 공기 흐름과 함께, YSS41은 7 리터 발효기에서 48시간 내에 0.95 g/g 글루코오스의 석시네이트 수율에 대해, 94 g/l 석시네이트 및 1.3 g/l 아세테이트를 생성하였다.
20 리터 발효기에서 석시네이트 생성에 대해 YSS41은 KJ122와 비교하였다. 발효 프로토콜은, 양 균주에 대해 생성되는 것으로 결정된 조건인, 출발 부피가 9 리터이고, 통기 속도가 양 균주에 대해 25 ml/min인 것을 제외하고는, 7 리터 발효기에 대해 상기 기재된 것과 유사하였다. 48시간 시료의 결과는 표 4에 나타내었다. YSS41의 석시네이트 역가는 100 g/l 이었고 (KJ122의 것보다 상당히 높음), 아세테이트는 2.2 g/l 이었으며 (KJ122의 것보다 상당히 낮음), 석시네이트 수율은 0.95 g/g 글루코오스 이었다 (KJ122의 것보다 약간 낮음). 따라서, 진화된 균주 YSS41은 조상 균주 KJ122의 것보다 높지 않은 통기 요건과 함께 20 리터 발효기에서 잘 수행될 수 있었다.
실시예 6
crr 유전자의 돌연변이에 대한 YSS41의 안정화
맥콘키 락토오스 플레이트에 줄무늬를 넣을 경우, YSS41은 여전히 고체 적색 유형 및 후라이드 에그 적색 유형의 적색 돌연변이체를 야기한다. crr 유전자는 각 유형의 하나의 분리물에 대해 시퀀싱을 하였다. 후라이드 에그 유형의, 균주 MYR222는 야생형 crr 유전자 서열을 가졌다. 고체 적색 유형의, MYR223은 crr ORF (open reading frame)에 삽입된 삽입 요소를 가졌다. 삽입 요소의 DNA 서열은 IS186의 서열과 일치하였다. 따라서, AC15 적색 돌연변이체에 대해 확립된 패턴은 YSS41 적색 돌연변이체에도 적용하는 것으로 나타났다. 500 ml 미량호기성 발효기에서, 실시예 4에서와 같이 성장된 MYR222는 YSS41과 유사하게 수행한 반면, MYR223은 더 좋지 않게 수행하였다 (표 5 참조). 따라서, 집단에서 고체 적색 돌연변이체의 축적으로 인해 성능의 잠재적 손실이 균주 YSS41와 함께 가능성으로 남아있다.
이러한 잠재적 손실을 해결하기 위하여, crr 유전자의 제 2 복제를 본래의 crr 좌에서 떨어진 위치에 통합하였다. crr 유전자는 이의 플랭킹 프로모터 및 종결자와 함께 주형으로 YSS41 염색체 DNA, 및 프라이머 BY249 (서열번호 6) 및 BY250 (서열번호 7)을 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 그 다음, 결과의 블런트 단편 (blunt fragment)을, pflD ORF(open reading frame)에 있는 독특한 BstZ17I 제한 자리에서 대장균 C로부터 pflDC 영역의 일부의 복제를 함유한 pCL1921로부터 유도된 낮은 복제 플라스미드에 결합시켰다. pflDC 유전자는 피루베이트-포르메이트 리가제 및 피루베이트-포르메이트 리가제 활성화 효소를 인코딩하는 pflBA 유전자에 상동성이다. pflDC 유전자는 대장균에 필수적이지 않고, pflD 또는 pflC의 결실은 성장에 중요한 영향을 미치지 않는다, 그래서, 좌에서 카세트의 삽입이 성장 또는 석시네이트 생성에 대해 어떠한 부정적인 결과를 가지지 않을 것이라고 추론하였다. 결과의 낮은 복제 플라스미드인 pMH68은, 낮은 복제 플라스미드의 pflDC로부터의 플랭킹 서열에 끼워넣은 YSS41의 crr 유전자를 함유한다. pMH68의 DNA 서열은 서열번호 8로 주어진다.
pMH68의 통합 카세트는 프라이머 BY124 (서열번호 9) 및 BY125 (서열번호 10)를 이용하여 PCR로 증폭시켰고, 동일한 프라이머를 사용하여 먼저 pflDC 유전자를 복제하였다. 그 다음, 통합 카세트는 2 단계 유전자 대체 방법을 이용하여, YSS41의 염색체에 통합시켰다. 결과의 균주는 현재 crr의 부분이배체(merodiploid)인 MH141로 명명되었고, 이는 염색체 위의 2개의 먼 곳에서 야생형 crr 유전자의 2개의 복제를 함유하고, 하나는 이의 본래의 좌에서, 두 번째는 pflD ORF(open reading frame)에 삽입된 것을 의미한다.
예상대로, 균주 MH141은 맥콘키 락토오스 플레이트에서 백색 콜로니를 생성하였다. 만일 짙은 줄무늬(heavy streak)가 만들어지면, 플레이트를 37℃에서 밤새도록 배양한 다음 실온에서 하루 더 배양하고, 적색 콜로니가 줄무늬의 더 밀집한 부분 위에서 성장한 백색 콜로니의 잔디로부터 나왔다. 그러나, MH141로부터 발생하는 적색 돌연변이체의 수는 동일한 플레이트에서 제조된 YSS41의 유사한 줄무늬보다 상당히 낮았다. 23개의 적색 돌연변이체는 YSS41에서 선택하였고, 12개의 적색 돌연변이체는 MH141에서 선택하였으며, 모두 맥콘키 락토오스 플레이트에서 다시 줄무늬를 넣었다. 적색 돌연변이체의 유형에 대해 점수화할 경우, 23개의 YSS41 적색 돌연변이체 중 12개는 고체 적색 유형이었고, 23개 중 11개는 후라이드 에그 유형이었다. 반대로, MH141 적색 돌연변이체의 12개 모두는 후라이드 에그 유형이었다. 따라서, 염색체에서 crr 유전자를 복제함으로써, 고체 적색 돌연변이체의 형성 속도는 적어도 10의 인자에 의해 감소되었다. MH141로부터 분리된 하나의 후라이드 에그 적색 돌연변이체는 MH141-R1으로 명명되었고, 상기 기재된 바와 같이 500 ml 미량호기성 발효기에서 시험하였다 (표 5 참조). MH141 및 MH141-R1은 성장, 석시네이트 역가, 및 아세테이트 역가에 관하여 부모 YSS41와 유사하게 수행하였다. 따라서, 더 안전한 균주인 MH141은 글루코오스 이입을 위해 촉진 확산을 사용하여 구축되었으며, 글루코오스 이입을 위해 GalP 시스템을 사용하는 조상 균주 KJ122와 비교하였을 때, 석시네이트의 더 높은 역가 및 부산물 아세테이트의 더 낮은 역가를 생성한다.
실시예 7
YSS41은 대사 진화 동안 glf, glk 카세트에서 돌연변이를 획득하였다.
AC15 및 YSS41에서 glf, glk 발현 카세트의 DNA 서열을 측정하였다. 영역을 PCR로 증폭시켰고, 결과의 단편을 디데옥시(dideoxy) 사슬 종결 방법에 의하여, glf 및 glk 유전자 및 200 이상의 염기쌍 상류 및 하류에 시퀀싱하였다. 시퀀싱된 영역은 서열번호 1로 주어진 pAC19의 염기 4976 내지 7920와 일치한다. YSS41의 진화 동안 획득된 2개의 돌연변이가 확인되었다. 첫 번째 돌연변이는 서열번호 1의 염기 수 7742에서 G가 A로 변하였다. 이 염기는 glf ORF(open reading frame)로부터 바로 상류인 glf , glk mRNA 전사의 5' 번역되지 않은 영역에 있으며, glf mRNA (messenger RNA)에서, ATG 시작 코돈에 대하여 염기 -22에서, 또는 전사의 시작에 대하여 염기 +15에서 C가 U로 변한다. 이 돌연변이는 glf ORF의 번역 속도를 증가시키거나 또는 감소시킬 것으로 예상된다. 두 번째 돌연변이는 서열번호 1의 염기 수 6173에서 G가 A로 변하였다. 이 염기는 glk ORF로부터 바로 상류인 5' 번역되지 않은 영역에 있으며, glk mRNA에서 ATG 시작 코돈에 대하여 염기 -15에서 C가 U로 변한다. 이 돌연변이는 glk ORF의 번역 속도를 증가시키거나 또는 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, YSS41의 진화는 glf 및 glk ORF 사이의 발현의 더 최적의 균형이 되어, 부모 균주 AC15 보다 빨리 성장하고 성능이 우수한 균주가 되었다.
glf 및 glk 유전자의 전사 또는 발현 속도를 변경하는, 또는 2개의 인코딩된 단백질 사이의 더 최적의 균형을 유사하게 이룰 수 있는, glf 및 glk 단백질의 농도, 특정 활성, 또는 안정성을 변경하는 다른 돌연변이는, 또한 원하는 화학물질의 유익한 성장 및 생성일 것이다. 이러한 다른 대안적인 돌연변이는 YSS41에 대해 상기 기재된 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 또한, 이 방법은 당 이입을 위해 촉진 확산을 사용하는 능력이 균주에 변형되는 경우, 석시네이트 이외의 생성물을 생성하기 위해 유전자 변형된 균주에 적용될 수 있다.
실시예 8
YSS41의 공기흐름속도(air flow rate)의 최적화 후 KJ122 및 YSS41의 발효.
부모 균주 KJ122의 최적의 공기흐름속도는 20 리터 발효기에서 25 ml/min으로 측정하였다.　25 ml/min의 공기흐름속도에서, YSS41 균주는 KJ122의 것과 비교하여, 더 우수한 석시네이트 역가 및 수율을 나타내었다. YSS41 균주의 석시네이트 수율 및 역가에서 추가 개선은 공기흐름속도를 50ml/min으로 증가시킴으로써 얻어졌다. 따라서,　석시네이트 수율 및 역가에 관하여 YSS41 균주의 최적의 공기흐름속도는 KJ122의 것과 다른 것처럼 보인다. 표 6은 각 균주에 대해 최적의 공기흐름 조건 하에 20 리터 발효기에서 야기된 발효를 제공한다. YSS41은 역가, 수율, 및 아세테이트 부산물 형성에서 부모 KJ122 보다 성능이 우수하였다. 발효의 초기 부피는 9500ml 이었다. 글루코오스를 공급하고 염기로 중화한 후, 최종 부피는 12500ml 이었다.
7 리터 발효기에서 AC15에 의한 석시네이트의 생성
균주 관련된 유전자형 통기
ml/min		 석시네이트
g/l		 아세테이트
g/l		 수율 g/g 글루코오스
KJ122 parent, ptsI *, galP + 0 87 5.2 0.83
AC15 KJ122, △ptsHI, △g a lP, P 26 -glf , glk 35 87 2.7 0.88
500 ml 미량호기성 발효기에서 AC15 적색 돌연변이체에 의한 석시네이트의 생성
균주 맥콘키 락토오스에서 콜로니 표현형 석시네이트 g/l 아세테이트 g/l OD600 확인된 돌연변이
AC15 백색 74 2.4 7.5 없음
AC15-R1 고체 적색 51 9.0 6.5 crr Lys16 프레임이동
AC15-R3 고체 적색 65 6.6 7.0 crr Met1Ile
AC15-R2 후라이드 에그 적색 73 2.4 8.0 lacO G11A
AC15-R4 후라이드 에그 적색 73 3.0 7.5 lacI Asp300 프레임이동
500 ml 미량호기성 발효기에서 SS8 분리물에 의한 석시네이트 생성
균주 관련된 유전자형 석시네이트 g/l 아세테이트 g/l OD600
AC15 KJ122, △ptsHI, △galP, P 26 - glf , glk 64 6.0 7.5
SS8-9 KJ122, △ptsHI, △galP, P 26 - glf 64 4.2 8.5
SS8-11 KJ122, △ptsHI, △galP, P 26 - glf 64 3.6 8.2
20 리터 발효기에서, YSS-41에 의한 석신산 생성
균주 관련된 유전자형 공기흐름속도 ml/min 석시네이트 g/l 아세테이트 g/l 글루코오스에 대한 수율 g/g
KJ122 ptsI * 25 87 6.8 1.00
KJ122 ptsI * 25 85 6.8 0.98
YSS41 KJ122, △ptsHI ,
△galP , P 26 - glf , glk ,
진화된		 25 100 2.2 0.95
500 ml 미량호기성 발효기에서, crr +의 부분이배체인 MH141에 의한 석시네이트 생성
균주 관련된 유전자형 맥콘키 락토오스에서 콜로니 표현형 석시네이트
g/l		 아세테이트
g/l 		OD600
YSS41 AC15, 진화된, crr + 백색 67 3.9 10.0
MH141 YSS41, △p f lD:: crr + 백색 68 3.2 8.5
20 리터 발효기에서, 대장균 균주 KJ122 및 YSS41의 최적화된 통기 조건 하에 대장균 균주 KJ122 및 YSS41에 의한 석시네이트 생성
균주 공기흐름속도 (ml/min) 석시네이트 역가 (g/l) 글루코오스에 대한 석시네이트 수율 (g/g) 아세테이트 역가 (g/l) OD600으로 세포 질량
KJ122 25 81 0.86 3.9 12
YSS41 50 96 0.98 2.5 13
YSS41 25 93 0.98 2.5 13
SEQUENCE LISTING <110> Myriant Corporation Yocum, R. Rogers Collard, Andrew Hermann, Theron Yu, Xiaohui Gong, Wei <120> Method of producing succinic acid and other chemicals using facilitated diffusion for sugar import <130> MC2014-01PCT <150> US 61/857300 <151> 2013-07-23 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9430 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> pAC19 <222> (1)..(9430) <223> Plasmid used to install a glf-glk casette at the tdc locus of bacterial strain KJ122 <400> 1 gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60 agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120 gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180 tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240 aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300 aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360 gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420 gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 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ggccattaca aaacgctgac ggcactgtcg caaactatca cggctaccac 6720 atcgtctttg cattagccgg agatcctaaa aatgcggatg acacatcgat ttacatgttc 6780 tatcaaaaag tcggcgaaac ttctattgac agctggaaaa acgctggccg cgtctttaaa 6840 gacagcgaca aattcgatgc aaatgattct atcctaaaag accaaacaca agaatggtca 6900 ggttcagcca catttacatc tgacggaaaa atccgtttat tctacactga tttctccggt 6960 aaacattacg gcaaacaaac actgacaact gcacaagtta acgtatcagc atcagacagc 7020 tctttgaaca tcaacggtgt agaggattat aaatcaatct ttgacggtga cggaaaaacg 7080 tatcaaaatg tacagcagtt catcgatgaa ggcaactaca gctcaggcga caaccatacg 7140 ctgagagatc ctcactacgt agaagataaa ggccacaaat acttagtatt tgaagcaaac 7200 actggaactg aagatggcta ccaaggcgaa gaatctttat ttaacaaagc atactatggc 7260 aaaagcacat cattcttccg tcaagaaagt caaaaacttc tgcaaagcga taaaaaacgc 7320 acggctgagt tagcaaacgg cgctctcggt atgattgagc taaacgatga ttacacactg 7380 aaaaaagtga tgaaaccgct gattgcatct aacacagtaa cagatgaaat tgaacgcgcg 7440 aacgtcttta aaatgaacgg caaatggtac ctgttcactg actcccgcgg atcaaaaatg 7500 acgattgacg gcattacgtc taacgatatt tacatgcttg gttatgtttc taattcttta 7560 actggcccat acaagccgct gaacaaaact ggccttgtgt taaaaatgga tcttgatcct 7620 aacgatgtaa cctttactta ctcacacttc gctgtacctc aagcgaaagg aaacaatgtc 7680 gtgattacaa gctatatgac aaacagagga ttctacgcag acaaacaatc aacgtttgcg 7740 ccgagcttcc tgctgaacat caaaggcaag aaaacatctg ttgtcaaaga cagcatcctt 7800 gaacaaggac aattaacagt taacaaataa aaacgcaaaa gaaaatgcca atatcctatt 7860 ggcattttct tttatttctt ccatttaaat ggatgcatgc gctagcggag tgtatactgg 7920 cttactatgt tggcactgat gagggtgtca gtgaagtgct tcagcctcgt gagcgggacg 7980 gtcgtaaggt cgttccgctc cacttcactg aacggcaatc cgagggtgtg gatccaatta 8040 aggccacgct gtcatttaaa ttccgttttt ccagttcaaa tgcaattgcc ttcaatgcac 8100 cttcgtagct gtggtgagcc agcggtgctg gctctccccc atttacggat aagaatgcat 8160 tttccgagtt aataccgtcg gcaatacctg acattaatac ttcacagtcg ctggcatcga 8220 gtacggaaaa cttaatcgaa gacgaaccac agttaataac caaaacaacc ggaaattcat 8280 tcatctcttt tctcatcctg agttacggat taaaacagtt tgtatacgat gttcaggatg 8340 gtcagcagac caatcacggt aacaaacacg ttatccagac gaccacggta tttcgccaga 8400 gacggcgctt tacggatggc atacatcggc aacaggcaca gcagggatgc gataatcggt 8460 gcgcccatgg cttcaatcag gtcgaggatg ttcgggttgg cgtaggcaac aacccaggtg 8520 gagcccatga tgaagatcat gctgagagta ttcagtttac ccagcgacac tttggttttg 8580 tcacctttat aaccgaactt cagaatcaga ccattcaagc cttccagcgt ccccagatag 8640 tgaccgaaga aagatttgaa gatagccacg agtgcgatga tggaagccgc atattccagt 8700 gtaatcgcga acgttgtttt ggtaccggtc atggacgcaa agtggttagc cagataagaa 8760 agcactggaa tattctgcgc tttggcttcc gccatgttgg ccggagacag agtaaacagg 8820 cagctaaagg caaagaacat caccactgca accatcagca tgctggcacg agaaatgatt 8880 tgggaacatt tacgttcggt gaagtcgcga ccgaagtctt tctcatactc ttcacgttta 8940 gaaaccacga aggaagagac gattggcgag aagttaaagg agaaaaccat gatggaaatc 9000 cccagccaga cagtgatcag gataccgtca tgaccggtta acgacagcga accgaggtca 9060 acctggtcga taactgcaga gttccagtaa gggatcagcg acaaagaaat cagcaccagg 9120 ctggcgataa acggccatac caggtagctc agggtaccga gctcgaattc actggccgtc 9180 gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 9240 catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 9300 cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 9360 tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag 9420 ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgaat tc 9462 <210> 3 <211> 1091 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ptsHI <222> (1)..(1091) <223> Sequence surrounding the deletion of ptsHI. The fusion junction is in between the nucleotide positions 425 and 426. <400> 3 gcaacagtaa tgccagcttg ttaaaaatgc gtaaaaaagc acctttttag gtgctttttt 60 gtggcctgct tcaaactttc gcccctcctg gcattgattc agcctgtcgg aactggtatt 120 taaccagact aattattttg atgcgcgaaa ttaatcgtta caggaaaagc caaagctgaa 180 tcgattttat gatttggttc aattcttcct ttagcggcat aatgtttaat gacgtacgaa 240 acgtcagcgg tcaacacccg ccagcaatgg actgtattgc gctcttcgtg cgtcgcgtct 300 gttaaaaact ggcgctaaca atacaggcta aagtcgaacc gccaggctag actttagttc 360 cacaacacta aacctataag ttggggaaat acaatgttcc agcaagaagt taccattacc 420 gctccacaat ctgctaatcc acgagatgcg gcccaattta ctgcttagga gaagatcatg 480 ggtttgttcg ataaactgaa atctctggtt tccgacgaca agaaggatac cggaactatt 540 gagatcattg ctccgctctc tggcgagatc gtcaatatcg aagacgtgcc ggatgtcgtt 600 tttgcggaaa aaatcgttgg tgatggtatt gctatcaaac caacgggtaa caaaatggtc 660 gcgccagtag acggcaccat tggtaaaatc tttgaaacca accacgcatt ctctatcgaa 720 tctgatagcg gcgttgaact gttcgtccac ttcggtatcg acaccgttga actgaaaggc 780 gaaggcttca agcgtattgc tgaagaaggt cagcgcgtga aagttggcga tactgtcatt 840 gaatttgatc tgccgctgct ggaagagaaa gccaagtcta ccctgactcc ggttgttatc 900 tccaacatgg acgaaatcaa agaactgatc aaactgtccg gtagcgtaac cgtgggtgaa 960 accccggtta tccgcatcaa gaagtaattc tgccgcagtg aaaaatggcg cccatcggcg 1020 ccattttttt atgcttccgc cagcggcggc aaaatcaatt catcgctctc atgctgctgg 1080 gtgtagcgca t 1091 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> galP <222> (1)..(66) <223> Sequence surrounding the deletion of galP gene. The fusion junction is in between the nucelotide positions 48 and 49. <400> 4 atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgtttat aggcgctcac 60 gattaa 66 <210> 5 <211> 8446 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> pSS2 <222> (1)..(8446) <223> Plasmid used to install a glf cassette at the tdc lcous of bacterial strain KJ122. <400> 5 gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60 agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120 gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180 tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240 aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300 aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360 gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420 gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480 gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540 tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600 cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660 ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720 gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780 atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840 gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900 tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat 960 tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta 1020 aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat 1080 tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata 1140 atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat 1200 taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat 1260 ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg 1320 ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata 1380 agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc 1440 tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca 1500 ttacatcaga ttcctaccta cgtaacggac taagaaaaac actacacgat gctttaactg 1560 caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa agtaagcatg 1620 atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac 1680 tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggctcttg tatctatcag tgaagcatca 1740 agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt caccgttaga tatcaaaggg aaaactgtcc 1800 atatgcacag atgaaaacgg tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt acgagttttt 1860 ggtgcattta aagctgttca ccatgaacag atcgacaatg taacagatga acagcatgta 1920 acacctaata gaacaggtga aaccagtaaa acaaagcaac tagaacatga aattgaacac 1980 ctgagacaac ttgttacagc tcaacagtca cacatagaca gcctgaaaca ggcgatgctg 2040 cttatcgaat caaagctgcc gacaacacgg gagccagtga cgcctcccgt ggggaaaaaa 2100 tcatggcaat tctggaagaa atagcgcttt cagccggcaa acctgaagcc ggatctgcga 2160 ttctgataac aaactagcaa caccagaaca gcccgtttgc gggcagcaaa acccgttatg 2220 cttgtaaacc gttttgtgaa aaaattttta aaataaaaaa ggggacctct agggtcccca 2280 attaattagt aatataatct attaaaggtc attcaaaagg tcatccaccg gatcaattcc 2340 cctgctcgcg caggctgggt gccaagctct cgggtaacat caaggcccga tccttggagc 2400 ccttgccctc ccgcacgatg atcgtgccgt gatcgaaatc cagatccttg acccgcagtt 2460 gcaaaccctc actgatccgc atgcccgttc catacagaag ctgggcgaac aaacgatgct 2520 cgccttccag aaaaccgagg atgcgaacca cttcatccgg ggtcagcacc accggcaagc 2580 gccgcgacgg ccgaggtctt ccgatctcct gaagccaggg cagatccgtg cacagcacct 2640 tgccgtagaa gaacagcaag gccgccaatg cctgacgatg cgtggagacc gaaaccttgc 2700 gctcgttcgc cagccaggac agaaatgcct cgacttcgct gctgcccaag gttgccgggt 2760 gacgcacacc gtggaaacgg atgaaggcac gaacccagtg gacataagcc tgttcggttc 2820 gtaagctgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg gtccagaacc ttgaccgaac 2880 gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg 2940 tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga 3000 tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca 3060 tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca 3120 tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg 3180 gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg 3240 aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga 3300 gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc 3360 gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag 3420 gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag 3480 aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac 3540 aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg 3600 ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg 3660 gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt 3720 atcagcccgt catacttgaa gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg 3780 cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg 3840 tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg ccgcttcgcg gcgcggctta 3900 actcaagcgt tagatgcact aagcacataa ttgctcacag ccaaactatc aggtcaagtc 3960 tgcttttatt atttttaagc gtgcataata agccctacac aaattgggag atatatcatg 4020 aaaggctggc tttttcttgt tatcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta 4080 aaatctagcg agggctttac taagctgatc cggtggatga ccttttgaat gacctttaat 4140 agattatatt actaattaat tggggaccct agaggtcccc ttttttattt taaaaatttt 4200 ttcacaaaac ggtttacaag catacgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 4260 tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 4320 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 4380 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcctg 4440 caggtcgact ctagaggatc ccccccgccg ccgacagagt aataggtttt acttaatagc 4500 tcttcctgtc ccttccaggc agtgatccgc attccgttct catggcgagg caacatttcg 4560 ggatggaaga taatgttctt tgctacagga aaatcaacaa tatgcgcacc agatgccact 4620 ggcagccgcc cgctgcgcgt tactaactct ataaatgcag ggatctcatc aatgacaaca 4680 tcctgcggac tgtttcctgc cagtcccatg atgatggcga catccgtggc atggcctttg 4740 cccgtcagtg acaacgaccc gtacagatcg accacaatat ggctcgtcgc ggttaataag 4800 ccgctacttt ccagccgatc aataaaactt tttccggcat tcattggccc cacggtatgc 4860 gaactggagg gaccaatccc aattttgaaa atatcgaatg cactaatcat atccacaccc 4920 tcggattgcc gttcagtgaa gtggagcgga acgaccttac gaccgtcccg ctcacgaggc 4980 tttacgcact acgtactgcg atggcttcaa tttccagcgg gagggcggat ccactaatac 5040 aaaatatatc aaaagttaat aataatatta ttcttactta agactttttt gtcttcattt 5100 tttagtaaaa aatataaaaa aggccacctc ccgattttat cggaaggcag cctcttaaat 5160 tcagttcata atattaaaaa atattattca acttcagatt atttgttggc ataggcagcg 5220 ctccgcccgc tttataccat cgttgtaaac aaaaagtata attggttaag acttatctaa 5280 aaaagacaaa aggattcagc caaagcaagt ttaactactt ctgggagcgc cacatctcct 5340 cgatttcatc caggctccga cctttggttt ccggcacgaa gcgagcaaca atcaagccac 5400 ctaagatact taatgctgcg aaaacgagat aggagaaacc gtggttgaaa gtctgattca 5460 atgctggaga accatcggca accttaaaca ggaagttaac caagatatta gctaaccatt 5520 gtccggtaac agcgataggc atagctgcgc ccttgatgga actcgggaac atttctgaca 5580 gaacaaccca gcagacaggg ccccatgaca taccaaagac tgcaatataa agaagcacag 5640 aagccaaagg caaaacacca ccgactttga accagaaaca gcagcctaaa acagccatca 5700 ttgcagccat accgagagca ccccaaataa gcagaggttt acggccgaag cggtcaacaa 5760 cacgggaagc aatcatggtg aagatgaagt tcacaacacc gatagagatg gtctgcaata 5820 atgccgtatc agctccaaaa cctaaattct ggaacatctg cggtgcataa tacagcacgg 5880 cgttaatacc gactaactgc tggaaggcag caacggatac accggcaaaa acaacggtga 5940 taccaaaagc aaacaaacct gcgctgcttt tgtccatggc tttatcaaag ccagctttaa 6000 tcttttgaat cgtcagatta ggatcggctt gcggttccag acgagcaagg attttgctag 6060 cctcggaatg acgtcccttc atcaccaacc aatgcggcgt atccggtgcg gttaacagca 6120 gcaataagaa ggcaataccg atcaggcctt ctgaagccgg agaccagcac caaccactgg 6180 cattaaccca atcgatagaa ccgaaatgag ccagtaacca ggtaaagata taaccggtta 6240 aagcacccgt cacaatggcc atctgctgac cagaaaccat ctgaccacgt ttgtctggcg 6300 gagcaatttc agcaatatag gttggggtca aggttgaaac gacaccgata cctaaaccgg 6360 caagaaaccg gaaaaagcaa aaaatttgta aagccgaacc accggttcca aataattttt 6420 cggttaacgc agcaccaaaa ccggcggcga cgaaacaaat ggaactcatc aacaatccgc 6480 cgcgacgacc gaagcgaata ccaatccagc cagacagcaa agaaccggta acacaaccga 6540 ccaaaacagc aacaacgacc atcccagaaa gggaagccgc agccgtagca gacaggtgac 6600 gaggggcaat aaaatggata tcaaccggtg taccgattgc agcgataacc gctgaatcgt 6660 aaccgaaaag caagccgcct atagcagcga ttagggctag tcgcgtgact agaccctgac 6720 tactttcaga actcatggcg attcctctcc ctctagagcg tcctgctgtt gttaagatta 6780 ttataccaca ccttgtagat aaagtcaaca actttttgca aaatttttca ggaattttag 6840 cagaggttgt tctggatgta gaacaaaaca tctttccgct cttgtgctgt taggatatct 6900 ttcttggaag ctaggtaggc ctcgagttat ggcagttggt taaaaggaaa caaaaagacc 6960 gttttcacac aaaacggtct ttttcgattt ctttttacag tcacagccac ttttgcacca 7020 attaaggcca cgctgtcatt taaactccgt ttttccagtt caaatgcaat tgccttcaat 7080 gcaccttcgt agctgtggtg agccagcggt gctggctctc ccccatttac ggataagaat 7140 gcattttccg agttaatacc gtcggcaata cctgacatta atacttcaca gtcgctggca 7200 tcgagtacgg aaaacttaat cgaagacgaa ccacagttaa taaccaaaac aaccggaaat 7260 tcattcatct cttttctcat cctgagttac ggattaaaac agtttgtata cgatgttcag 7320 gatggtcagc agaccaatca cggtaacaaa cacgttatcc agacgaccac ggtatttcgc 7380 cagagacggc gctttacgga tggcatacat cggcaacagg cacagcaggg atgcgataat 7440 cggtgcgccc atggcttcaa tcaggtcgag gatgttcggg ttggcgtagg caacaaccca 7500 ggtggagccc atgatgaaga tcatgctgag agtattcagt ttacccagcg acactttggt 7560 tttgtcacct ttataaccga acttcagaat cagaccattc aagccttcca gcgtccccag 7620 atagtgaccg aagaaagatt tgaagatagc cacgagtgcg atgatggaag ccgcatattc 7680 cagtgtaatc gcgaacgttg ttttggtacc ggtcatggac gcaaagtggt tagccagata 7740 agaaagcact ggaatattct gcgctttggc ttccgccatg ttggccggag acagagtaaa 7800 caggcagcta aaggcaaaga acatcaccac tgcaaccatc agcatgctgg cacgagaaat 7860 gatttgggaa catttacgtt cggtgaagtc gcgaccgaag tctttctcat actcttcacg 7920 tttagaaacc acgaaggaag agacgattgg cgagaagtta aaggagaaaa ccatgatgga 7980 aatccccagc cagacagtga tcaggatacc gtcatgaccg gttaacgaca gcgaaccgag 8040 gtcaacctgg tcgataactg cagagttcca gtaagggatc agcgacaaag aaatcagcac 8100 caggctggcg ataaacggcc ataccaggta gctcagggta ccgagctcga attcactggc 8160 cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 8220 agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 8280 ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 8340 tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 8400 atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gaattc 8446 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY249 for amplifying and cloning the crr gene of YSS41, together with BY249. <400> 6 gggcaacagt aatgccagct tgttaaaaat g 31 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY250 for amplifying and cloning the crr gene of YSS41 together with BY249. <400> 7 gggcgctaca cccagcagca tgaga 25 <210> 8 <211> 8937 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> pMH68 <222> (1)..(8937) <223> Plasmid used to install a second copy of teh crr gene from YSS41 at the pflD locus. <400> 8 gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60 agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120 gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180 tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240 aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300 aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360 gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420 gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480 gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540 tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600 cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660 ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720 gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780 atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840 gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900 tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat 960 tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta 1020 aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat 1080 tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata 1140 atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat 1200 taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat 1260 ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg 1320 ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata 1380 agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc 1440 tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca 1500 ttacatcaga ttcctaccta cgtaacggac taagaaaaac actacacgat gctttaactg 1560 caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa agtaagcatg 1620 atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac 1680 tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggctcttg tatctatcag tgaagcatca 1740 agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt caccgttaga tatcaaaggg aaaactgtcc 1800 atatgcacag atgaaaacgg tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt acgagttttt 1860 ggtgcattta aagctgttca ccatgaacag atcgacaatg taacagatga acagcatgta 1920 acacctaata gaacaggtga aaccagtaaa acaaagcaac tagaacatga aattgaacac 1980 ctgagacaac ttgttacagc tcaacagtca cacatagaca gcctgaaaca ggcgatgctg 2040 cttatcgaat caaagctgcc gacaacacgg gagccagtga cgcctcccgt ggggaaaaaa 2100 tcatggcaat tctggaagaa atagcgcttt cagccggcaa acctgaagcc ggatctgcga 2160 ttctgataac aaactagcaa caccagaaca gcccgtttgc gggcagcaaa acccgttatg 2220 cttgtaaacc gttttgtgaa aaaattttta aaataaaaaa ggggacctct agggtcccca 2280 attaattagt aatataatct attaaaggtc attcaaaagg tcatccaccg gatcaattcc 2340 cctgctcgcg caggctgggt gccaagctct cgggtaacat caaggcccga tccttggagc 2400 ccttgccctc ccgcacgatg atcgtgccgt gatcgaaatc cagatccttg acccgcagtt 2460 gcaaaccctc actgatccgc atgcccgttc catacagaag ctgggcgaac aaacgatgct 2520 cgccttccag aaaaccgagg atgcgaacca cttcatccgg ggtcagcacc accggcaagc 2580 gccgcgacgg ccgaggtctt ccgatctcct gaagccaggg cagatccgtg cacagcacct 2640 tgccgtagaa gaacagcaag gccgccaatg cctgacgatg cgtggagacc gaaaccttgc 2700 gctcgttcgc cagccaggac agaaatgcct cgacttcgct gctgcccaag gttgccgggt 2760 gacgcacacc gtggaaacgg atgaaggcac gaacccagtg gacataagcc tgttcggttc 2820 gtaagctgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg gtccagaacc ttgaccgaac 2880 gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg 2940 tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga 3000 tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca 3060 tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca 3120 tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg 3180 gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg 3240 aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga 3300 gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc 3360 gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag 3420 gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag 3480 aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac 3540 aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg 3600 ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg 3660 gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt 3720 atcagcccgt catacttgaa gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg 3780 cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg 3840 tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg ccgcttcgcg gcgcggctta 3900 actcaagcgt tagatgcact aagcacataa ttgctcacag ccaaactatc aggtcaagtc 3960 tgcttttatt atttttaagc gtgcataata agccctacac aaattgggag atatatcatg 4020 aaaggctggc tttttcttgt tatcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta 4080 aaatctagcg agggctttac taagctgatc cggtggatga ccttttgaat gacctttaat 4140 agattatatt actaattaat tggggaccct agaggtcccc ttttttattt taaaaatttt 4200 ttcacaaaac ggtttacaag catacgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 4260 tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 4320 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagt 4380 gccaataccc gtgaaatctc gctggagcgg gcgctgcttt ataccgccag ccatcggcaa 4440 accgaaggcg aaccggtgat attgcgccgg gcgaaagcaa cagcgtatat ccttgaacat 4500 gttgaaattt cgattcgtga tgaagaactg attgccggta accgcaccgt aaaaccgcgc 4560 gccgggatta tgtcgccgga aatggaccct tactggctgc tgaaagagct ggatcaattc 4620 ccgacgcgtc cgcaggaccg ctttgctatc agcgaagaag ataaacgtat ctaccgcgaa 4680 gagttgttcc cgtactggga aaaacgttcg atgaaagatt tcatcaacgg gcagatgaca 4740 gatgaagtaa aagccgcgac cagcacgcag attttcagca tcaaccagac agataaaggc 4800 caggggcaca ttattattga ttacccacgc ctgctgaatc acgggctggg ggagctggta 4860 gcacagatgc agcaacattg tcagcaacag ccggagaatc acttttatca ggcagcgctg 4920 ttactgctgg aagcctcgca gaaacacatt ttgcgttacg ccgaactggc ggaaacgatg 4980 gcggcaaact gcacagatgc ccagcgtcgc gaagagctgc tgactattgc ggagatctcc 5040 cgccataacg cgcaacataa gccgcagacg ttctggcagg cgtgccagtt attctggtac 5100 atgaacatca ttctgcaata cgaatccaac gccagttcgc tatcgttggg gcgcttcgac 5160 cagtatatgt tgccgttcta tcagacatca ttaacccagg gcgaagatgc ggcgttcctg 5220 aaagaactgc tcgaatcttt atgggtgaaa tgcaacgaca tcgtgctgtt gcgctccacc 5280 agcagcgcgc gttatttcgc cggtttcccg accggctata ccgcactgct cggcgggtta 5340 accgagaacg gacgtagcgc ggtgaacgtg ctttcgttcc tttgccttga cgcctatcaa 5400 agcgtgcaat taccgcaacc gaacctcggc gtgcgcacta acgccttgat cgacacgccg 5460 ttcctgatga aaaccgccga aaccattcgc ctcggcaccg gtattccgca aatctttaac 5520 gatgaagtgg tggtgccagc gttcctcaac cgtggcgttt cgctggaaga tgcgcgcgac 5580 tattccgtag tgggctgtgt ggaattatct attcccggca gaacctacgg cttgcatgac 5640 atcgcgatgt ttaacctgct gaaagtgatg gaaatctgcc tgcatgaaaa tgaaggcaat 5700 gccgcgctga cttatgaagg tttactggaa cagatccgtg ccaagatcag ccactacatc 5760 accctgatgg ttgaaggcag taatatttgc gatatcggcc atcgcgactg ggcacctgta 5820 ccgctgctct cgtcttttat cagcgattgt ctggaaaaag gccgcgatat taccgatggc 5880 ggcgcgcgtt ataacttctc cggcgtacag gggatcggta tcgccaacct gagcgattct 5940 ctccatgcgt tgaaagggat ggtttttgat caacagcgtt taagttttga cgaattgctg 6000 tcggtattaa aagccaactt tgcaacgcca gaaggcgaaa aagtccgcgc tcgcttaatt 6060 aaccgctttg agaaatacgg taacgatatc gacgaggtgg ataacattag cgccgaactg 6120 ttgcgccact actgcaaaga agtggaaaaa taccagaacc cgcgcggcgg ctacttcacg 6180 ccgggatcgt agggcttcaa actttcgccc ctcctggcat tgattcagcc tgtcggaact 6240 ggtatttaac cagactaatt attttgatgc gcgaaattaa tcgttacagg aaaagccaaa 6300 gctgaatcga ttttatgatt tggttcaatt cttcctttag cggcataatg tttaatgacg 6360 tacgaaacgt cagcggtcaa cacccgccag caatggactg tattgcgctc ttcgtgcgtc 6420 gcgtctgtta aaaactggcg ctaacaatac aggctaaagt cgaaccgcca ggctagactt 6480 tagttccaca acactaaacc tataagttgg ggaaatacaa tgttccagca agaagttacc 6540 attaccgctc cgacaatctg ctaatccacg agatgcggcc caatttactg cttaggagaa 6600 gatcatgggt ttgttcgata aactgaaatc tctggtttcc gacgacaaga aggataccgg 6660 aactattgag atcattgctc cgctctctgg cgagatcgtc aatatcgaag acgtgccgga 6720 tgtcgttttt gcggaaaaaa tcgttggtga tggtattgct atcaaaccaa cgggtaacaa 6780 aatggtcgcg ccagtagacg gcaccattgg taaaatcttt gaaaccaacc acgcattctc 6840 tatcgaatct gatagcggcg ttgaactgtt cgtccacttc ggtatcgaca ccgttgaact 6900 gaaaggcgaa ggcttcaagc gtattgctga agaaggtcag cgcgtgaaag ttggcgatac 6960 tgtcattgaa tttgatctgc cgctgctgga agagaaagcc aagtctaccc tgactccggt 7020 tgttatctcc aacatggacg aaatcaaaga actgatcaaa ctgtccggta gcgtaaccgt 7080 gggtgaaacc ccggttatcc gcatcaagaa gtaattcttg ccgcagtgaa aaatggcgcc 7140 catcggcgcc atttttttat gcttccgcca gcggcggcaa aatcaattca tcgctctcat 7200 gctgctgggt gtagcgccct accgtttctg ctcacgttcc gttgggatcg gtggttggcg 7260 cgacgccaga cggtcgtttt gccggagaac agctggcaga cggcggcttg tcacctatgc 7320 tgggtcagga cgcacaaggg ccaacggcgg tactgaagtc agtcagtaag ctcgataaca 7380 cactgctgtc taacggtaca ttgctgaacg tgaaattcac tccggcgacc ctggaaggtg 7440 aagcgggatt acgcaaactg gccgacttct tacgggcgtt tacccagctt aagttacaac 7500 atattcagtt taacgtggtg aacgccgaca cgttgcggga agcgcaacag cgcccacaag 7560 attatgccgg gctggtggtg cgcgttgccg gatacagcgc cttctttgtc gaactgtcga 7620 aggagatcca ggatgacatc atccgccgga cagcgcatca gctgtaacgt tgtggaaacg 7680 cgccgcaatg atgtggcgcg cattttcaac attcagcgtt attcactgaa tgacggtgag 7740 ggcattcgta cggtggtctt ttttaaaggc tgtccgcatc tttgcccgtg gtgtgctaat 7800 ccggagtcga tctccggcaa aatccagacg gtacgcagag aggcgaaatg tctgcactgt 7860 gcgaaatgtt tgcgtgatgc ggatgaatgc ccctccgggg cgtttgaacg gattggtcgc 7920 gatatcagcc ttgacgctct ggaacgggaa gtgatgaaag atgacatttt ttttcgcacg 7980 tccggcggcg gcgtcacgct ttctggcggc gaagtgttaa tgcaggcgga gtttgctacc 8040 cgttttttac agcgactgca gctgtggggt gtctcatgtg ccattgaaac tgccggagac 8100 gcgccagcca gcaagctgtt accgctggcg aaattgtgcg atgaagtgtt gttcgattta 8160 aaaatcatgg acgcgactca ggcgcgggat gtggtgaaga tgaacctgcc acgcgtgctg 8220 gagaatctgc gtttgctggt gagtgagggc gtcaacgtga tcccgcgttt accgctgatc 8280 cctggtttca cgctcagccg ggagaatatg cagcaggcgc tggatgtgct gatcccgctg 8340 aatatcaggc agatccatct gttaccgttt catcagtacg gcgaaccgaa ataccgcctg 8400 ctggggaaaa catggtcgat gaaagaggtg cctgcgccgt cgtcagccga tgtggcaacg 8460 atgcgcgaaa tggcagaacg ggccggattt caggttaccg tgggaggtta aaatggcata 8520 cctggtggca gtaaccgcct gcgtcagtgg cgtggcgcat acttatatgg cggcggaacg 8580 gctggaaaag ttgtgcctgt tagagaagtg gggagtcagc attgaaactc agggcgctcg 8640 aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 8700 aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 8760 gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt 8820 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc 8880 tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgaattc 8937 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer BY124 for amplifying and cloning teh pflDC geen of Escherichia coli C, or cassettes embedded in pflD, together with BY125. <400> 9 tgccaatacc cgtgaaatct cgc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer BY125 for amplifying and cloning the pflDC genes of E. coli C, or cassettes embedded in pflD, together with BY124. <400> 10 cgccctgagt ttcaatgctg act 23 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AC74 for amplifying and clonig the tdcC-tdcG region of E. coli C and derivatives or cassettes embedded in teh tdcC-tdcG region,together with AC75. <400> 11 tgagctacct ggtatggccg tttatc 26 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer Ac75 for amplifying and cloning the tdcC-tdcG region of E. coli C and derivatives, or cassettes embedded in teh tdcC-tdcG region, together with AC74. <400> 12 cccgccgccg acagagtaat ag 22

Claims (33)

  1. 30 g/l 이상의 석신산을 생성하는 대장균(Escherichia coli) 박테리아로서,
    상기 석신산의 생합성 중간체는 포스포엔올피루베이트이고,
    상기 대장균(Escherichia coli) 박테리아는
    당의 촉진 확산에서 작용하는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 유전자로서, 상기 외인성 유전자는 glf 유전자, glk 유전자 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 외인성 유전자;
    당 이입을 위해 포스포트랜스퍼라제 시스템에서 작용하는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이 또는 결실로서, 상기 하나 이상의 유전자는 ptsH 유전자, ptsI 유전자 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자의 돌연변이 또는 결실; 및
    탄소 이화물 억제(carbon catabolite repression)에서 작용하는 Crr 단백질을 인코딩하는 crr 유전자의 적어도 하나의 추가 복제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장균 박테리아.
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  11. 제 1항에 있어서, 양성자 공동수송(proton symport)을 이용하여 작용하는 당 이입자를 인코딩하는 galP 유전자의 결실을 더 포함하는, 대장균 박테리아.
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  16. 제 1항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 복제 플라스미드에 함유되는 것을 특징으로 하는, 대장균 박테리아.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 외인성 유전자는 숙주 염색체에 통합되는 것을 특징으로 하는, 대장균 박테리아.
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  28. 석신산의 제조방법으로서,
    최소 발효 배지에서 제 1항의 대장균(Escherichia coli) 박테리아를 성장시켜 석신산을 생성하는 단계; 및
    발효 배지로부터 상기 석신산을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 대장균 박테리아는 48시간 내에 적어도 60 g/l의 석신산 및 4.2 g/l 미만의 아세테이트를 생성하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 대장균 박테리아의 성장은 공기의 공급 속도가 분당 액체 배양물의 부피당 0.1 부피 미만인 미량호기성 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 제 1항에 있어서, 상기 glf 유전자를 인코딩하는 mRNA의 5' 번역되지 않은 리더 영역(leader region)은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장균 박테리아.
  32. 삭제
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